精液稀釋液冷凍保護劑卵黃替代物的研究進展

潘彩霞

（中國刑事警察學院 警犬技術學院，沈陽 110000）

隨著人工授精技術的產(chǎn)生及發(fā)展，國內(nèi)外畜牧產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛。人工授精技術可彌補本交的不足，保證大量母畜的配種需求，減少本交可能帶來的疾病傳播［1］，優(yōu)秀種畜的遺傳資源也可不受時間、空間的限制在各地流通、保存，在保護遺傳資源的同時，還能加快家畜品種改良。精液保存技術是人工授精技術發(fā)展及推廣的重要關卡之一。使精子在體外能存活足夠長時間并保持一定的受精能力是精液保存技術的發(fā)展方向。精液冷凍保存可使精子進入休眠狀態(tài)、長時間保存精子，因此近年來冷凍保存技術已成為人工授精領域學者研究的重點。

精液稀釋液是影響精液冷凍保存效果的重要因素之一。精液稀釋液中成分主要包括供精子生存的營養(yǎng)物質、保持精液酸堿穩(wěn)定的緩沖物質、防止或減少降溫過程中精子冰晶形成的抗凍保護劑及保護精子免受冷休克的冷凍保護劑等。目前常用的冷凍保護劑主要是卵黃，但隨著對卵黃的使用和研究，人們逐漸發(fā)現(xiàn)其作為冷凍保護劑存在的一些弊端。卵黃作為動物性原料，可能存在病原菌，進而隨著稀釋液的攜帶進入新的傳播區(qū)域。因此，卵黃的使用限制了國際間種質資源的交流。除此之外，國內(nèi)外研究還發(fā)現(xiàn)，卵黃中一些成分對精子生存有一定負作用。M.M.Pace等［2］研究表明，卵黃中的高密度脂蛋白可誘導精子膜上的膽固醇等物質外流，使精子獲能，不利于精子冷凍后長期保存。據(jù)S.M.H.Andrabi等［3］報道，卵黃中一些氨基酸經(jīng)酶作用后會產(chǎn)生對精子有害的過氧化氫酶，該物質會抑制精子的呼吸，降低精子存活率。另外，卵黃中的成分及比例還會因所選禽類的種類及飼養(yǎng)環(huán)境的不同而有所差異，進而影響稀釋液應用效果的穩(wěn)定性［4-5］。為避免卵黃可能帶來的弊端，尋求卵黃替代物已成為近年來精液稀釋液研制的重點和熱門。

1 低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）

LDL可從卵黃中提取，約占卵黃固體成分的三分之二，是由脂質和蛋白質形成的一種球狀分子，其中的脂質主要由三磷酸甘油酯、磷脂及少量膽固醇組成。自1974年Graham等發(fā)現(xiàn)從卵黃中提取的LDL對精子冷凍具有保護作用以來，國內(nèi)外對用LDL取代卵黃應用于精液稀釋液展開了大量研究。在精子冷凍解凍過程中，LDL會黏附在精子質膜表面［6］，阻止精子質膜與精清蛋白結合導致的精子質膜中膽固醇及磷脂外流；同時LDL中的磷脂和膽固醇結合到精子質膜上，與精子質膜蛋白構成復合物，在精子表面形成一層保護膜，保證了精子質膜的完整性。另有研究表明，LDL可激活精子本身的抗氧化酶，減少精子在保存過程中所受的氧化作用，提高精子存活時間，改善精液冷凍保存效果［7］。

