雞球蟲病疫苗稀釋劑配方的初步篩選

武一帆，范炳靈，郭露露，馬曉蘭，趙 彤，鄭明學(xué)

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西太谷030801）

雞球蟲病是一種危害嚴(yán)重的寄生蟲疾病，在養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)非常多見(jiàn)，每年因球蟲病造成的直接經(jīng)濟(jì)損失和用于預(yù)防球蟲病的藥物、疫苗等間接費(fèi)用巨大，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界因該病而引起的損失每年超過(guò)30億美元[1]。即使大型養(yǎng)殖場(chǎng)在飼養(yǎng)管理、飼料營(yíng)養(yǎng)等方面有了很大的改善和提高，但是仍然不能杜絕球蟲病的發(fā)生。因此，長(zhǎng)期飼養(yǎng)的雞一般都會(huì)使用雞球蟲病的疫苗來(lái)免疫預(yù)防球蟲病。

在臨床實(shí)際中，常用的雞球蟲病疫苗均為活卵囊疫苗，主要有灌口、飲水、拌料和噴霧等多種免疫方法[2]。其中，灌口接種法操作較為繁瑣，應(yīng)激大；飲水免疫法需要特殊的助懸劑，雛雞日齡小飲水量不夠，無(wú)法保證免疫效果；拌料免疫法是手工操作，容易出現(xiàn)拌不勻或個(gè)體食量差異問(wèn)題，造成免疫不均；噴霧免疫法是近幾年才出現(xiàn)的一種免疫方法，它能大幅度降低人力物力，適合于大型的雞場(chǎng)，但用水作為稀釋劑噴出的霧滴，容易滾落到地上，造成卵囊的損耗，同時(shí)水滴易干，疫苗在干燥的空氣中失去活性，也會(huì)降低雞的免疫效果。ALBANESE等[3]采用凝膠稀釋劑稀釋疫苗，能讓更多的疫苗液滴黏附在雞羽毛上而不易掉落，從而使雞有更多時(shí)間進(jìn)行整理和攝取卵囊。但國(guó)內(nèi)在本研究領(lǐng)域暫無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究基于雞球蟲病疫苗的特性、雞自然特性及免疫途徑多方面因素考慮，尋找一種具有助懸效果，可以均勻攜帶球蟲卵囊及大量水分并黏附于雞只體表，即集黏度、保濕、生物安全和可食用性于一體的材料用作疫苗稀釋劑。

黃原膠是一種高分子量多糖，是目前國(guó)際上集增稠、懸浮、穩(wěn)定、乳化于一體，性能優(yōu)越的生物膠，無(wú)臭、無(wú)味、無(wú)毒、生物安全，廣泛應(yīng)用于藥物和食品領(lǐng)域。同時(shí)它是典型的非牛頓流體，其水溶液具有極高的假塑性[4]，有利于噴霧液滴的形成。石點(diǎn)等[5]研究結(jié)果表明，1%的黃原膠黏度大約為2 500 mPa·s。

海藻酸鈉是從褐藻類的海帶或馬尾藻中提取的一種多糖碳水化合物，具有優(yōu)良的穩(wěn)定性、成膜性、抗菌性、無(wú)毒無(wú)味、可生物降解、生物相容性好等諸多優(yōu)點(diǎn)，且成本較低，可作為可食膜材料，用于黏附給藥途徑的生物制劑和疫苗蛋白多肽的藥物載體[6-8]。劉曉靜等[9]研究表明，1.0%的海藻酸鈉處理在抑制蓮藕表皮褐變方面效果良好，經(jīng)0.8%、1.0%、1.2%濃度涂膜處理后的蓮藕失重率分別為7.5%、2.0%、4.5%。羅海莉[10]研究表明，海藻酸鈉濃度越高，膜厚度越大，透光率越低，其中，2%海藻酸鈉成膜性最佳。于子森等[11]研究表明，1%的黏度在300～350 mPa·s，2%的黏度在2 000～3 000 mPa·s，3%的黏度在15 000～20 000 mPa·s。咸娜[12]研究指出，黃原膠和海藻酸鈉復(fù)配具有協(xié)同性，溶液的黏彈性大于單體膠，0.5%的黃原膠和海藻酸鈉復(fù)配9∶1時(shí)黏度最高，在800～1 000 mPa·s；1%的黃原膠和海藻酸鈉復(fù)配4∶6黏度最高，在3 000～3 500 mPa·s。英特維特國(guó)際股份有限公司[13]發(fā)明的一種可用常規(guī)噴霧裝置進(jìn)行噴霧的球蟲疫苗專利，表明200～4 000 mPa·s黏度含黃原膠成分的溶液噴霧時(shí)更容易形成不會(huì)打濕雞只羽毛的小液滴。

