家畜胚胎克隆關(guān)鍵技術(shù)及應(yīng)用研究

宋雪瑩，佟桂芝，宋 斌，李 平，劉德會，李玉龍，丁麗艷，李同豹

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江 齊齊哈爾 160000）

胚胎克隆是指將供體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至去核受體細(xì)胞中，獲得重構(gòu)胚胎的過程。核移植技術(shù)根據(jù)供體和受體細(xì)胞的來源，分為胚胎移植和體細(xì)胞核移植；根據(jù)是否在同一物種間進(jìn)行，分為同種間核移植和異種間核移植。1938年，H.Spemann等［1］為證明分化細(xì)胞是否具有全能性，將胚胎細(xì)胞的細(xì)胞核移植到無核的卵母細(xì)胞中，但由于技術(shù)手段不夠成熟并沒有成功。這也是關(guān)于胚胎核移植技術(shù)的最早期研究。1999年，A.Baguisi等［2］將綿羊卵母細(xì)胞去核，只留下細(xì)胞質(zhì)，再將體細(xì)胞的細(xì)胞核移植到去核的卵母細(xì)胞中，并在滅活病毒或電刺激下介導(dǎo)二者融合，最后將發(fā)育到囊胚期的重構(gòu)胚移植到受體雌性動物子宮中，得到了3只克隆綿羊，這標(biāo)志著世界上第一例利用體細(xì)胞核移植克隆哺乳動物的誕生。2008年，C.S.Rogers等［3］通過基因打靶和SCNT結(jié)合成功獲得第一個疾病模型克隆豬。異種間核移植是指核供體細(xì)胞和核受體細(xì)胞來源于不同物種之間。目前，異種間核移植在魚類屬間和哺乳動物種間成功應(yīng)用。

1 胚胎克隆關(guān)鍵技術(shù)

1.1 核供體細(xì)胞的選擇

目前，可用作供體的細(xì)胞包括乳腺細(xì)胞、胎兒的細(xì)胞、胚胎細(xì)胞［4］、卵丘細(xì)胞［5］、成纖維細(xì)胞［6］、成年公鼠尾尖細(xì)胞［7］、睪丸支持細(xì)胞［8］、胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、肌肉細(xì)胞［9］。研究發(fā)現(xiàn)，將卵丘細(xì)胞作為供體核，胚胎囊胚率最高。E.Lee等［10］將成年豬成纖維和胎兒成纖維細(xì)胞作為供體核，發(fā)現(xiàn)胎兒成纖維細(xì)胞作為供體核獲得的克隆胚胎發(fā)育更好。除此之外，干細(xì)胞作為供體核在轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)過程中由于基因打靶效率高、表達(dá)穩(wěn)定等優(yōu)點，成為動物克隆胚胎首選的細(xì)胞，但胚胎干細(xì)胞分裂較為困難［11］。目前小鼠成為較成熟的分離出干細(xì)胞的試驗動物。綜上，作為供體的細(xì)胞分化程度越低，重構(gòu)胚胎的細(xì)胞核編碼能力就越強，成活率越高。

作為核供體一般選擇G0／G1期細(xì)胞，在重新構(gòu)建胚胎時較穩(wěn)定，易獲得成活率較高的個體。常用營養(yǎng)饑餓法、低溫處理法和DNA合成阻斷法進(jìn)行誘導(dǎo)。

1.2 受體卵母細(xì)胞的選擇

受體卵母細(xì)胞的選擇直接關(guān)系著重構(gòu)胚胎的發(fā)育，其中卵母細(xì)胞來源是主要影響因素之一，一般選擇經(jīng)產(chǎn)雌性動物，其體內(nèi)有成熟的卵母細(xì)胞。一般選擇MⅡ期卵母細(xì)胞，該時期的細(xì)胞成熟促進(jìn)因子具有較強活性。選擇健康狀況良好、無畸形、發(fā)情規(guī)律、2～4胎、發(fā)情時間在克隆胚胎激活之后0～36 h的經(jīng)產(chǎn)母豬作為胚胎移植受體［12］。

1.3 受體卵母細(xì)胞去核

受體卵母細(xì)胞的去核是細(xì)胞克隆的關(guān)鍵技術(shù)之一。目的是去除受體細(xì)胞原來的核遺傳物質(zhì)，以表達(dá)重構(gòu)胚胎的遺傳物質(zhì)。如去核不完全可導(dǎo)致重構(gòu)胚胎染色體異常、發(fā)育受阻甚至死胎；如去核過多，則會影響核移植后有效的細(xì)胞核重新編程。

受體卵母細(xì)胞的常用去核方法包括以下幾種：1）盲吸去核法。指以第一極體（PB1）為參考，利用去核針吸取其附近20%左右的胞質(zhì)去除細(xì)胞核。該方法由于操作簡單方便，是現(xiàn)在大多數(shù)實驗室在體細(xì)胞核移植中普遍采用的。但由于物種間的差異或卵齡狀況的不同，PB1與細(xì)胞核的相對位置可能會存在改變，因此，該方法去核可能會不徹底，從而影響克隆效率。

