趙 芳,陳坤琳,邢光東,錢 勇,曹少先,李隱俠,孟春花,張建麗,張 俊,桂紅兵,仲躋峰,王慧利
(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧研究所,南京 210014)
胚胎干細胞(embryonic stem cells,ESCs)是從哺乳動物囊胚內(nèi)細胞團(inner cell mass,ICM)中分離出來的多能性細胞,具有無限增殖、自我更新和分化成所有主要細胞系的能力[1]。在體內(nèi),多能性是胚胎發(fā)育過程中出現(xiàn)的一種短暫狀態(tài);但在體外需要在培養(yǎng)器皿的底部鋪上特殊的培養(yǎng)基質(zhì)才能使ESCs黏附和增殖。在細胞培養(yǎng)基質(zhì)的基礎(chǔ)上通過補充外源性關(guān)鍵因子可以誘導(dǎo)ESCs無限期維持自我更新狀態(tài)及多能性,進而開展胚胎發(fā)生、組織分化、藥物篩選、疾病建模、移植治療及轉(zhuǎn)基因動物工程等科學(xué)研究[2-4]。因此,細胞外基質(zhì)在ESCs培養(yǎng)及研發(fā)應(yīng)用中意義重大。
目前,人和小鼠ESCs的培養(yǎng)常用飼養(yǎng)層細胞,如小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)或無飼養(yǎng)層的細胞外基質(zhì),如基質(zhì)膠(Matrigel),作為細胞外基質(zhì),家畜ESCs的培養(yǎng)體系主要借鑒了人和嚙齒動物ESCs的研究方法。MEFs飼養(yǎng)層的制備需經(jīng)過絲裂霉素C或γ射線照射處理,而Matrigel是從Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤中提取的,主要由層黏連蛋白、Ⅳ型膠原、硫酸肝素蛋白多糖、巢蛋白和生長因子組成。MEFs飼養(yǎng)層和Matrigel在制備過程中均表現(xiàn)出批次間的可變性[5]。在培養(yǎng)人或家畜ESCs時,由于MEFs和Matrigel存在異質(zhì)性及批次不穩(wěn)定性問題,易引發(fā)ESCs分化或癌化[6]。因此,明確培養(yǎng)條件、優(yōu)化細胞外基質(zhì)有助于更精確地探索ESCs自我更新和分化的分子基礎(chǔ)。本試驗設(shè)置了MEFs、Matrigel和 貼附因子(attachment factor,AF)3種細胞培養(yǎng)板,通過分析小鼠ESCs(mESCs)的形態(tài)變化、克隆集落形成及多能性調(diào)控因子的表達,綜合評定3種不同處理對mESCs多能性維持的影響,為建立和優(yōu)化家畜ESCs培養(yǎng)體系提供參考和借鑒。
6周齡SPF級ICR雌性小鼠20只和雄性小鼠3只,購自南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場。小鼠飼養(yǎng)在溫度20~26℃、濕度40%~70%、光照/黑暗12 h/12 h、自由飲水的標準化實驗動物環(huán)境中。
Anti-Sox2(sc17320)、Anti-Oct4(sc5279),購自SantaCruz公司;mLIF(HY-P7084)、絲裂霉素-C(HY-13316),購自MCE公司;PD0325901(S1036)、CHIR99021(S1263),購自Selleck公司;Matrigel(354277,CORNING),購自睿捷生物公司;β-巰基乙醇(M 6250)、小鼠胚胎培養(yǎng)基(KSOM,MR-121-D),購自Sigma生物公司;胎牛血清(SH30396,Hyclone)、Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM,11965-092)、Dulbecco’s Modified Eagle Medium-F12(DMEM-F12,11330-032)、Neurobasal Medium(21103-049)、N2 Supplement(17502-048)、B-27 Supplement(12587-010)、血清替代物(A3181502)、0.05% Trypsin-EDTA(25300-062)、GlutaMAX(35050-061)、非必需氨基酸(11140-050)、Attachment Factor(AF,S006100)、青霉素-鏈霉素(15140-122)、Knock-Out Serum Replacement(A3181502)、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS),購自Thermo Fisher Scientific公司;BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒(C3206),購自碧云天生物公司;血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin,PMSG)、人體絨膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG),購自寧波第二激素廠。
