生物鐘對(duì)哺乳動(dòng)物生理代謝、繁殖和腸道菌群影響的研究進(jìn)展

馬 驍，馬 慧，李錫智，張 魯，劉國世*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193；2.北京首農(nóng)畜牧發(fā)展有限公司，北京 100076）

生命已經(jīng)適應(yīng)了由地球自轉(zhuǎn)所控制的能量周期，通過進(jìn)化分子機(jī)制來預(yù)測(cè)一天中生命活動(dòng)最有利的時(shí)間。因此，大多數(shù)生物功能表現(xiàn)為日常節(jié)律。在人類和大多數(shù)哺乳動(dòng)物體內(nèi)，這些晝夜振蕩是由稱為生物鐘的自我調(diào)節(jié)性轉(zhuǎn)錄和翻譯反饋回路引起的。生物鐘不僅能夠調(diào)節(jié)睡眠、飲食，還調(diào)控著激素、體溫、血壓以及其他生理生化指標(biāo)的節(jié)律性周期變化。從生物節(jié)律的角度探究生物鐘對(duì)宿主能量代謝、繁殖性能和腸道菌群的影響，可以為研究哺乳動(dòng)物繁殖障礙性疾病、代謝性疾病、免疫性疾病、退行性疾病等提供新的思路。本文重點(diǎn)論述了生物鐘和新陳代謝之間的相互關(guān)系、生物鐘通過褪黑素介導(dǎo)下丘腦-垂體-性腺軸影響動(dòng)物的繁殖性能，以及腸道菌群的穩(wěn)態(tài)。

1 生物鐘系統(tǒng)

生物鐘又稱生理鐘，是生物體生命活動(dòng)的內(nèi)在節(jié)律，由生物機(jī)體內(nèi)的時(shí)間結(jié)構(gòu)序所決定。哺乳動(dòng)物下丘腦中的視交叉神經(jīng)上核（Suprachiasmatic Nucleus，SCN）是整個(gè)機(jī)體的核心生物鐘系統(tǒng)，在機(jī)體水平上起著中樞起搏器的作用。目前研究普遍表明，SCN 起到同步外周組織的生物鐘系統(tǒng)的作用[1]。SCN 神經(jīng)元通過視網(wǎng)膜下丘腦束接受來自于視網(wǎng)膜內(nèi)表達(dá)特殊黑視素的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的光信息，感知外界環(huán)境的晝夜變化，并使其生物鐘的相位與光的相位同步。體外移植的SCN能夠在許多天內(nèi)維持明顯的晝夜節(jié)律，而外周組織雖然在移植時(shí)具有節(jié)律性，但節(jié)律性較差，持續(xù)時(shí)間較短。這表明，外周組織的生物鐘需要持續(xù)的引導(dǎo)才能保持同步。此外，當(dāng)SCN 被去除后，大部分體外培養(yǎng)的組織或細(xì)胞中相關(guān)基因的表達(dá)仍呈現(xiàn)出節(jié)律性。這就進(jìn)一步說明，SCN 的作用是引導(dǎo)外周組織細(xì)胞的節(jié)律，使其呈現(xiàn)同步化，但并不產(chǎn)生節(jié)律[2]。光照的變化影響SCN 自由性節(jié)律振蕩，SCN 進(jìn)而調(diào)控機(jī)體的行為及代謝的節(jié)律性振蕩，該過程分為輸入信號(hào)的變化（Input）、核心生物鐘系統(tǒng)的節(jié)律性振蕩（Oscillator）、機(jī)體的輸出機(jī)制（Output）[3]3 個(gè)步驟。

2 生物鐘系統(tǒng)的分子機(jī)制

在分子水平上，轉(zhuǎn)錄因子腦和肌肉ARNT 樣蛋白1（Brain And Mascle ARNT Like Protein 1，BMAL1）和CLOCK 蛋白或NPAS2（Neuronal PAS Domain Protein 2）蛋白在晝夜節(jié)律早期發(fā)生異源二聚，與基因啟動(dòng)子的E-box 元件結(jié)合，誘導(dǎo)下游基因轉(zhuǎn)錄。PER基因和CRY基因通過編碼BMAL1:CLOCK/NPAS2 的抑制因子誘導(dǎo)下游基因轉(zhuǎn)錄。在晝夜節(jié)律的夜晚，PER 和CRY 轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，形成大的復(fù)合體。這抑制BMAL1:CLOCK/NPAS2 的轉(zhuǎn)錄活性，從而下調(diào)了它們自身的表達(dá)。PER和CRY 蛋白的降解能夠解除轉(zhuǎn)錄抑制，使得1 個(gè)周期約為24 h 的轉(zhuǎn)錄周期重新開始[4]。