目前，LDL已成功應用于牛、犬、豬等動物精液稀釋液中。A.S.Varela等［8］用含不同濃度LDL的稀釋液（6%、8%、10%）對犬精液進行低溫（5℃）及冷凍保存處理，并與20%卵黃稀釋液組進行對比，結果表明，無論是5℃還是冷凍保存后，LDL稀釋液組精子活力、質膜完整率都優(yōu)于卵黃稀釋液組（P＜0.01），且3個濃度組之間無顯著差異（P＞0.05）。L.Amirat-Briand等［9］的研究表明，采用含LDL的稀釋液處理精液，冷凍、解凍后進行人工授精，奶牛受胎率為59.2%，而采用含有20%卵黃的Tris稀釋液，人工授精受胎率為65.3%，兩者差異不顯著。N.Prapaiwan等［10］用不同濃度LDL稀釋液冷凍保存從犬附睪中直接提取的精子，結果表明：4%LDL稀釋液組精子活力達57.69%，高于20%卵黃組（52.69%）；頂體完整性達70.54%，顯著高于其他組。M.Moussa等［11］用天然提取的LDL、市面所售的凍干LDL產(chǎn)品及卵黃配制稀釋液稀釋公羊精液，經(jīng)過冷凍、解凍處理后結果表明，天然LDL稀釋液無論在精子活力、膜完整性等方面與卵黃稀釋液均無顯著差別，但凍干LDL產(chǎn)品制備稀釋液精液品質不佳，說明市面所售LDL無法發(fā)揮對精子冷凍保護的功能。

2 牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）

BSA是牛血清中的一種球狀蛋白，是牛血清中的主要成分，可與多種陰、陽離子及小分子物質結合，在血液中起到營養(yǎng)、載體蛋白、pH緩沖及維持滲透壓等作用［12］。在動物細胞培養(yǎng)中就常在細胞培養(yǎng)液中添加BSA，起到載體、生理和機械保護等作用。

BSA會與精子質膜中的磷脂相互作用，有效保護精子質膜，減小精液冷凍保存過程中精子的損傷程度［13］。BSA可通過吸附、清理細胞膜外的離子及小分子物質，保持精子膜內(nèi)外的滲透壓平衡，減小精液在稀釋、冷凍過程中對精子質膜的損傷，提高精液冷凍保存效果。BSA還能作為營養(yǎng)物質，在保存過程中給精子提供能量［14-15］。

T.Matsuoka等［16］用含不同濃度BSA的稀釋液稀釋公羊精液，并與卵黃稀釋液組進行對比，經(jīng)冷凍解凍后對精子活力、活率及膜完整性進行檢測，結果表明，用含10%、15%BSA的稀釋液稀釋精液，經(jīng)冷凍、解凍后，精子活力分別為（55.0±2.9）%和（58.3±6.7）%，高于卵黃對照組的（41.7±4.4）%。Y.Fukui等［17］用含15%卵黃的稀釋液及含10%牛BSA的稀釋液稀釋山羊精液，冷凍、解凍后對母羊進行人工授精，BSA組受孕率（65.5%）與卵黃組（66.7%）無顯著差異，產(chǎn)羔率（62.1%和66.7%）也無顯著差異。張志光等［18］用40 g／L BSA替代卵黃制備精液稀釋液，于4℃低溫保存犬精液，結果表明，精液保存8 d后精子活力為（62.5±1.5）%，質膜完整率（彎尾率）為（38.6±1.0）%，說明BSA有望作為卵黃替代物用于精液稀釋液中。W.H.Lee等［19］研究發(fā)現(xiàn)，在稀釋液中添加BSA，豬精子冷凍復蘇后頂體完整性和抗氧化性都有提高。適當添加BSA可替代卵黃起到保護精子的作用，但稀釋液中BSA濃度過高會吸附精子膜外離子和小分子物質，導致膜外滲透壓降低，水分流入精子內(nèi)，使精子膨脹、質膜破損，最終影響精子活力［16，20］。

