Kisspeptin／GPR54在性腺中調(diào)控動(dòng)物卵泡發(fā)育的研究進(jìn)展

梅 山，杜旭旭，楊朝云，史遠(yuǎn)剛，淡新剛

（寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，銀川 750021）

Kisspeptin是由kiss1基因編碼的肽類激素，通過G蛋白偶聯(lián)受體GPR54（也稱kiss1R）發(fā)揮作用。Kiss1被報(bào)道在非轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞中表達(dá)，隨后被證明是抑制惡性黑色素瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能的抑制因子［1］。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，kisspeptin／GPR54直接或間接與神經(jīng)遞質(zhì)相互作用，調(diào)控促性腺激素釋放激素（GnRH）的釋放，在動(dòng)物生殖內(nèi)分泌、初情期啟動(dòng)及季節(jié)性繁殖中扮演著重要作用。Kisspeptin／GPR54信號(hào)系統(tǒng)還在外周組織中表達(dá)，參與卵巢功能的調(diào)節(jié)、胚胎植入、胎盤形成、血管生成、胰島素分泌等生物學(xué)過程。最近的諸多研究表明，kisspeptin在動(dòng)物卵巢中發(fā)揮調(diào)控功能，包括卵泡發(fā)育成熟、顆粒細(xì)胞活力、類固醇合成等方面。文章闡述了kisspeptin／GPR54的生物學(xué)特性和kisspeptin／GPR54在動(dòng)物卵巢中的定位分布，歸納了kisspeptin／GPR54在卵泡發(fā)育中的調(diào)控作用，突出強(qiáng)調(diào)了kisspeptin／GPR54在調(diào)控卵巢顆粒細(xì)胞活力及類固醇合成中的作用及其在細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)信號(hào)通路。

1 Kisspeptin／GPR54簡介

編碼kisspeptin蛋白的kiss1基因位于人染色體lq32～41區(qū)域，由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成，前2個(gè)外顯子不翻譯；第3個(gè)外顯子是由38個(gè)非編碼堿基對(duì)構(gòu)成，后接轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和其余103個(gè)編碼堿基對(duì)；第4個(gè)外顯子中包含332個(gè)編碼堿基對(duì)、終止子和多腺苷酸化信號(hào)［1］。Kiss1編碼的初始肽類產(chǎn)物由145個(gè)氨基酸構(gòu)成，根據(jù)其水解后氨基酸鏈長度的不同可以分為kisspeptin 54、kisspeptin14、kisspeptin13、kisspeptin10，統(tǒng) 稱 為kisspeptins［2］。Kisspeptins家族及其包含的各級(jí)短肽都具有相同C端結(jié)構(gòu)Arg-Phe-NH2，屬于RF-酰胺化修飾結(jié)構(gòu)，具有類似的生物學(xué)活性。目前已經(jīng)克隆出很多物種kiss1基因的cDNA序列，包括人、牛、羊、猴、小鼠、大鼠和黑猩猩。通過氨基酸序列同源性分析發(fā)現(xiàn)，人和其他靈長類動(dòng)物的同源性高于85%，而人和嚙齒類動(dòng)物之間同源性為45%～50%［3］。在1999年研究者發(fā)現(xiàn)，在人及鼠的大腦中kisspeptin是GPR54的一個(gè)配體，kisspeptins作為其天然配體，發(fā)揮調(diào)控作用的途徑就是通過激活其特異性受體GPR54來實(shí)現(xiàn)的［4］。人類的GPR54基因含有5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子，位 于19 號(hào) 染 色 體 上，別 名 AXOR12 或hoT7T175，其開放式閱讀框架包括398個(gè)氨基酸，可編碼的分子質(zhì)量為75 kD，其與甘丙肽及阿片受體家族具有一定的同源性［5］。J.Roa等［6］發(fā)現(xiàn)，人類GPR54同哺乳動(dòng)物序列同源性相似程度較高，可達(dá)80%；但人與水生動(dòng)物或兩棲動(dòng)物相似程度偏低，僅為45%，可見GPR54在不同動(dòng)物中較保守。