REV-ERB 又稱核受體亞家族1，D 組（Nr1d）和RAR 相關(guān)孤獨(dú)受體（ROR），編碼核受體REV-ERB 和ROR[5]。REV-ERBs 抑制RORs 并 可以激活BMAL1 的轉(zhuǎn)錄[6]，產(chǎn)生BMAL1 mRNA 的節(jié)律性振蕩。BMAL1在調(diào)控元件中的節(jié)律性結(jié)合：CLOCK/NPAS2 和REVERB/ROR 分別結(jié)合在E-box 和REV-ERB/ROR 序列上，在涉及許多不同功能的特定細(xì)胞或組織中，驅(qū)動(dòng)大量基因有節(jié)奏地表達(dá)[7]。轉(zhuǎn)錄反饋回路的功能和時(shí)間依賴于翻譯后調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子穩(wěn)定和降解的修飾過程[8]。這種分子水平的節(jié)律性振蕩幾乎存在于哺乳動(dòng)物的所有細(xì)胞和組織中，基因的節(jié)律性表達(dá)最終產(chǎn)生與生理功能相關(guān)的節(jié)律性行為[9]。

3 生物鐘與哺乳動(dòng)物生理代謝

3.1 生物鐘與松果體 在脊椎動(dòng)物的進(jìn)化過程中，松果體由最低級(jí)脊椎動(dòng)物的感光器官[10]進(jìn)化到低級(jí)脊椎動(dòng)物的感光內(nèi)分泌器官[11]，最終進(jìn)化到哺乳動(dòng)物的神經(jīng)內(nèi)分泌器官[12]。在下丘腦神經(jīng)SCN 主生物鐘的調(diào)控下，哺乳動(dòng)物松果體合成并分泌褪黑素。褪黑素作為機(jī)體生物鐘的重要調(diào)控因子，具有維持機(jī)體節(jié)律與環(huán)境周期同步的作用。下丘腦中SCN 含有大量的褪黑素受體。哺乳動(dòng)物體內(nèi)褪黑素的分泌一般在夜晚呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，并且在凌晨02:00—04:00 達(dá)到峰值。若SCN 受到外界環(huán)境的干預(yù)，抑制褪黑素的合成分泌，引發(fā)節(jié)律相關(guān)基因的失調(diào)，則會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物體內(nèi)內(nèi)源性褪黑素的分泌不足，進(jìn)而引發(fā)機(jī)體各組織器官功能性衰退。這與免疫性疾病、神經(jīng)退行性疾病以及繁殖障礙等發(fā)生有關(guān)。Weissová 等[13]研究表明，外源補(bǔ)充褪黑素可以改善由衰老引起的機(jī)體節(jié)律紊亂。

3.2 生物鐘與代謝酶基因 細(xì)胞的增殖、分化、衰老、凋亡等是生命活動(dòng)最基本的過程，在各個(gè)細(xì)胞周期的代謝過程中都呈現(xiàn)出精準(zhǔn)、有序、高度協(xié)調(diào)的特征。生物鐘相關(guān)基因通過調(diào)節(jié)編碼代謝酶的節(jié)律性表達(dá)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝。