2）熒光染料法。此法是利用熒光染料與細(xì)胞核DNA嵌合后，在紫外燈下去除可見的細(xì)胞核。此法位置準(zhǔn)確，細(xì)胞核去除效率高；但紫外燈長時間照射易損傷受體細(xì)胞，對操作者試驗操作能力要求較高。

3）化學(xué)誘導(dǎo)去核法。是指通過脫羧秋水仙堿處理細(xì)胞導(dǎo)致核質(zhì)均進(jìn)入第二極體（PB2）以去除細(xì)胞核。此法操作簡便，避免了人為操作的不穩(wěn)定性和低重復(fù)性，是一種較為有效的去核方法。

4）末期去核法。指直接去除PB2及其下方的少量胞質(zhì)以達(dá)到去核的目的。該方法操作簡單，去核成功率高；但卵母細(xì)胞必須是成熟、質(zhì)量好且被激活的。

5）徒手切割法。此法是將去除透明帶的卵母細(xì)胞在熒光鏡下選擇沒有核物質(zhì)的半卵，與供體細(xì)胞融合后再與另外一個無核物質(zhì)的半卵融合，以獲得重構(gòu)細(xì)胞核。該方法在體細(xì)胞克隆牛、小鼠、豬等動物中得到普遍應(yīng)用。

1.4 重構(gòu)胚胎的融合和激活

重構(gòu)胚胎的融合和激活是關(guān)系子代出生率和成活率的關(guān)鍵步驟，如出現(xiàn)問題則會阻滯胚胎后期發(fā)育。

電融合法指在直流脈沖刺激下，將供核細(xì)胞核注入受體細(xì)胞的透明帶和卵胞質(zhì)膜之間，重新構(gòu)建胚胎并完成重新編程，進(jìn)而獲得發(fā)育能力。

重構(gòu)胚胎的激活包括物理激活和化學(xué)激活。物理激活指機(jī)械刺激、溫度變化激活和電激活，其中電激活方法應(yīng)用較為廣泛。電激活是利用細(xì)胞在短暫高壓直流電脈沖的作用下，細(xì)胞膜內(nèi)外的離子和大分子物質(zhì)發(fā)生短暫且快速的流動，導(dǎo)致鈣離子內(nèi)流而激活細(xì)胞。電激活可以一次激活，也可二次激活，具體根據(jù)不同細(xì)胞特點而確定。化學(xué)激活的主要原理是，精子與卵母細(xì)胞結(jié)合時在特定化學(xué)試劑刺激下，膜受體信號系統(tǒng)活化，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)儲存的鈣離子釋放，由于膜內(nèi)外pH值變化引起鈣離子內(nèi)流，從而激活細(xì)胞。目前發(fā)現(xiàn)的化學(xué)試劑包括乙醇［13］和離子霉素［14］。

選擇適宜的激活時機(jī)可促進(jìn)重構(gòu)胚胎的發(fā)育。在供體細(xì)胞核融合前激活去核卵母細(xì)胞，此時核供體處于哪個時期不影響重構(gòu)胚胎發(fā)育，其基因組的倍性也正常，這種卵母細(xì)胞被稱為“萬能受體”。但使用G1期的供體細(xì)胞核，加上融合前激活并去核的卵母細(xì)胞可以優(yōu)化著床前胚胎的發(fā)育狀態(tài)。受體母畜的發(fā)情時間也會影響重構(gòu)胚胎發(fā)育。L.Martin等［15］研究發(fā)現(xiàn)，豬體細(xì)胞克隆胚胎發(fā)育速度比體內(nèi)受精胚胎慢。因此，在克隆胚胎移植時通常建議選擇發(fā)情時間晚于克隆胚胎激活時間的母豬作為受體。

1.5 重構(gòu)克隆胚胎的移植

克隆胚胎應(yīng)盡早移植到受體內(nèi)，以提高受胎率，也可移植桑葚胚和囊胚階段的胚胎；可通過手術(shù)法和非手術(shù)法進(jìn)行移植，非手術(shù)法是利用特定移植設(shè)備將胚胎移植到受體特定部位，著床發(fā)育。受體應(yīng)做好同期發(fā)情，以使卵巢黃體發(fā)育達(dá)標(biāo)。其中不同物種胚胎移植階段也有較大差異，一般小鼠、牛、羊等在囊胚期移植到子宮角，豬在2、4細(xì)胞階段移植到輸卵管內(nèi)。