Kisspeptin及其受體GPR54在哺乳動(dòng)物的各個(gè)組織器官中大量表達(dá)，其生物學(xué)功能最初被界定為抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，突變或無法正常表達(dá)kiss1基因可能會(huì)引發(fā)子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、膀胱癌等多種病癥，還與多種惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲有關(guān)［7］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，kisspeptin／GPR54系統(tǒng)是調(diào)節(jié)生殖活動(dòng)中起關(guān)鍵作用的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)之一。Kisspeptin神經(jīng)元位于生殖軸的最上端，釋放的kisspeptin與其受體GPR54結(jié)合，促進(jìn)GnRH的分泌，影響促卵泡素和促黃體激素的釋放，進(jìn)而影響哺乳動(dòng)物的各項(xiàng)繁殖性能，包括性別分化、青春期啟動(dòng)、促性腺激素分泌的調(diào)節(jié)以及激素和環(huán)境對(duì)生育的控制［8］。除了在下丘腦-垂體-性腺軸起重要作用外，kisspeptin還參與動(dòng)物機(jī)體代謝［9］、妊娠［10］、季節(jié)性發(fā)情［11］等一系列重要生理事件的調(diào)控。研究表明，kisspeptin／GPR54系統(tǒng)在調(diào)節(jié)動(dòng)物機(jī)體各種生理過程中扮演著重要的角色。全面了解kisspeptin／GPR54系統(tǒng)在生殖中的表達(dá)、功能及其潛在的分子機(jī)制將有助于生殖疾病的預(yù)防、診斷和治療。

2 Kisspeptin／GPR54在卵巢中的定位和表達(dá)

J.M.Castellano等［12］研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠發(fā)情周期的不同階段kisspeptin及其受體GPR54的編碼基因均表達(dá)，在初情期前的大鼠卵巢中kiss1mRNA水平較低，在初情期后的卵巢中kiss1mRNA水平顯著升高；在成年大鼠的卵母細(xì)胞、除無動(dòng)情期外所有時(shí)期的顆粒細(xì)胞和間情期黃體中kiss1mRNA持續(xù)表達(dá)，在發(fā)情前期卵巢中表達(dá)水平開始升高，之后急劇下降，發(fā)情間期僅有少量增加。而GPR54mRNA水平在大鼠整個(gè)周期中保持在較低水平，沒有明顯的波動(dòng)。F.Gaytan等［13］在人卵巢周期中檢測(cè)到了GPR54的表達(dá)，在生長卵泡中GPR54定位在生長卵泡的膜層，排卵后免疫染色定位在未完全黃素化的顆粒細(xì)胞中。在對(duì)西伯利亞倉鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，kisspeptin存在于卵泡中，在卵泡膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中表達(dá)量較高，在動(dòng)情前期和動(dòng)情間期達(dá)到高峰；GPR54在腔前卵泡、腔內(nèi)卵泡及黃體中類固醇生成細(xì)胞中表達(dá)，在動(dòng)情前期中的表達(dá)相對(duì)較強(qiáng)，而在動(dòng)情間期中有所下降［14］。Z.Merhi等［15］研究發(fā)現(xiàn)，kisspeptin的表達(dá)與年齡相關(guān)，與幼齡小鼠相比，老年小鼠卵巢中的kiss1和GPR54mRNA水平顯著升高；在人類卵丘顆粒細(xì)胞中，GPR54mRNA水平與年齡呈正相關(guān)。M.E.Cielesh等［16］發(fā)現(xiàn)青春期前母犬卵巢中沒有kiss1表達(dá)，kiss1／GPR54在生殖周期的各個(gè)階段均存在于卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和黃體中，卵泡發(fā)育的不同階段不影響GPR54表達(dá)。P.Tanyapanyachon等［17］發(fā)現(xiàn)，kisspeptin及其受體GPR54在家貓各個(gè)時(shí)期的卵巢和子宮中均有表達(dá)，不同卵巢期間的定位分布無顯著差異。其他研究發(fā)現(xiàn)，GPR54在烏魚卵巢的表達(dá)從青春期中期開始顯著升高，是青春期早期的2倍［18］。