BMAL1 直接靶向編碼限速酶的基因，如作用于糖異生過程中的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（PEPCK）[14]。鏈脂肪酸延伸酶6（Elovl6）作用于脂肪酸合成以及甘油三酯水解酶介導(dǎo)的甘油三酯分解[14]。CLOCK 控制其他轉(zhuǎn)錄因子的節(jié)律性表達(dá)或節(jié)律性活動(dòng)，從而給新陳代謝相關(guān)基因的表達(dá)施加了節(jié)律[15]。例如，受BMAL1:CLOCK 控制的轉(zhuǎn)錄因子DBP、TEF、HLF，通過對(duì)核構(gòu)成雄甾烷受體的控制調(diào)異生物質(zhì)代謝的節(jié)律[16]。REV-ERBa 通過直接與DNA 結(jié)合或與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用間接控制轉(zhuǎn)錄。抑制生物鐘基因轉(zhuǎn)錄需要REV-ERBa 的DNA 結(jié)合域，而脂質(zhì)代謝基因的轉(zhuǎn)錄需獨(dú)立于DNA 結(jié)合域，并且涉及REV-ERBa 通過其他轉(zhuǎn)錄因子與DNA 的結(jié)合過程。此外，REV-ERBa 控制許多代謝因子的晝夜節(jié)律性轉(zhuǎn)錄。例如，REV-ERBa 影響Insig2 的晝夜轉(zhuǎn)錄。REV-ERBα指示組蛋白去乙?；?（HDAC3）的基因組招募，以指導(dǎo)組蛋白乙?；臅円构?jié)律和脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)[16]。Insig2 編碼一種跨膜蛋白，將SREBP 蛋白隔離到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，從而控制膽固醇和脂質(zhì)代謝[16]。PER2 直接與過氧化物酶增生物激活受體α（PPARα）有節(jié)律地相互作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)編碼葡萄糖6 磷酸酶的靶基因G6pc[17]。PER2 同時(shí)通過阻斷過氧化物酶增殖因子激活受體（PPARγ）靶向啟動(dòng)子的募集促進(jìn)脂肪生成[18]。CRYs 通過與糖皮質(zhì)激素競(jìng)爭PEPCK1 啟動(dòng)子中的糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件來調(diào)節(jié)能量底物向葡萄糖的轉(zhuǎn)化[19]。時(shí)間節(jié)律還與染色質(zhì)修飾因子相互作用，實(shí)現(xiàn)表達(dá)的周期性激活和抑制。

3.3 生物鐘與線粒體活動(dòng) 生物鐘通過調(diào)節(jié)線粒體分裂、線粒體自噬等線粒體活動(dòng)以及生物發(fā)生來維持生物能量需求增加時(shí)的呼吸過程。煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（NAMPT）是一種催化NAD 合成中的限速酶。生物鐘通過控制NAMPT 的節(jié)律來控制NAD 的補(bǔ)救合成途徑[20]。NAD 生物合成中的生物鐘節(jié)律驅(qū)動(dòng)NAD+依賴組蛋白去乙酰酶（SIRTs）的震蕩。因此，生物鐘通過控制細(xì)胞能量狀態(tài)的振蕩來協(xié)調(diào)SIRT 驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞生理狀態(tài)。線粒體SIRT3 的節(jié)律性活動(dòng)可以引發(fā)線粒體氧化磷酸化的節(jié)律活動(dòng)[21]。反之細(xì)胞的NAD+/NADH 氧化還原狀態(tài)影響B(tài)MAL1:CLOCK 的轉(zhuǎn)錄活性[22]。SIRT1結(jié)合BMAL1:CLOCK基因的表達(dá)通過節(jié)律的方式促進(jìn)CLOCK 蛋白質(zhì)和組蛋白的脫乙酰作用，從而在氧化還原狀態(tài)和生物鐘之間建立一個(gè)反饋回路[23]。SIRT6 與BMAL1 的染色質(zhì)招募相互作用：時(shí)間可以調(diào)節(jié)與節(jié)律相關(guān)的一系列基因，這些基因分別受到SIRT1基因的調(diào)控[24]。SIRT6 通過調(diào)控代謝轉(zhuǎn)錄因子的固醇反應(yīng)原件結(jié)合蛋白（SREBP1）的染色質(zhì)招募來調(diào)控脂肪酸的晝夜代謝[24]。

4 生物鐘與繁殖

哺乳動(dòng)物受孕及生產(chǎn)的成功由一系列關(guān)系緊密的生理活動(dòng)共同協(xié)調(diào)完成。下丘腦-垂體-性腺軸（Hypothalamic-Pituitary-Gonadal Axis，HPGA）主要起到調(diào)控哺乳動(dòng)物的繁殖功能的作用。卵巢中卵泡發(fā)育的晚期，血漿中雌二醇（E2）濃度上升，促黃體素（LH）濃度也到達(dá)峰值。在卵泡發(fā)育到達(dá)成熟排卵前期E2對(duì)GnRH 的分泌抑制解除，促使GnRH 從下丘腦POMA區(qū)域釋放，促使垂體前葉中LH 的釋放，最終促進(jìn)卵母細(xì)胞從卵泡中排出。

