雁北嗜藍(lán)孢孔菌液體發(fā)酵條件的優(yōu)化

郭霄飛，李艷婷，王志偉，張 程，郭 尚

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)山西功能食品研究院，山西太原030031；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西太谷030801）

本試驗(yàn)以菌體干質(zhì)量、菌球形態(tài)、多糖含量為指標(biāo)，探索了雁北嗜藍(lán)孢孔菌液體發(fā)酵的最適條件，包括培養(yǎng)溫度、裝液量、搖床轉(zhuǎn)速和生長(zhǎng)周期，旨在通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵條件，為雁北嗜藍(lán)孢孔菌產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供理論支撐。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 雁北嗜藍(lán)孢孔菌菌株由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所提供（保藏編號(hào)為SXSYJJZ No.1510）。

1.1.2 主要試劑 葡萄糖、瓊脂粉、磷酸二氫鉀、維生素B1、維生素B2、海藻糖、硫酸鎂、PDA粉、苯酚等。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 電子分析天平（MS104TS）、電磁爐（C21-SDHCB16）、高壓滅菌鍋（SM830）、恒溫?fù)u床（CRY-100B）、pH分析儀（ST3100）、熱風(fēng)循環(huán)烘箱（WKH-1-A）、光照恒溫培養(yǎng)箱（GXZ-1000A）、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（TU-1810PC）、離心機(jī)（FC-5706）、電熱恒溫水浴鍋（DZKW-D-2）。

1.1.4 培養(yǎng)基 固體培養(yǎng)基為PDA粉、自來(lái)水。水燒開(kāi)后，將PDA粉溶入沸水中，使其沸騰1～2 min，裝入試管（18 mm×180 mm）及三角瓶中，每只試管裝10 mL，每個(gè)三角瓶的裝入量不超其容積的2/3，裝好后經(jīng)121℃、105 kPa滅菌30 min，備用。液體培養(yǎng)基為海藻糖20 g/L、豆粕粉35 g/L、磷酸二氫鉀0.5 g/L、硫酸鎂0.25 g/L、維生素B1100μg/L、維生素B2500μg/L、玉米粉3 g/L、植物油1 mL/L、瓊脂粉1 g/L，pH值為8.0。將豆粕粉在沸水中煮沸20 min（期間不時(shí)地?cái)嚢?，以避免糊鍋），煮好后使?層紗布過(guò)濾2次，棄去濾渣，將其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)溶于濾液中，加水定容后按試驗(yàn)設(shè)計(jì)裝入培養(yǎng)瓶中進(jìn)行滅菌，滅菌操作同PDA培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 液體發(fā)酵的培養(yǎng)方法 將雁北嗜藍(lán)孢孔菌菌株接種于試管中，在培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)滿斜面后，從斜面上挖取黃豆大小的菌塊接入平板中培養(yǎng)；待菌絲長(zhǎng)滿平板后，用相同規(guī)格的打孔器在平板上取直徑為0.3 cm的3塊菌種接種于同一液體培養(yǎng)基中，靜置1 d（使得菌絲適應(yīng)液體生長(zhǎng)環(huán)境），1 d后置于搖床中培養(yǎng)。

1.2.2 不同培養(yǎng)條件對(duì)液態(tài)發(fā)酵的影響

1.全場(chǎng)封鎖，隔離病豬群，進(jìn)行無(wú)害化處理病死豬徹底消毒，再進(jìn)及時(shí)打掃圈舍環(huán)境衛(wèi)生且將其污物、排泄物消毒后，再用復(fù)合酚濃度為1：200倍稀釋消毒圈舍，用具每天2次，連續(xù)消毒3 d后改為復(fù)合酚濃度為1：300倍稀釋?zhuān)刻?次，連續(xù)消毒3 d。

1.2.2.1 溫度對(duì)液態(tài)發(fā)酵的影響 將已接種的液體培養(yǎng)基分別放置在不同的搖床中培養(yǎng)，搖床溫度分別設(shè)置為20、25、30、35℃，且每種處理重復(fù)5次，其他條件一致（裝液量150 mL，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min，培養(yǎng)時(shí)間14 d）；發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，觀察菌球形態(tài)，測(cè)定菌體干質(zhì)量、多糖含量，探索最適培養(yǎng)溫度。

1.2.2.2 裝液量對(duì)液態(tài)發(fā)酵的影響 分別于250 mL的培養(yǎng)瓶中加入70、100、130、160 mL的液體培養(yǎng)基，滅菌后接種，置于1.2.2.1篩選的最適溫度條件下振蕩培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)5次。發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，觀察菌球形態(tài)，測(cè)定菌體干質(zhì)量、多糖含量，探索最適的裝液量。

