植物提取物在家畜精液冷凍保存中的研究與應(yīng)用進(jìn)展

張美娜，郭富強(qiáng)，王瑞軍*，李金泉,2*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.農(nóng)業(yè)部肉羊遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古自治區(qū)動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古自治區(qū)山羊遺傳育種工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古金萊牧業(yè)科技有限責(zé)任公司，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

精液冷凍保存過(guò)程中，由于精子膜中的多不飽和脂肪酸會(huì)產(chǎn)生較多的活性氧，促使精漿中的抗氧化劑與促氧化劑之間的平衡被破壞，氧自由基濃度增加，引起精子的氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成精子活力下降、細(xì)胞膜和DNA 完整性受損，使精子授精能力降低，母畜受胎率減少。精液冷凍保存過(guò)程中，主要受溫度變化、細(xì)胞內(nèi)外冰晶的形成和活性氧含量的影響。這些因素會(huì)改變精子細(xì)胞膜的通透性、改變蛋白的遷移速度，改變水和糖以及電解質(zhì)的滲透性等[1]。精子在冷凍保存過(guò)程中形成的冰晶會(huì)損傷細(xì)胞器和細(xì)胞膜、改變膜結(jié)構(gòu)和膜完整性、改變線粒體膜電位和釋放活性氧?；钚匝跤删哟x產(chǎn)生，是精子成熟、獲能和頂體反應(yīng)所必需的物質(zhì)[2]。正常情況下，精液中產(chǎn)生的活性氧與精漿的抗氧化能力保持相對(duì)平衡的狀態(tài)。活性氧過(guò)量時(shí)，會(huì)與精子膜上的不飽和脂肪酸反應(yīng)，產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化物（LPO），降低精子活力，損傷質(zhì)膜完整性以及降低精子的授精能力。

為減少精液冷凍保存過(guò)程中產(chǎn)生多余的活性氧，在稀釋液中添加抗氧化劑是解決途徑之一。目前在精液冷凍保存稀釋液中添加植物性提取物作為抗氧化劑成為研究的熱點(diǎn)。本文主要從迷迭香提取物、茶多酚、紅景天多糖、葡萄籽原花青素、竹葉黃酮、白藜蘆醇、番茄紅素和槲皮素在動(dòng)物精液冷凍保存上的應(yīng)用與研究進(jìn)行綜述。

1 迷迭香提取物

迷迭香（Rosmarinus Acheinalis L）是一種天然抗氧化劑，產(chǎn)于地中海，在我國(guó)各地都有種植，屬于藥用植物，其葉片與花可以提取抗氧化物質(zhì)。迷迭香提取物中起抗氧化作用的主要成分是肌酸、肌醇和迷迭香酸等[3]，可以清除氧自由基和防止脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。其中迷迭香酸和香豆酸含量較高，而迷迭香酸是咖啡酸和3，4-二羥基苯乳酸酯，具有顯著的抗氧化作用和消炎作用[4]，能夠降低精液冷凍過(guò)程中對(duì)精子膜的損傷。香豆酸的抗氧化性是由于結(jié)構(gòu)式中存在鄰苯二酚，可以防止脂肪酸和甘油三酯發(fā)生氧化反應(yīng)[5]，當(dāng)清除活性氧時(shí)，香豆酸可以產(chǎn)生多種二次抗氧化劑，構(gòu)成有效的防御機(jī)制[6]。由于其抗氧化作用，被用作食品添加劑，改善食品保存時(shí)間[7]。

Daghighkia 等[8]在牛精液冷凍稀釋液中加入迷迭香提取物與谷胱甘肽，發(fā)現(xiàn)解凍后精子活力與膜完整率有所提高，單獨(dú)添加10 g/L 的迷迭香提取物有助于維持牛精子的總活力和平均路徑速度。迷迭香提取物與谷胱甘肽結(jié)合可能保護(hù)精子細(xì)胞脂質(zhì)、蛋白質(zhì)以及細(xì)胞膜的其他結(jié)構(gòu)化合物，以抵抗低溫的損傷[9]。Malo 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，豬精液冷凍稀釋液中添加迷迭香提取物提高了解凍后精子的質(zhì)量。Borghei-rad 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加迷迭香葉粉能顯著提高精液質(zhì)量和活力。Motlagh 等[12]在含大豆卵磷脂基稀釋液中添加迷迭香提取物，解凍后發(fā)現(xiàn)綿羊精子的質(zhì)量與添加迷迭香提取物的劑量有很大關(guān)系。