甘油作為一種親水性材料，無(wú)色、略帶甜味、無(wú)臭、透明，它能輕易地插入多糖分子鏈，并和分子鏈上的親水基團(tuán)結(jié)合形成氫鍵。當(dāng)親水性的甘油各分子參與成鍵作用成功，多糖膜在分子內(nèi)或分子間本身的相互作用能力就會(huì)大大地減弱，因此，多糖膜結(jié)構(gòu)的剛性被削弱，其膜的柔韌性增加，故達(dá)到了改善多糖膜機(jī)械和化學(xué)性能的目的，使多糖膜變得柔軟、有光澤并且富有彈性[14-15]。羅海莉[10]在試驗(yàn)中添加了1%的甘油作為增塑劑，有效地改善了海藻酸鈉的成膜性。鄭長(zhǎng)興[16]研究指出，在蒸餾水中加入5%的甘油能有效防止噴出的霧滴迅速被蒸發(fā)掉。

本試驗(yàn)以黃原膠、海藻酸鈉為主要原料，以甘油為增塑劑、保濕劑，通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)不同配方，測(cè)定黏度、黏壁率、沉降率、失水率等指標(biāo)，同時(shí)結(jié)合臨床實(shí)際應(yīng)用及生產(chǎn)成本選出懸浮穩(wěn)定性合格、霧滴持水性好、黏壁率高、價(jià)格低廉的最優(yōu)配方，旨在為球蟲噴霧免疫研究提供合理參數(shù)及配方。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 主要原料 黃原膠，食品級(jí)，鄂爾多斯市中軒生化股份有限公司；海藻酸鈉，食品級(jí)，青島明月海藻集團(tuán)有限公司；丙三醇，分析純，天津易發(fā)化學(xué)試劑廠。

1.1.2 蟲株 雞堆型艾美耳球蟲（Asx）由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院獸醫(yī)病理實(shí)驗(yàn)室保存并提供。

1.1.3 主要儀器設(shè)備NDJ-1型旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）、離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）、恒溫箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 配方設(shè)計(jì) 混合使用黃原膠、海藻酸鈉、甘油濃度3種成分，設(shè)置黃原膠（因素A）3個(gè)水平，分別為0.4%、0.6%、0.8%；海藻酸鈉（因素B）3個(gè)水平，分別為0、0.1%、0.6%；甘油（因素C）3個(gè)水平，分別為0、1%、5%。按照表1疫苗稀釋劑配方進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.2 疫苗稀釋劑的制備 分別取100 mL去離子水依次加入到9個(gè)干燥潔凈的小燒杯中，按表1對(duì)應(yīng)加入甘油，備用。取9個(gè)小玻璃瓶，按表1稱取各處理物質(zhì)，用錫紙密封，搖晃混勻，再用牙簽在錫紙上均勻地扎6個(gè)小孔，將小玻璃瓶中原料撒入對(duì)應(yīng)的小燒杯中，邊加邊用玻璃棒攪拌，靜置1～2 h，使溶液均勻一致接近無(wú)色透明（肉眼不可見(jiàn)顆粒），然后分別以2 000 r/min離心5 min，取出倒回?zé)谩?/p>

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 黏度測(cè)定 采用NDJ-1型旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，記錄3號(hào)轉(zhuǎn)子、30 r/min下各處理的黏度。

1.3.2 黏壁率測(cè)定 取9個(gè)100 mL小燒杯，編號(hào)T1～T9，稱質(zhì)量（A），并記錄；然后取9個(gè)處理球蟲疫苗噴霧免疫稀釋液于對(duì)應(yīng)的燒杯中，稱質(zhì)量（B），并記錄。稱量完成后將燒杯內(nèi)液體垂直傾倒出，待到液體斷流，收起燒杯，稱量?jī)A倒后燒杯的質(zhì)量（C），并記錄。

1.3.3 失水率測(cè)定 取9個(gè)規(guī)格相同潔凈干燥的平皿，編號(hào)T1～T9。稱取20 g各處理疫苗稀釋液于不同的平皿中，稱質(zhì)量（W0），并記錄。稱量完成后將上述平皿置于33℃恒溫箱中，于放置后1、6、12、24、48、72 h稱質(zhì)量（Wt），并記錄。

1.3.4 沉降率測(cè)定 取9只10 mL離心管，分別加入1 mL（50 000個(gè)/mL）球蟲卵囊液，2 500 r/min離心10 min，棄上清，用玻璃棒攪勻沉淀；沉淀攪開后，分別加入各處理球蟲疫苗稀釋劑10 mL，從不同方向（順時(shí)針、逆時(shí)針、上下）反復(fù)攪拌，使球蟲卵囊在稀釋液內(nèi)均勻分布；于配制球蟲疫苗混懸液后的0、4、8 h，用移液槍在10 mL離心管上、中、下3層分別吸取10μL球蟲疫苗混懸液，在10×10顯微鏡下計(jì)算卵囊數(shù)，每處理各取樣3次，取平均值，以0 h混懸液的卵囊平均數(shù)為基數(shù)。若8 h的球蟲沉降率小于10%，表明卵囊既不上浮也不沉降，符合混懸要求。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行處理，以“K值＋R值”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 黏度分析