以上這些研究表明kisspeptin／GPR54在卵巢的分布具有顯著的時(shí)空特異性，在動(dòng)物發(fā)情周期不同階段的分布不同，且kisspeptin／GPR54表達(dá)水平取決于發(fā)情周期的不同階段。Kisspeptin／GPR54在不同動(dòng)物卵巢中具有高度保守的表達(dá)模式［19］。Kisspeptin／GPR54在性腺上可能以自分泌或旁分泌的方式參與動(dòng)物卵泡發(fā)生［20］、卵母細(xì)胞成熟［21］、排卵［22］、顆粒細(xì)胞增殖凋亡［23-24］及類固醇合成［25］。

3 Kisspeptin／GPR54對(duì)卵泡發(fā)育的調(diào)控

3.1 Kisspeptin／GPR54直接調(diào)控卵泡發(fā)育

從幼年期到初情期，小鼠卵巢中kiss1mRNA的表達(dá)逐漸上調(diào)［26］。在初情期前，kiss1／GPR54敲除小鼠和正常小鼠的卵巢重量沒有顯著差異，在初情期后，kiss1／GPR54敲除小鼠與對(duì)照組小鼠相比卵巢重量和大小均顯著降低［27］。研究發(fā)現(xiàn)，GPR54單倍體缺陷小鼠，在初情期后一直到32周齡腔前卵泡數(shù)逐漸減少［28］。D.Fernandois等［20］報(bào)道，將kisspeptin或kisspeptin受體頡頏劑P234注入6，10月齡大鼠卵巢，結(jié)果表明，卵巢注入一定量kisspeptin可使有腔卵泡數(shù)減少，排卵前卵泡和黃體數(shù)增加；相反，卵巢注入P234后有腔卵泡數(shù)增加，而排卵前卵泡和黃體數(shù)減少。人抗苗勒氏管激素（AMH）主要由次級(jí)和小腔卵泡分泌，能夠抑制原始卵泡激活能力，是卵巢儲(chǔ)備的生物標(biāo)志物［29］。在6，10月齡大鼠中，注射kisspeptin會(huì)增加血漿AMH，而P234會(huì)降低血漿AMH［20］。提示kisspeptin可能通過上調(diào)AMH和下調(diào)卵泡刺激素受體（FSHR）在卵巢中的表達(dá)來負(fù)向調(diào)節(jié)竇前（包括原始、初級(jí)和次級(jí)卵泡）卵泡的發(fā)育。在初情期后，kisspeptin可促進(jìn)大卵泡的進(jìn)一步發(fā)育成熟，增加排卵和黃體數(shù)量。

已有研究發(fā)現(xiàn)，kisspeptin可能在卵巢上以旁分泌和自分泌的方式參與卵泡發(fā)育及卵母細(xì)胞成熟的調(diào)控。在綿羊中，添加kisspeptin的培養(yǎng)液中卵母細(xì)胞成熟比例顯著高于對(duì)照組；在添加kisspeptin的各組中，10μg／mL kisspeptin10可顯著提高體外培養(yǎng)的卵母細(xì)胞成熟率［30］。與綿羊卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)的結(jié)果類似，在水牛卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)中，添加10μg／mL kisspeptin10也能顯著增加卵丘細(xì)胞擴(kuò)張率和第一極體排出率［31］。在豬上的研究發(fā)現(xiàn)，特定濃度的kisspepin不但能夠增加豬卵母細(xì)胞體外成熟率，而且也能促進(jìn)早期胚胎發(fā)育率［21］。另外，卵泡內(nèi)的kisspeptin濃度與卵母細(xì)胞成熟密切相關(guān)［32］，在一些體外受精（in vitro fertilization，IVF）或卵巢過度刺激綜合征（ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS）患者中，kisspeptin54處理能夠促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟，并且較安全［33］。