1.2.2.3 轉(zhuǎn)速對(duì)液態(tài)發(fā)酵的影響 將已接種的液體培養(yǎng)基分別在90、120、150、180 r/min的轉(zhuǎn)速下進(jìn)行培養(yǎng)，每種處理重復(fù)5次，置于1.2.2.1篩選的最適溫度和1.2.2.2篩選出的最適裝液量條件下進(jìn)行發(fā)酵；發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，觀察菌球形態(tài)，測(cè)定菌體干質(zhì)量、多糖含量，探索最適搖床轉(zhuǎn)速。

1.2.2.4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)液態(tài)發(fā)酵的影響 將已接種的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 d，其他條件使用1.2.2.1、1.2.2.2、1.2.2.3篩選出的最優(yōu)條件進(jìn)行培養(yǎng)；從第4天開(kāi)始，每隔1 d從培養(yǎng)基中隨機(jī)取樣一次，共取樣5次，測(cè)定菌體干質(zhì)量、多糖含量，觀察菌球形態(tài)，探索最適生長(zhǎng)周期。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 菌體干質(zhì)量的測(cè)定 取一定量的發(fā)酵液，用已烘干并稱質(zhì)量的濾紙過(guò)濾，用水沖洗至洗液不再帶有發(fā)酵液顏色為止；在60℃恒溫的烘箱中干燥至恒質(zhì)量，稱量并記錄[9]。

1.3.2 多糖的測(cè)定

1.3.2.1 多糖的粗提取 將已烘干的菌球在研缽中磨碎，過(guò)0.3 mm篩，得到雁北嗜藍(lán)孢孔菌菌粉，稱量，記錄；在80℃下于恒溫水浴鍋中以1∶10（樣品∶蒸餾水）的比例萃取樣品2 h（期間萃取容器需密封防止水分蒸干），萃取結(jié)束后，冷卻至室溫；使用離心機(jī)于3 000 r/min離心5 min，棄去沉淀后再以相同的方式離心一次，合并2次的上提液；向提取液中加入一定量的4℃條件下預(yù)冷的無(wú)水乙醇，使混合液的醇濃度達(dá)到80%左右（加乙醇時(shí)應(yīng)慢加快攪，然后將其密封防止乙醇揮發(fā)），置于4℃冰箱中冷藏過(guò)夜，使沉淀析出；從冰箱中取出后于3 000 r/min離心5 min，產(chǎn)生粗制的水溶性多糖，將其置于已稱質(zhì)量的容器中于80℃烘箱中干燥，除去水分和乙醇，得到多糖的粗提物，稱量并記錄。

1.3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別量取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液裝入試管中，加蒸餾水補(bǔ)充到2.0 mL；加入新配制好的5%苯酚溶液1 mL，搖勻；隨后緩慢加入濃硫酸5 mL，搖勻，靜置30 min（使其溫度降低到室溫）；然后在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程。

1.3.2.3 多糖含量的測(cè)定 取1.3.2.1所得的雁北嗜藍(lán)孢孔菌多糖粗提取物，溶解，配成0.1 mg/mL的多糖溶液；取1 mL多糖溶液于具塞試管中，再分別移取1 mL蒸餾水、1 mL新配置的5%苯酚溶液和5 mL的濃硫酸，搖勻，靜置30 min（使其溫度降低到室溫）；在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果中的數(shù)據(jù)均為5次測(cè)定結(jié)果的平均值；采用Excel 2007整理數(shù)據(jù)和作圖，采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，采用Duncan法進(jìn)行差異顯著性比較（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

圖1為所得到的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中，橫坐標(biāo)（x）為標(biāo)準(zhǔn)溶液中葡萄糖含量（mg），縱坐標(biāo)（y）為該葡萄糖含量下測(cè)得的吸光值，x與y之間的直線線性關(guān)系為y＝20.190 0x＋0.080 6（R2＝0.996），根據(jù)該的方程，可以計(jì)算多糖含量。

2.2 培養(yǎng)溫度對(duì)雁北嗜藍(lán)孢孔菌液體發(fā)酵的影響

溫度是影響菌絲生長(zhǎng)的最關(guān)鍵因素之一。從表1可以看出，在20～30℃溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，菌體干質(zhì)量以及多糖含量呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，在30℃時(shí)菌體干質(zhì)量、多糖含量達(dá)到最大，且顯著高于其他處理；但當(dāng)培養(yǎng)溫度達(dá)到35℃時(shí)，菌體干質(zhì)量、多糖含量均降為最低，且顯著低于其他處理；30℃形成的菌球最多且較規(guī)則，菌球平均直徑為0.3 cm。因此，雁北嗜藍(lán)孢孔菌液體發(fā)酵的最適溫度為30℃。