2 茶多酚

茶多酚是從茶葉中提取的多酚物質(zhì)，占干茶葉可提取固體物質(zhì)的30%～40%，利用水、乙醇、甲醇和丙醇進(jìn)行提取茶多酚[13]，該物質(zhì)對(duì)活性氧自由基具有一定的保護(hù)作用，是一種有效的抗氧化劑，能提高動(dòng)物精子解凍后的活力與活率。茶多酚具有抗炎、抗突變和抗癌等作用[14]。茶多酚可以通過(guò)直接清除活性氧或螯合金屬離子，間接提高抗氧化酶的活性[15]。多酚類化合物容易被脂質(zhì)雙分子層和各種細(xì)胞膜受體吸收，可以防止冷凍-解凍后精子膜的損傷[16]，因精子膜吸收茶多酚，從而防止自由基誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)影響精子質(zhì)量。

Kitaji 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在豬精液冷凍保存過(guò)程中添加0.01%的茶多酚可以防止解凍后精子膜的損傷，對(duì)豬精子起到一定的保護(hù)作用。Mehdipour 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在含大豆卵磷脂的稀釋液中添加茶多酚可以有效防止綿羊精子細(xì)胞受免氧化應(yīng)激損傷。黃明光等[19]通過(guò)對(duì)豬精液冷凍保存的研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，在稀釋液中添加0.04 g/L 的茶多酚能有效提高精液解凍后質(zhì)量。Parameswari 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在兔子精液冷凍保稀釋液中加入茶多酚后精子活力和形態(tài)較好，且精子DNA 損傷較少。目前，該抗氧化劑大部分用于跟人類有關(guān)的疾病，在動(dòng)物精液冷凍保存中研究較少。

3 紅景天多糖

紅景天（Rhodiola sachalinensis A.Bor）屬于十字花科植物，生長(zhǎng)在海拔1 600～4 000 m，該物質(zhì)中主要的活性成分包括紅景天多糖、山奈酚等[21]。紅景天多糖是從紅景天根中提取出來(lái)的物質(zhì)，該物質(zhì)具有抗氧化、抗炎和DNA 修復(fù)等作用[22]，能有效清除超氧陰離子自由基，防止脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)[23]，因此紅景天多糖作為抗氧化劑在許多研究中得到應(yīng)用，但對(duì)哺乳動(dòng)物精液冷凍保存過(guò)程中產(chǎn)生的抗氧化性能未得到評(píng)價(jià)。

張樹(shù)山等[24]評(píng)估不同濃度的紅景天多糖對(duì)解凍后豬精子質(zhì)量的影響發(fā)現(xiàn)，在精子冷凍稀釋液中添加6 mg/L紅景天多糖解凍后豬精子運(yùn)動(dòng)性有明顯改善，丙二醛含量有顯著變化。席利萌等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在稀釋液中添加紅景天多糖可以顯著提高冷凍后奶山羊精子的質(zhì)量和抗氧化能力。王曉東等[26]發(fā)現(xiàn)，紅景天多糖能顯著降低大鼠肝細(xì)胞中丙二醛含量。Yang 等[27]研究發(fā)現(xiàn)，在豬精液冷凍稀釋液中添加紅景天多糖可降低精子的損傷程度。Zhao 等[28]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在不含甘油的稀釋液中添加紅景天多糖的丙二醛含量降低效果比在含甘油的稀釋液中添加紅景天多糖更明顯。Cao 等[29]在牛精液冷凍保存稀釋液中添加0.06 mg/mL 的紅景天多糖，發(fā)現(xiàn)解凍后精子活力和膜完整率有所提高。

4 葡萄籽原花青素

我國(guó)葡萄產(chǎn)量及種植面積位居世界首位，葡萄在釀酒的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生副產(chǎn)物，葡萄籽便是其一。葡萄籽含有較高的生物類黃酮、維生素C、維生素E 和原花青素等，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化損傷，改善氧化劑和抗氧化劑之間的平衡[30]，這些有效成分可以起到一定的抗氧化作用。葡萄籽原花青素是天然的食品抗氧化劑，該物質(zhì)通常是親水性的多羥基衍生物。原花青素在水果、蔬菜和茶葉以及許多植物（包括葡萄和蘋(píng)果）的種子中含量很高[31]。葡糖籽原花青素已被證明具有廣泛的藥理和生化作用，其主要的作用是抗氧化。葡糖籽原花青素是一種有效的自由基清除劑，比維生素效果要好[32]。