褪黑素作為生物鐘重要的調(diào)節(jié)因子，誘導(dǎo)機(jī)體的自然睡眠，克服睡眠障礙，提高睡眠質(zhì)量，起到調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律的作用；同時(shí)作為一種重要的生殖激素，也在動(dòng)物性成熟、卵泡發(fā)育、排卵、黃體生成、妊娠和分娩等過程發(fā)揮著重要的作用。研究表明，卵巢局部褪黑素自分泌信號(hào)參與排卵的調(diào)控[25]。并且在早期胚胎發(fā)育過程中，褪黑素可以通過MT1 受體促進(jìn)胚胎的發(fā)育[25]。此外，在胚胎附植過程中，褪黑素可以通過MT2 受體促進(jìn)子宮接受態(tài)的形成[25]。研究表明，穩(wěn)定變化的光周期通過褪黑素調(diào)控繁殖相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)的變化，如Kisspeptin[26]。同時(shí)光周期又通過褪黑素介導(dǎo)調(diào)控GnRH 神經(jīng)元的周期性變化，進(jìn)而調(diào)控繁殖相關(guān)生理功能的發(fā)展和發(fā)生。

最新研究表明，哺乳動(dòng)物的繁殖性能受到內(nèi)源性生物鐘的調(diào)控，即繁殖性能相關(guān)基因的表達(dá)呈現(xiàn)出節(jié)律性。下丘腦SCN 為哺乳動(dòng)物的節(jié)律中樞，它與外界的光周期信號(hào)相互配合，通過褪黑素引發(fā)下丘腦繁殖相關(guān)基因的節(jié)律性表達(dá)[5]。晝夜節(jié)律的變化不僅通過調(diào)控繁殖基因的節(jié)律性表達(dá)影響動(dòng)物的繁殖性能，還可以通過影響繁殖相關(guān)激素的分泌來調(diào)控動(dòng)物的繁殖機(jī)能。晝夜節(jié)律可以影響大鼠、摩拉奶牛、蒙古綿羊等哺乳動(dòng)物的性激素的分泌和性成熟[27]。Hacker 等[28]發(fā)現(xiàn)，延長光照可以促進(jìn)后備母豬的性成熟，同時(shí)縮短初情期日齡。

在哺乳動(dòng)物中，SCN 的損傷會(huì)導(dǎo)致發(fā)情周期的喪失。在大鼠發(fā)情前期的下午，使用巴比妥類藥物阻斷對(duì)其腹外側(cè)和背內(nèi)側(cè)的SCN 通訊信號(hào)，會(huì)導(dǎo)致GnRH 的釋放延遲24 h[29]。生物鐘基因的突變或缺失會(huì)造成雌雄動(dòng)物的繁殖障礙。生物鐘基因CLOCK 突變的小鼠外周組織節(jié)律出現(xiàn)紊亂，發(fā)情周期也出現(xiàn)紊亂，同時(shí)施加持續(xù)性的黑暗條件會(huì)加劇這種節(jié)律性的紊亂[30]。PER1 和PER2 敲除鼠隨著年齡的增長也出現(xiàn)發(fā)情周期紊亂的現(xiàn)象。生物鐘基因BMAL1 突變的小鼠出現(xiàn)發(fā)情周期不規(guī)律和排卵障礙的現(xiàn)象，雖然有個(gè)別小鼠可以完成排卵過程，但是不能形成正常的黃體[30]。

5 生物鐘與腸道菌群

腸道是微生物在動(dòng)物體內(nèi)定植的主要位置，其中在人體腸道中定植的菌群數(shù)量就高達(dá)1 014 個(gè)，可以構(gòu)成108 種屬，總重量可以達(dá)到約1.5 kg，這些數(shù)量龐大、組成復(fù)雜的微生物共同組成腸道群。