2 克隆胚胎技術(shù)在牛、羊、豬生產(chǎn)中的應(yīng)用

牛和羊胚胎克隆的主要目的是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將重新構(gòu)建的細(xì)胞核移植入受體細(xì)胞中，以提高牛和羊抗病能力及生產(chǎn)性能為目的。1987年，R.S.Prather等［16］將牛的胚胎細(xì)胞核移植到去核的受精卵中，成功獲得了首例胚胎克隆牛，1996年我國第一頭胚胎克隆牛誕生［17］?？寺∨咛ゼ夹g(shù)在牛上的應(yīng)用經(jīng)歷了很長的一段研究過程，存在克隆胚胎囊胚發(fā)育率低、妊娠率低、出生牛犢成活率低等特點。M.Urakawa等［18］將早期G2期胎兒成纖維細(xì)胞的細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至經(jīng)過阻滯劑處理和振蕩回收的有絲分裂期去核細(xì)胞中，將獲得的10枚克隆胚胎移植給10頭受體母牛，結(jié)果受體母牛全部妊娠，并有9頭母牛成功產(chǎn)下牛犢。

1991年，張涌等［19］成功獲得了世界第一例胚胎克隆山羊。1995年，成勇等［20］首次獲得了4只第二代胚胎克隆山羊。

豬在生理結(jié)構(gòu)和解剖結(jié)構(gòu)上都與人類有著高度的相似性，因此研究豬體細(xì)胞克隆可為人類探究疾病提供模型。除此之外，豬克隆胚胎的研究對于改良豬品種以獲得優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)性能也具有重要意義。但豬胚胎體外顯微操作難度較大，克隆胚胎技術(shù)難度高于牛和羊。I.A.Polejaeva等［21］以體內(nèi)成熟的卵母細(xì)胞為受體胞質(zhì)、顆粒細(xì)胞為供體，借助電融合技術(shù)構(gòu)建重構(gòu)胚，再以其形成的原核作為核供體進(jìn)行二次核移植，成功獲得了第一例體細(xì)胞克隆豬。A.Onishi等［22］利用物理激活方法，豬成纖維細(xì)胞在電刺激下細(xì)胞膜發(fā)生改變，將其細(xì)胞核物質(zhì)直接注射到體內(nèi)成熟的去核卵母細(xì)胞內(nèi)，獲得了核移植仔豬。劉忠華等［23］利用體外培養(yǎng)成熟的卵母細(xì)胞作為受體卵母細(xì)胞，成功獲得了體細(xì)胞克隆豬。

3 胚胎克隆移植面臨的問題和困難

3.1 克隆效率較低

造成動物克隆胚胎效率較低的原因有以下幾點：胚胎體外培養(yǎng)和體外操作過程出現(xiàn)問題；外源基因重組時插入整合出現(xiàn)偏差；重組胚胎融合激活時不徹底、不穩(wěn)定；受體去核不完全，導(dǎo)致重構(gòu)胚胎重編程不完全。

供體細(xì)胞核的不完全重編程將影響克隆胚胎移植效率?？寺∨咛ブ匦戮幊涕_始于重組胚胎細(xì)胞核膜的破裂，一般在克隆胚胎移植后30 min內(nèi)發(fā)生，如核膜破裂失敗則不能發(fā)生重編程。隨后，體細(xì)胞染色質(zhì)凝集，重構(gòu)胚胎分化發(fā)育［24］。有研究表明，選擇分化程度較低的體細(xì)胞可提高克隆效率。

3.2 克隆胚胎的安全性

利用克隆胚胎獲得的動物及其制品屬于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。目前，世界上對于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品安全性還存在爭議。主要原因有以下幾點：克隆動物健康指標(biāo)（包括生長、發(fā)育、解剖、生殖功能及生理生化指標(biāo)）是否能夠得到保障；食用克隆動物產(chǎn)品是否會引發(fā)過敏反應(yīng)、是否有毒副作用。可以通過制訂相應(yīng)的標(biāo)識管理制度評價克隆動物及其產(chǎn)品的安全性。加拿大、阿根廷、中國香港、南非和菲律賓采取自愿標(biāo)識方法，而美國則采取強制標(biāo)識。我國采取定性標(biāo)識的強制標(biāo)識。在2015年新修訂的《食品安全法》將轉(zhuǎn)基因食品生產(chǎn)和銷售轉(zhuǎn)基因食品上是否顯著標(biāo)示列入條例［25］。

4 展望

在畜牧業(yè)實際生產(chǎn)中，利用克隆胚胎技術(shù)可篩選獲得性狀優(yōu)良的畜禽，如導(dǎo)入特定基因提高豬肉生產(chǎn)效率、改善豬肉品質(zhì)。在醫(yī)學(xué)上，哺乳動物的腦結(jié)構(gòu)、功能活動與人類具有較高的相似性，開展克隆胚胎研究可為人類疾病機(jī)理和治療提供動物模型，如利用移植基因修飾技術(shù)，構(gòu)建生產(chǎn)囊狀器官纖維化病的克隆豬，用于研究人類的囊狀器官纖維化疾病。同時，可利用特定動物生產(chǎn)特異藥品，如利用克隆動物技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建復(fù)制乳腺特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動物個體，并從其乳汁中獲得人用蛋白。