孫艷青等[33]在豬精液冷凍保存稀釋液中添加40 μg/mL的葡萄籽原花青素，發(fā)現(xiàn)解凍后精子活力、頂體完整率、線粒體活性和質(zhì)膜完整性都有所提高。Hassan 等[34]研究大鼠睪丸疾病時(shí)加入葡萄籽原花青素，發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)可以抑制氧化應(yīng)激和內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)對(duì)睪丸功能產(chǎn)生不良影響。通過(guò)分析活性氧的產(chǎn)生、凋亡和線粒體功能障礙，可進(jìn)一步探討葡萄籽原花青素保護(hù)作用的氧化機(jī)制。

5 竹葉黃酮

竹子為多年生禾本科竹亞科植物，主要的抗氧化成分為竹葉黃酮，不同部位的提取物具有不同的抗氧化活性，例如竹葉提取物的抗氧化性要高于竹子莖部提取物[35]。竹葉黃酮是從竹子中提取出來(lái)的生物類黃酮，是一種高效的抗氧化劑，它既可以將脂肪氧化的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)阻斷，又可以與多種金屬離子發(fā)生螯合反應(yīng)[36]。竹葉黃酮的抗自由基活性很強(qiáng)，能清除多種活性氧自由基，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，減少丙二醛的生成[37]。這種抗氧化劑是近幾年被我國(guó)衛(wèi)生部認(rèn)證為新型天然抗氧化劑，已被廣泛用于各種食品添加劑中，但在動(dòng)物精液冷凍保存中應(yīng)用較少。

楊威[38]研究發(fā)現(xiàn)，豬精液冷凍保存稀釋液中加入5 mg/mL 的竹葉黃酮能有效提高解凍后精子的質(zhì)量。丘富安等[39]研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類物質(zhì)能夠顯著提高精子抗氧化能力，使超氧化物歧化酶的活性有所提高，降低丙二醛生成量。

6 白藜蘆醇

白藜蘆醇是一種非黃酮類多酚，比維生素E 和C 具有更強(qiáng)的抗氧化活性，并且毒性較低[40]，主要存在于葡萄中，具有抗氧化、抗癌、抗衰老、抗炎、保護(hù)心臟和神經(jīng)的作用[41]。白藜蘆醇可以抑制精子氧化應(yīng)激反應(yīng)，在動(dòng)物精液冷凍保存過(guò)程中研究較多。目前在動(dòng)物模型中進(jìn)行的研究結(jié)果表明，白藜蘆醇通過(guò)刺激下丘腦-垂體性腺軸促進(jìn)大鼠精子的產(chǎn)生，且不引起副作用[42]。白藜蘆醇對(duì)人和小鼠精子自由基所致的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)和DNA 損傷也有保護(hù)作用，對(duì)動(dòng)物精子產(chǎn)生多余的活性氧有清除作用[43-44]。

Gadani 等[45]研究發(fā)現(xiàn)，在豬精液冷凍保存稀釋液中添加2 mmol/L 的白藜蘆醇可以顯著提高解凍后精子的授精能力。劉程[46]研究發(fā)現(xiàn)，在牛精液冷凍保存稀釋液中添加150 μmol/L 白藜蘆醇可以降低精子膜的損傷和保護(hù)精子DNA 的完整性。Longobardi 等[47]在水牛精液冷凍保存中，添加50 μmol/L 的白藜蘆醇可以降低水牛精子的獲能反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，提高膜的穩(wěn)定性和體外授精能力。Eva 等[48]觀察白藜蘆醇對(duì)牛精子5 個(gè)不同時(shí)期的體外抗病毒、抗炎和抗氧化作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)液中加入5～50 μmol/L 白藜蘆醇可以提高精子活力，防止精子在體外發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。

7 番茄紅素

番茄紅素是番茄中最豐富的類胡蘿卜素，被認(rèn)為是最有效的抗氧化劑。該物質(zhì)在精子細(xì)胞中發(fā)揮抗氧化作用，是將本身所帶電子傳遞給氧自由基，氧自由基與之相結(jié)合，在損傷精子細(xì)胞之前超氧陰離子被中和，進(jìn)而保護(hù)精子細(xì)胞不被損傷[49]。在精液冷凍保存過(guò)程中，能使精子細(xì)胞和組織免受脂質(zhì)過(guò)氧化的有害影響，延長(zhǎng)精子的存活時(shí)間。番茄紅素的作用機(jī)制涉及單重態(tài)分子氧的猝滅和過(guò)氧自由基的捕獲[50]。在精液冷凍稀釋液中添加番茄紅素可以減少丙二醛的生成量，意味著番茄紅素可以降低精子細(xì)胞的氧化作用。