近年來，越來越多的研究證明腸道菌群與宿主健康存在必然的聯(lián)系。腸道菌群利用宿主動(dòng)物代謝產(chǎn)物得以存活；同時(shí)，動(dòng)物機(jī)體可以吸收菌群代謝產(chǎn)生的營養(yǎng)物質(zhì)。腸道菌群可以直接或間接參與三大營養(yǎng)物質(zhì)的代謝，例如參與微生物合成，影響脂肪的吸收、合成和分布等[31]。單胃動(dòng)物盲腸菌群可以產(chǎn)生有機(jī)酸，提高蛋白質(zhì)和能量的利用率[32]。腸道菌群通過作用于宿主免疫系統(tǒng)增強(qiáng)癌癥等免疫性疾病的治療效果[33]。反之，腸道菌群結(jié)構(gòu)的失調(diào)會(huì)直接導(dǎo)致疾病的發(fā)生。腸道菌群紊亂會(huì)產(chǎn)生許多趨化因子和炎癥因子，它們會(huì)通過各種途徑進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，影響中樞神經(jīng)元的功能[34]，如抑郁癥、焦慮癥、自閉癥、阿爾茨海默病、帕金森等神經(jīng)性疾病都證實(shí)與腸道菌群結(jié)構(gòu)的紊亂有關(guān)[35]。研究證實(shí)肥胖表型與腸道菌群紊亂具有直接關(guān)聯(lián)性。腸道菌群中厚壁菌門與擬桿菌門的豐度比例則與宿主的肥胖或糖尿病等有著密切的聯(lián)系[36]。研究發(fā)現(xiàn)，肥胖小鼠體內(nèi)厚壁菌門的豐度有所增加，擬桿菌門的豐度則降低，并且腸道菌群的多樣性較正常對(duì)照組的小鼠也呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)[36]。腸道菌群可以分解人體無法消化的植物性多糖，生成短鏈脂肪酸，參與到宿主的能量代謝過程中[37]。與此同時(shí)，腸道菌群之間也存在互作，例如，埃希氏桿菌屬（Escherichia）提供90%以上的蛋白FimA（COG3539）和PapC（COG3188）來參與菌毛的裝配，與其他菌屬形成合作共生[38]。

盡管人們一定程度上對(duì)晝夜節(jié)律失調(diào)導(dǎo)致繁殖障礙的機(jī)制尚不清楚，但腸道菌群的變化是對(duì)繁殖生理變化的一種反應(yīng)。例如，妊娠糖尿?。℅DM）的患病率居高不下且呈現(xiàn)逐年增加的趨勢(shì)，嚴(yán)重影響產(chǎn)婦和新生兒的健康，這是一種與繁殖和代謝等密切相關(guān)的疾病。研究證實(shí)，腸道菌群在妊娠糖尿病的發(fā)展過程中有著不同程度的影響[39]。與腸道微生物相關(guān)的多項(xiàng)研究表明，相對(duì)豐度大約為15% 的細(xì)菌存在節(jié)律性振蕩現(xiàn)象，這占據(jù)了腸道菌群種類的60%[40]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，不同妊娠時(shí)期的腸道菌群有著顯著的變化，這可能與妊娠期的代謝功能變化和免疫系統(tǒng)的反應(yīng)有著直接的聯(lián)系[41]。妊娠后期較妊娠前期Proteobacteria和Actinbacteria的豐度顯著升高，并且伴隨著能量損失和炎癥反應(yīng)的發(fā)生[41]。腸道微生物中至少有一種，即產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes），在與人體腸道分離培養(yǎng)后，還可以繼續(xù)表現(xiàn)晝夜節(jié)律[40]。作為重要的生物鐘調(diào)節(jié)因子和生殖激素——褪黑素可以改變腸道微生物的組成，例如，降低厚壁菌門與擬桿菌門的比例。褪黑素通過宿主腸道微生物影響腸毒素大腸桿菌在宿主腸道中的定植。同時(shí)褪黑素還通過作用于腸道微生物直接影響宿主體重的增加以及胃腸道的形態(tài)結(jié)構(gòu)[42]。反之，腸道微生物自身可產(chǎn)生短鏈脂肪酸（如乙酸、丙酸、丁酸等），以及兒茶酚胺類、五羥色胺、褪黑素等信號(hào)因子調(diào)節(jié)宿主腸道內(nèi)分泌，作用于神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)，與宿主形成互作[43]。

6 展 望

繁殖機(jī)能的變化伴隨著腸道菌群穩(wěn)態(tài)的變化。人們需針對(duì)晝夜節(jié)律失調(diào)與代謝綜合征之間的相互作用機(jī)理做更深一步的研究。進(jìn)而把調(diào)控機(jī)體生物鐘作為一種疾病治療方式，這樣具有“增強(qiáng)節(jié)律”作用的有機(jī)化合物，或許可以成為研究哺乳動(dòng)物繁殖障礙性疾病、糖尿病和肥胖等代謝性疾病、菌群失調(diào)導(dǎo)致的免疫性疾病、衰老相關(guān)的退行性疾病的新工具。