C-mos基因能夠調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞，通過激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)控蛋白酶調(diào)節(jié)成熟促進(jìn)因子（MPF）的活性，c-mos還可通過抑制磷酸酶和激活下游信號(hào)通路促進(jìn)胚泡破裂（GVBD）的發(fā)生［34］。已有的研究表明，在豬卵母細(xì)胞體外成熟過程中，c-mos基因表達(dá)逐漸升高［35］。GDF9和BMP15屬于TGFβ超家族成員，它們?cè)诼涯讣?xì)胞和卵泡顆粒細(xì)胞中均有表達(dá)，并且其基因表達(dá)隨著卵泡發(fā)育及卵母細(xì)胞成熟而發(fā)生改變［36］。在體外培養(yǎng)中，添加一定濃度的GDF9和BMP15能夠提高卵母細(xì)胞體外成熟率［37］。研究表明，一定濃度kisspeptin10能夠上調(diào)豬卵母細(xì)胞中GDF9mRNA和BMP15mRNA基因的表達(dá)［21］。因此，kisspeptin可能直接作用于卵母細(xì)胞，通過上調(diào)卵母細(xì)胞中c-mos、GDF9和BMP15 mRNA的表達(dá)以提高卵母細(xì)胞的成熟率。然而，kisspeptin／GPR54直接對(duì)卵泡發(fā)育的作用，特別是腔前卵泡的發(fā)育還不清楚，kisspeptin／GPR54對(duì)卵泡發(fā)育的調(diào)控的分子機(jī)制尚未闡明，這需要做進(jìn)一步研究。

3.2 Kisspeptin／GPR54間接調(diào)控卵泡發(fā)育

顆粒細(xì)胞是卵巢的主要功能細(xì)胞，顆粒細(xì)胞的生長發(fā)育在卵泡招募、選擇和成熟的生物學(xué)過程中起著至關(guān)重要的作用。在卵泡發(fā)育過程中顆粒細(xì)胞通過間隙連接，從周圍攝取各種營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)卵泡生長。不同的細(xì)胞因子通過調(diào)控顆粒細(xì)胞上的促卵泡激素受體（FSHR）和雌激素受體（ER），促使卵泡進(jìn)入生長期［38］。隨著卵泡的發(fā)育，顆粒細(xì)胞中芳香化酶的活性增強(qiáng)，會(huì)進(jìn)一步提高雌激素濃度，刺激卵泡快速生長［39］。Kisspeptin在卵巢顆粒細(xì)胞中表達(dá)，通過其受體發(fā)揮作用，kisspeptin／GPR54可通過調(diào)控顆粒細(xì)胞活力及類固醇生成間接影響卵泡發(fā)育。