3 大豆卵磷脂（soybean lecithin）

大豆卵磷脂是從豆油中提取的，目前市面上的大豆卵磷脂實際上是幾種磷脂的混合物，其中在精液稀釋液中起作用的主要是磷脂酰膽堿［21］。卵磷脂在水相中會自發(fā)形成封閉的雙分子結構，是構成生物膜的主要成分［22］。大豆卵磷脂添加到精液稀釋液中，其親水基團會與精子內(nèi)部水分子結合，在精子表面形成一層保護膜，降低低溫對精子膜的損傷，提高質膜穩(wěn)定性。大豆卵磷脂的凝固點低于縮醛磷脂，可滲透進精子細胞內(nèi)，取代縮醛磷脂，故大豆卵磷脂在低溫冷凍保存過程中可提高精子的抗冷打擊能力，提高精子存活率。另一方面，在精液冷凍保存過程中，大豆卵磷脂所結合的不飽和脂肪酸可作為能量物質及活性物質，提高精子活力［23］。

A.T.Palasz［24］用含大豆卵磷脂的精液稀釋液冷凍保存牛精液，并以卵黃稀釋液作為對照組，解凍后進行人工授精，結果表明，卵磷脂組授精后受精卵發(fā)生卵裂率（44.6%）顯著高于對照組（27.0%）。孟娜娜等［25］分別用含有卵黃和不同濃度大豆卵磷脂的稀釋液對綿羊精液進行低溫保存試驗，結果表明，大豆卵磷脂的濃度為0.375%時精液保存效果最好，精子活力、頂體完整率、精子存活率等與對照組均無顯著差異，表明大豆卵磷脂存在取代卵黃的可能性。G.A.Sisy等［26］分別用含有卵黃和不同濃度大豆卵磷脂的Tris稀釋液對牛精液進行冷凍解凍處理，結果表明，含1%大豆卵磷脂的稀釋液解凍冷凍精液后精子活力為（56%±1.00）%，高于卵黃稀釋液組的（41.00±1.00）%。這說明牛精液冷凍稀釋液中添加1.0%～1.5%大豆卵磷脂能替代卵黃，在冷凍解凍過程中對精子能起保護作用，且無其他有害影響。R.Masoudi等［27］采用1%大豆卵磷脂稀釋液與20%卵黃稀釋液稀釋羊精液，經(jīng)低溫保存后兩組精子運動特性、質膜及頂體完整率、線粒體活力均無顯著差異；兩組精液人工授精后，母羊受孕率、產(chǎn)羔率、雙生率等也均無差異。

4 其他

除上述物質外，近年來學者們不斷嘗試用新的成分來替代卵黃作為精液稀釋液中的抗冷凍劑，取得了一定成效。T.Kaewkesa等［28］用含5 mg／mL膽固醇的稀釋液稀釋山羊精液，與含20%卵黃的稀釋液組進行比較，結果表明，兩組精液品質無顯著差異，經(jīng)人工授精后組間受胎率也無顯著差異。這說明膽固醇有望代替卵黃用于精液稀釋液。A.L.P.Souza等［29］嘗試用蘆薈汁代替卵黃，用20%蘆薈汁-Tris稀釋液低溫（5℃）及冷凍保存野豬精液，并以含20%卵黃的Tris稀釋液作對照，結果組間精液品質無差異。

5 結語

綜上，精液稀釋液中添加卵磷脂、LDL、BSA等成分，能有效減少精子在冷凍過程中的損傷，保證解凍后的精子質量。卵磷脂、LDL、BSA有望替代卵黃成為冷凍保存精液時所用的冷凍保護劑，一來減少使用卵黃導致引入病原菌的可能性，二來可簡化精液稀釋液的配制過程，更易于實現(xiàn)標準化操作，提高精液稀釋液的穩(wěn)定性。目前，國外采用的以大豆卵磷脂及低密度脂蛋白作為原料配制的精液稀釋液正逐漸取代卵黃稀釋液，在一些國家已經(jīng)實現(xiàn)商品化，而我國使用的大部分商品化精液稀釋液仍依賴進口，嘗試用新物質代替卵黃作為冷凍保護劑的報道也較少，任重而道遠。上述卵黃替代物應用于精液稀釋液中，并不斷探究稀釋液中各類物質的有效比例，研制適合國內(nèi)畜禽的精液稀釋液，是國內(nèi)學者努力的方向。