表1 培養(yǎng)溫度對(duì)菌體干質(zhì)量和多糖含量的影響

2.3 裝液量對(duì)雁北嗜藍(lán)孢孔菌液體發(fā)酵的影響

培養(yǎng)瓶中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的含量由裝液量的多少所決定。在相同規(guī)格的培養(yǎng)瓶中，隨著裝液量的增多，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量增加，培養(yǎng)瓶中的氧氣含量逐漸降低。表2結(jié)果顯示，于250 mL的培養(yǎng)瓶中，裝液量為70～130 mL時(shí)，隨著裝液量的增多，菌體干質(zhì)量和多糖含量逐漸增加，在130 mL處理下，菌體干質(zhì)量、多糖含量達(dá)到最大，且顯著高于70、100 mL處理，菌球越來(lái)越規(guī)則；裝液量為160 mL時(shí)，其菌體干質(zhì)量和多糖含量雖與裝液量130 mL時(shí)無(wú)顯著差異，但其菌球偏大、菌球出現(xiàn)不規(guī)則。因此，在250 mL培養(yǎng)瓶培養(yǎng)雁北嗜藍(lán)孢孔菌的液體發(fā)酵的最適裝液量為130 mL。

表2 裝液量對(duì)雁北嗜藍(lán)孢孔菌液體發(fā)酵的影響

2.4 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)雁北嗜藍(lán)孢孔菌液體發(fā)酵的影響

搖床轉(zhuǎn)速直接影響到培養(yǎng)液中的溶氧水平，轉(zhuǎn)速過(guò)高形成的菌球過(guò)小甚至形不成完整的菌球，轉(zhuǎn)速過(guò)低則菌球過(guò)大[10]。在液體發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中，菌株的生長(zhǎng)能力不僅與菌株本身的性能有關(guān)，而且還與其培養(yǎng)環(huán)境息息相關(guān)。因此，液體發(fā)酵過(guò)程中搖床轉(zhuǎn)速有著重要的作用。從圖2、3可以看出，在90～150 r/min處理下，隨著轉(zhuǎn)速的增加，菌體干質(zhì)量、多糖含量逐漸增加，菌球逐漸分散開(kāi)來(lái)，越來(lái)越規(guī)則；在120、150 r/min的搖床轉(zhuǎn)速下，菌體干質(zhì)量、多糖含量間差異不顯著，但在150 r/min轉(zhuǎn)速下菌球形態(tài)較好，菌球大小均勻。因此，雁北嗜藍(lán)孢孔菌液體發(fā)酵的最適轉(zhuǎn)速為150 r/min。

2.5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)雁北嗜藍(lán)孢孔菌液體發(fā)酵的影響

在液體發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中，處于一定階段時(shí)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，菌球的質(zhì)量不斷增加，但并不是培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)越好。培養(yǎng)過(guò)程中，菌球處于封閉狀態(tài)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗、氧氣的耗損、菌球生長(zhǎng)過(guò)程中生存空間的縮小及其所產(chǎn)生的次級(jí)產(chǎn)物，都會(huì)影響菌球的生長(zhǎng)。圖4結(jié)果表明，在培養(yǎng)8 d之前，菌球生長(zhǎng)處于延遲期，菌球質(zhì)量緩慢增加；在第8～16天時(shí)，菌球處于快速生長(zhǎng)期，菌球質(zhì)量快速增長(zhǎng)，此時(shí)菌球的生命力最為旺盛，可選用此階段的菌球作為擴(kuò)大培養(yǎng)的二級(jí)種，16 d以后菌球質(zhì)量再次進(jìn)入緩慢增長(zhǎng)階段。

由圖5可知，培養(yǎng)時(shí)間對(duì)多糖含量的影響趨勢(shì)與菌球生長(zhǎng)的變化相似，培養(yǎng)前8 d多糖含量無(wú)顯著變化；培養(yǎng)超過(guò)8 d，多糖含量呈顯著增加趨勢(shì)，至第16天多糖含量達(dá)最大值，為2.55 mg/mL；16 d之后，菌球干質(zhì)量仍呈現(xiàn)緩慢增加趨勢(shì)，但多糖含量出現(xiàn)了緩慢降低趨勢(shì)，表明菌株已出現(xiàn)老化現(xiàn)象。因此，雁北嗜藍(lán)孢孔菌液體發(fā)酵的最適生長(zhǎng)周期為16 d。