研究表明，kisspeptin10可以以劑量依賴方式極顯著提高雞卵巢顆粒細(xì)胞活力，促進(jìn)孕酮合成［40］。在kisspeptin對(duì)牛卵巢顆粒細(xì)胞孕酮分泌影響的研究中也發(fā)現(xiàn)，kisspeptin10可以顯著提高牛顆粒細(xì)胞活力，100 nmol／L kisspeptin10處理牛卵巢顆粒細(xì)胞24 h后顆粒細(xì)胞孕酮水平顯著提高［23］。趙靜等［41］檢測(cè)了不同濃度kisspeptin10處理牛顆粒細(xì)胞不同時(shí)間后的細(xì)胞活力，發(fā)現(xiàn)不同濃度的kisspeptin10均可以極顯著提高牛卵巢顆粒細(xì)胞活力。Xin X.等［42］研究發(fā)現(xiàn)，在豬顆粒細(xì)胞中kiss1過表達(dá)可降低G0／G1期顆粒細(xì)胞的比例，顯著抑制顆粒細(xì)胞凋亡。張琳欽等［43］用kisspeptin10處理牦牛卵巢顆粒細(xì)胞，結(jié)果不同濃度kisspeptin10均能顯著提高顆粒細(xì)胞活力，且kisspeptin10對(duì)孕酮分泌呈劑量依賴性增加。另外在大鼠黃體細(xì)胞中，kisspeptin雖不影響3β-HSD mRNA轉(zhuǎn)錄，但能上調(diào)類固醇急性調(diào)節(jié)蛋白（STAR）和CYP11A的轉(zhuǎn)錄，且人體絨膜促性腺激素（hCG）能夠增強(qiáng)這一刺激效應(yīng)［25］。在兔黃體中，kisspeptin通過自分泌或旁分泌的方式增加孕酮的分泌［44］。G.K.Mishra等［45］研究發(fā)現(xiàn)，kisspeptin上調(diào)水牛卵巢顆粒細(xì)胞中黃體生成素（LHR）、STAR、3β-羥基類固醇脫氫酶（3β-HSD）、芳香化酶P450（CPY11A1）的相對(duì)表達(dá)，提示kisspeptin在水牛黃體類固醇合成中起著的重要作用。kisspeptin在犬卵巢中具有局部調(diào)控作用，卵母細(xì)胞中的kisspeptin作用于顆粒細(xì)胞中的GPR54，刺激顆粒細(xì)胞中kiss1的表達(dá)，從而促進(jìn)顆粒細(xì)胞的生長發(fā)育和孕酮的生成［16］。在人上，L.A.Owens等［46］研究發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)的卵母細(xì)胞成熟觸發(fā)因子hCG和GnRH相比，kisspeptin54作為卵母細(xì)胞成熟誘導(dǎo)因子，可以使人黃體細(xì)胞中與類固醇合成有關(guān)的基因（包括FSHR、LH／hCG受體、STAR、CPY19A1、雌激素受體α和雌激素受體β、3β-HSD和抑制素A基因）表達(dá)增強(qiáng)，這提示kisspeptin／GPR54也在人卵巢顆粒細(xì)胞類固醇合成中起關(guān)鍵作用。

綜上所述，在顆粒細(xì)胞中，kisspeptin通過提高顆粒細(xì)胞活力、上調(diào)類固醇合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)促進(jìn)顆粒細(xì)胞類固醇激素的合成，從而間接調(diào)控卵泡發(fā)育。

4 Kisspeptin／GPR54發(fā)揮生理作用的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路

Kisspeptin與其受體GPR54結(jié)合，通過G蛋白介導(dǎo)激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路發(fā)揮生理作用。在GnRH細(xì)胞和下丘腦外植體中，GPR54在配體結(jié)合時(shí)激活磷脂酶C，隨后將磷脂酰肌醇二磷酸分解為三磷酸肌醇和二乙?；视汀Ｇ罢哒T導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)儲(chǔ)存的Ca2＋外流，細(xì)胞內(nèi)Ca2＋的增加導(dǎo)致離子通道通透性的改變，從而引起去極化反應(yīng)；后者激活PKC，從而誘導(dǎo)MAPK激酶如ERK1／2和p38的磷酸化。二乙?；视瓦€通過激活非選擇性陽離子通道和抑制內(nèi)向整流鉀通道刺激GnRH去極化［47］。在垂體中，kisspeptin對(duì)垂體GPR54激活的刺激是由信號(hào)通路TOR、PI3、MAPK、PLC和細(xì)胞內(nèi)Ca2＋動(dòng)員通路信號(hào)介導(dǎo)的，這與GPR54在Gn-RH神經(jīng)元的作用通路非常相似［48］。此外，GPR54的激活還可以通過Arrestin-1和Arrestin-2以相反的方式調(diào)節(jié)受體信號(hào)，Arrestin-1降低GPR54介導(dǎo)的ERK磷酸化，Arrestin-2增強(qiáng)ERK磷酸化［49］。在細(xì)胞模型中，GPR54信號(hào)的脫敏是由G蛋白偶聯(lián)受體中絲氨酸／蘇氨酸激酶2和βarrestin介導(dǎo)的結(jié)果［50］。