梁作文等[51]報(bào)道，在冷凍稀釋液中添加適當(dāng)濃度的番茄紅素可以降低冷凍-解凍過(guò)程中活性氧對(duì)精子線粒體和精子質(zhì)膜的氧化損傷，提高精子的抗凋亡能力。Peker 等[52]研究發(fā)現(xiàn)，在精子冷凍稀釋液中聯(lián)合添加番茄紅素與半胱胺酸可以提高綿羊精子活力、線粒體活性和氧化應(yīng)激等參數(shù)。Lian 等[53]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在精液冷凍保護(hù)劑中添加適當(dāng)?shù)姆鸭t素可減輕凍融過(guò)程中對(duì)精子線粒體的氧化損傷，減輕活性氧對(duì)精子質(zhì)膜的氧化應(yīng)激損傷，提高精子的抗凋亡能力。

8 榭皮素

榭皮素是一種類黃酮抗氧化劑，能夠有效清除活性氧和羥自由基，使解凍后精子質(zhì)量有所改善[54]。槲皮素是通過(guò)酶和非酶系統(tǒng)抑制活性氧而產(chǎn)生較強(qiáng)的抗氧化性，尤其是NADPH 氧化酶和NADH 還原酶。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)槲皮素可以抑制精子中的糖降解途徑，防止精子磷酸化和提高精子解凍后質(zhì)量[55]。槲皮素具有螯合金屬物質(zhì)和保護(hù)精子DNA 完整性的能力[56]。

有研究報(bào)道，將槲皮素添加在牛、馬、羊、豬精液冷凍保存稀釋液中，解凍后對(duì)精子細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用[57]。Banday 等[58]研究發(fā)現(xiàn)，在羊精液冷凍保存稀釋液中添加槲皮素、?；撬岷瓦€原性谷胱甘肽的效果無(wú)顯著性差異。Avdatek 等[59]研究發(fā)現(xiàn)，在牛精液冷凍保存稀釋液中添加25 μg/mL 榭皮素可對(duì)精子DNA 完整性有積極影響，而對(duì)精子漸進(jìn)運(yùn)動(dòng)沒(méi)有不良影響。Filho 等[60]研究馬精液冷凍保存時(shí)發(fā)現(xiàn)，在稀釋液中添加槲皮素并不能影響精子漸進(jìn)運(yùn)動(dòng)能力、線粒體功能、頂體和質(zhì)膜完整性等。Yoshimoto 等[61]研究發(fā)現(xiàn)，榭皮素能降低精子冷凍保存過(guò)程中線粒體膜電位，從而精子誘導(dǎo)獲能。目前榭皮素的抗氧化性還需要進(jìn)一步研究。

9 小 結(jié)

精液冷凍保存過(guò)程中，由于精子膜中含有不飽和脂肪酸會(huì)產(chǎn)生活性氧，過(guò)多的活性氧會(huì)對(duì)精子造成氧化損傷。在精子冷凍稀釋液中添加一定量的抗氧化劑，可以消除多余的活性氧，延長(zhǎng)精子的存活時(shí)間、提高精子的活率和降低丙二醛含量。植物提取物是從植物中提取的一種高效的抗氧化劑，該物質(zhì)毒性較低，便于取材，主要的抗氧化成分為黃酮類物質(zhì)及其衍生物、酚類物質(zhì)和肌酸類物質(zhì)等，可以有效清除精子代謝產(chǎn)生的活性氧。將植物提取物用于精液冷凍保存，可有效提高解凍后精液品質(zhì)，為精液氧化損傷機(jī)理研究提供一定的理論基礎(chǔ)。目前，植物提取物本身也存在一些問(wèn)題，例如提取過(guò)程中可能會(huì)有農(nóng)藥的殘留，影響后續(xù)試驗(yàn)。另外，受提取溫度的影響，也會(huì)導(dǎo)致一些有效物質(zhì)受熱降解等。植物不同部位的提取物抗氧化性也不同，有效成分含量存在差異。因此，植物提取物的工藝有待不斷完善，進(jìn)而提高植物提取物純度和應(yīng)用的穩(wěn)定性和可靠性。