從圖1可以看出，黏度值整體呈上升趨勢(shì)。由表2可知，黃原膠的黏度值K值大小表現(xiàn)為K3＞K2＞K1；海藻酸鈉的K值大小表現(xiàn)為K3＞K2＞K1；甘油的K值大小表現(xiàn)為K2＞K3＞K1，表明稀釋劑黏度隨著膠體成分濃度的增加而增加，其中，對(duì)黏度值影響最大的是黃原膠（極差R為0.897），其次依次是海藻酸鈉（極差R為0.307）和甘油（極差R為0.097）。

表2 黏度K值和極差R

2.2 黏壁率分析

從圖2可以看出，黏壁率整體呈上升趨勢(shì)。從表3可以看出，黃原膠黏度率的K值大小表現(xiàn)為K3＞K2＞K1，海藻酸鈉的K值大小表現(xiàn)為K3＞K2＞K1，甘油的K值大小表現(xiàn)為K1＞K2＞K3，因此，黏壁率的最優(yōu)水平組合是A3B3C1；其中，對(duì)黏壁率影響較大的是黃原膠（極差R為12.663），其次依次是海藻酸鈉（極差R為4.217）和甘油（極差R為0.250）。

表3 黏壁率K值和極差R值

2.3 失水率分析

不同處理12 h之前的失水率無(wú)明顯差別，12 h后不同處理各時(shí)間段以T7處理失水率最低，表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)（表4）。不同處理1 h時(shí)的失水速率差異明顯，T7處理的失水速率最低，12 h后不同處理失水速率變化均不明顯（表5）。黃原膠失水率的K值大小表現(xiàn)為K1＞K2＞K3，海藻酸鈉的K值大小表現(xiàn)為K1＞K3＞K2，甘油的K值大小表現(xiàn)為K2＞K1＞K3，因此，失水率的最優(yōu)水平組合是A3B2C3；其中，對(duì)失水率影響較大的是甘油（極差R為10.667），其次依次是黃原膠（極差R為4.000）和海藻酸鈉（極差R為3.167）（表6）。

表4 各時(shí)間段各組失水率 %

表5 各時(shí)間段各組失水速率 g/h

表6 失水率K值和極差R值

2.4 沉降率分析

表7 沉降率試驗(yàn)結(jié)果

表8 沉降率K值和極差R值

T3～T9處理8 h的沉降率均小于10%，表明卵囊既不上浮也不沉降，符合混懸要求（表7）。黃原膠沉降度的K值大小表現(xiàn)為K1＞K2＞K3，海藻酸鈉的K值大小表現(xiàn)為K1＞K2＞K3，甘油的K值大小表現(xiàn)為K1＞K2＞K3，因此，沉降率的最優(yōu)水平組合是A3B3C3；其中，對(duì)沉降率影響較大的是黃原膠（極差R為10.883），其次是海藻酸鈉（極差R為5.100），再次是甘油（極差R為4.817）（表8）。

3 結(jié)論與討論

本研究通過(guò)對(duì)黏度及黏壁率試驗(yàn)結(jié)果分析可知，膠體濃度升高，黏度升高、其黏壁率也升高；而甘油的濃度與黏度及黏壁率間無(wú)明顯變化規(guī)律。姚云真等[14]研究了不同濃度甘油對(duì)不同種明膠溶液黏度的影響，結(jié)果顯示，并非甘油濃度越高黏度越高；王利強(qiáng)等[17]研究表明，甘油濃度的增加會(huì)使總成膜液的黏度上升，0的甘油黏度度量值為10.01，1%為13.48，2%為13.24，可以看出，2%的黏度度量值比1%的低，與本試驗(yàn)研究結(jié)果相符。甘油濃度與黏度間的變化規(guī)律性還有待進(jìn)一步研究。

本研究失水率試驗(yàn)結(jié)果顯示，甘油對(duì)失水率的影響最大，其保濕原理是由于其含有3個(gè)羥基（丙三醇），易親水，能吸收空氣中的水分，還可以防止水分蒸發(fā)，因此，具有良好的保水性[18]。黏壁率、失水率、沉降率最優(yōu)組合分別為A3B3C1、A3B2C3、A3B3C3，可以發(fā)現(xiàn)，黃原膠可選水平為A3，海藻酸鈉可選水平為B2和B3，甘油的可選水平為C1和C3。黃原膠作為影響?zhàn)け诼?、沉降率的主要因素，?yōu)選時(shí)應(yīng)該選擇更高濃度的水平以提高黏度，但考慮到原料的成本問(wèn)題和噴霧儀器的配適問(wèn)題，選擇達(dá)到混懸效果的低用量處理即可，故A2也是黃原膠的可選水平。綜上，黃原膠、海藻酸鈉和甘油以A2B1C3的組合為宜。

有研究表明，黃原膠主要與魔芋膠的復(fù)配效果較好[19]。王元蘭等[20]研究表明，黃原膠和魔芋膠以不同比例復(fù)配均有明顯的協(xié)同作用。因此，在后續(xù)的研究中，黃原膠和魔芋膠復(fù)配的組方還有待深入探討。