3 結(jié)論與討論

我國(guó)有著悠久的菌類(lèi)食用和開(kāi)發(fā)歷史，食用菌自古就以其特殊口感和藥用價(jià)值被納入食譜和藥方中[11]。近年來(lái)，隨著人們對(duì)食用菌研究的不斷深入，其產(chǎn)品的加工渠道也不斷拓寬，目前食用菌深層發(fā)酵技術(shù)已被廣泛應(yīng)用和研究[12-13]。這些技術(shù)的發(fā)展必將為食用菌產(chǎn)品的研發(fā)提供技術(shù)支持。目前，食用菌多糖的開(kāi)發(fā)與利用越來(lái)越受到重視，因此，本試驗(yàn)在以菌球形態(tài)、菌體干質(zhì)量為指標(biāo)的基礎(chǔ)上增加多糖含量這一指標(biāo)，使得試驗(yàn)結(jié)果更加貼近實(shí)際應(yīng)用效果，也使得其更具有說(shuō)服力。

在本試驗(yàn)中，液體發(fā)酵培養(yǎng)的最適溫度為30℃，這與郭尚等[14]研究提出的雁北嗜藍(lán)孢孔菌菌絲在25、30℃時(shí)生長(zhǎng)速度最快相吻合。結(jié)合其子實(shí)體的生長(zhǎng)環(huán)境、出菇時(shí)間，可判斷該菌為高溫菌，最適生長(zhǎng)周期為16 d，這與劉曉鋼等[15]開(kāi)展的雁北嗜藍(lán)孢孔菌液體發(fā)酵試驗(yàn)，在時(shí)間上存在著差異，其原因可能是因?yàn)樵撛囼?yàn)并沒(méi)有對(duì)生長(zhǎng)周期進(jìn)行單獨(dú)的研究，只是以菌球生長(zhǎng)到一定量的時(shí)間為一個(gè)固定界限值來(lái)探究其他因素對(duì)液體發(fā)酵的影響，其還有待進(jìn)一步研究。在本試驗(yàn)中，液體培養(yǎng)基的氮源采用的是豆粕粉，在配制液體培養(yǎng)基時(shí)雖對(duì)其進(jìn)行過(guò)濾處理，卻仍存在渾濁現(xiàn)象，但隨著菌絲培養(yǎng)時(shí)間的增加，培養(yǎng)液逐漸變得澄清，這應(yīng)該是由菌絲體分解豆粕粉用以生長(zhǎng)所致。在發(fā)酵罐規(guī)模化生產(chǎn)中，若培養(yǎng)基配方不變，是否可以根據(jù)培養(yǎng)液的澄清狀況來(lái)辨別菌絲的生長(zhǎng)階段，這還有待進(jìn)一步研究。另外，本試驗(yàn)由于時(shí)間方面的原因，僅進(jìn)行了單因素試驗(yàn)，尚未進(jìn)行多因素正交試驗(yàn)，探索溫度、裝液量、搖床轉(zhuǎn)速、生長(zhǎng)周期4個(gè)因素之間相互作用的交互模型有待進(jìn)一步研究。

結(jié)合本試驗(yàn)的數(shù)據(jù)分析，利用液體深度發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)雁北嗜藍(lán)孢孔菌的多糖在原理上是可行的，但若要進(jìn)行大規(guī)模的生產(chǎn)，還需進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。在無(wú)法進(jìn)行人工馴化的前提下，該方法為雁北嗜藍(lán)孢孔菌功能產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供了一種有效的途徑，即使日后該菌突破技術(shù)難關(guān)，得以人工化栽培，液體發(fā)酵仍具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。一方面，液體發(fā)酵所需成本較低、污染率低，可在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn)；另一方面，液體發(fā)酵菌球取樣較容易，取樣過(guò)程中不需要與培養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行分離，不易受到外界環(huán)境中雜菌的污染，無(wú)論是進(jìn)行樣品數(shù)據(jù)分析、還是進(jìn)行菌絲成分的提取都較簡(jiǎn)單，不需要進(jìn)行復(fù)雜的處理。

本研究結(jié)果表明，在250 mL的培養(yǎng)瓶中，雁北嗜藍(lán)孢孔菌的最佳發(fā)酵條件為溫度30℃、裝液量130 mL、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min、生長(zhǎng)周期16 d；在此條件下培養(yǎng)的液體菌種，不僅菌球干質(zhì)量大、多糖含量高，而且菌球形態(tài)較好、菌球大小比較均勻。