有研究發(fā)現(xiàn)，使用PLC抑制劑U73122及鈣離子抑制劑Verapamil能夠顯著抑制kisspeptin對(duì)雞卵巢顆粒細(xì)胞孕酮分泌的促進(jìn)作用，提示kisspeptin在雞顆粒細(xì)胞中是通過調(diào)控PLC／Ca2＋來調(diào)控顆粒細(xì)胞孕酮合成的［40］。同時(shí)，在人卵巢顆粒細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，kisspeptin能夠誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度的動(dòng)態(tài)變化，從而調(diào)控顆粒細(xì)胞功能，但具體機(jī)制仍不清楚［46］。另外，kiss1過表達(dá)可顯著增加豬顆粒細(xì)胞中PIK3CG、PIK3C1及PDK1基因的表達(dá)，而顯著降低PI3K信號(hào)通路中FOXO3、TSC2及BAD mRNA水平，說明kisspeptin可能通過激活PI3K信號(hào)通路抑制豬顆粒細(xì)胞凋亡［42］。

綜上所述，kisspeptin刺激GPR54存在多種信號(hào)通路，在不同細(xì)胞類型中，kisspeptin與受體GPR54結(jié)合后可能通過激活不同細(xì)胞內(nèi)通路，從而發(fā)揮生理作用，從一種細(xì)胞類型的信號(hào)通路推斷另一種細(xì)胞類型中的通路信號(hào)可能是行不通的。在卵巢顆粒細(xì)胞中，kisspeptin主要通過PLC／PKC／Ca2＋信號(hào)通路來調(diào)控顆粒細(xì)胞增殖分化、類固醇合成。然而，kisspeptin／GPR54在卵巢顆粒細(xì)胞中是否還存在其他信號(hào)通路仍需要做深入探索。

5 展望

近些年來，雖然大多數(shù)研究主要集中在kisspeptin／GPR54系統(tǒng)在HPG軸中樞調(diào)節(jié)中的功能作用，kisspeptin／GPR54系統(tǒng)在卵泡發(fā)育及顆粒細(xì)胞功能的調(diào)控中發(fā)揮了重要作用，然而kisspeptin／GPR54在其他諸多動(dòng)物卵巢中的分布、定位及生理作用還不清楚。盡管已經(jīng)有充分證據(jù)表明kisspeptin／GPR54系統(tǒng)不僅在卵母細(xì)胞成熟中起著關(guān)鍵作用，而且kisspeptin／GPR54系統(tǒng)可促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞增殖和孕激素的分泌，但其作用機(jī)制目前尚不清楚。另外，除了kisspeptin在卵巢中以內(nèi)分泌或旁分泌的方式調(diào)控卵泡發(fā)育外，近些年也發(fā)現(xiàn)，kisspeptin／GPR54系統(tǒng)通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的表達(dá)增加OHSS患者卵巢血管通透性，提示kisspeptin／GPR54還可能以非類固醇方式調(diào)控卵巢功能［51］。將來可利用卵巢中特定的kiss1／GPR54基因敲除動(dòng)物模型來系統(tǒng)、深入研究kisspeptin／GPR54在卵泡發(fā)育中的作用及調(diào)控機(jī)制。還需要在其他一些尚未開展研究的動(dòng)物當(dāng)中進(jìn)一步探討kisspeptin／GPR54在卵巢中的定位、分布及作用。此外，kisspeptin及受體頡頏劑已開始在治療與女性不育相關(guān)的疾病和男性精子的活力中顯示出巨大的潛力［52］；然而其使用劑量、劑型及注射方式等方面仍需做進(jìn)一步研究。