500 mL N2B27細胞培養(yǎng)液的配制:240 mL DMEM/F12 +240 mL Neurobasal+2.5 mL N2 supplement+5 mL B27 supplement+1% GlutaMAX +1% 非必需氨基酸 +0.1 mmol/Lβ-巰基乙醇 +1% 青霉素-鏈霉素 +5% 血清替代物+10 ng/mL mLIF+3μmol/L CHIR99021+1μmol/L PD0325901。
細胞培養(yǎng)箱(型號為Thermo ScientificTM8000),購自賽默飛公司;倒置熒光顯微鏡(Nikon ECLIPSE Ti),購自尼康儀器有限公司。
雌鼠每只腹腔注射10 U PMSG,48 h后注射10 U hCG,與公鼠合籠;合籠第2天觀察雌鼠是否有陰道栓,將見栓雌鼠記為孕0.5天;在孕1.5天,頸椎脫臼法處死合籠雌鼠;打開腹腔取出雙側(cè)輸卵管放于M2操作液中,用32號無菌注射器吸取M2培養(yǎng)液,在體視顯微鏡下小心沖洗輸卵管,收集2-細胞階段胚胎,置于含有5%KSR的KSOM培養(yǎng)液中,于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至囊胚階段;將囊胚接種到預(yù)先鋪有MEFs飼養(yǎng)層的細胞培養(yǎng)板上,添加N2B27細胞培養(yǎng)液,置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3~5 d;在解剖鏡下用拉細的巴斯德吸管小心切割分離內(nèi)細胞團細胞(ICM)集落進行機械傳代;培養(yǎng)2~4 d后,出現(xiàn)克隆狀ESCs集落,稱為第1代(記為P1代),用酶消化法進行分離、傳代,重新接種于新的MEFs飼養(yǎng)層。
將傳代3代以內(nèi)的原代MEFs以1×106/mL密度接種到細胞培養(yǎng)板上,添加適量的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng),等細胞單層覆蓋培養(yǎng)板時用10μg/mL絲裂霉素C處理3 h,用PBS清洗3遍,加入適量N2B27細胞培養(yǎng)液,置于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中,備用。
將40 μL Matrigel加入預(yù)冷的3.5 mL DMEM-F12中,以250μL/孔加入24孔板中,于室溫下孵育2 h。使用前棄去液體,添加N2B27細胞培養(yǎng)液,備用。
將AF以250μL/孔加入到24孔板中,于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育2 h,然后用PBS清洗1遍,添加N2B27細胞培養(yǎng)液,備用。
棄掉細胞培養(yǎng)液,加入PBS清洗細胞。加入4%多聚甲醛,室溫固定15 min;棄掉多聚甲醛,用PBS清洗2次,每孔加入500μL BCIP/NBT染色液,室溫避光染色15 min~2 h,棄掉染色液;加入PBS清洗,用純化水終止染色,于顯微鏡下觀察,拍照。
mESCs以1 000個細胞/孔接種于24孔板,加入含5% KSR的N2B27細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)2 d,在顯微鏡下觀察mESCs集落形成情況并計數(shù)。
用500μL PBS緩慢清洗細胞3次,每次5 min;加入200μL 4%多聚甲醛固定細胞,室溫放置15~30 min;用PBS洗細胞3次,每次5 min;用0.5% Triton X-100通透20 min,PBS洗3次,每次5 min;用封閉液封閉細胞1 h;添加一抗(按照一抗稀釋比例進行稀釋),4℃避光過夜;用PBS清洗3次,每次5 min;添加二抗(按照二抗稀釋比例進行稀釋),室溫避光孵育1 h;PBS清洗細胞3次,每次5 min;加200μL Hoechst 33342避光染色5 min,用PBS清洗細胞,在顯微鏡下觀察,拍照。
根據(jù)NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)基因mRNA全序列,利用Primer premier 5.0軟件設(shè)計引物。引物由擎科生物公司合成,引物序列見表1。采用TRIzol法提取肝臟樣品中的總RNA,用紫外分光光度計檢測RNA質(zhì)量和濃度,進行反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR擴增。被檢樣品均重復(fù)3次,取平均值;以GAPDH作為內(nèi)參基因,利用2-△△Ct法(2-△△Ct表示處理組目的基因的表達量相對于對照組的變化倍數(shù))計算各基因的相對表達量,△Ct =Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因,△△Ct=(Ct處理組目的基因-Ct處理組內(nèi)參基因)-(Ct對照組目的基因-Ct對照組內(nèi)參基因)。
表1 實時熒光定量PCR引物
試驗數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析,采用t檢驗進行比較,以P <0.05表示差異顯著。
見圖1。 由圖1可以看出:從囊胚孵化物(圖1A、B)分離的mESCs細胞排列緊密,呈集落狀生長,克隆呈突起圓頂狀,邊緣遮光性強,與周圍的飼養(yǎng)層細胞界限分明,為Na?ve-ESCs(圖1C~E);AP染色后mESCs細胞克隆呈現(xiàn)紅色,邊緣飼養(yǎng)層細胞未著色作為陰性對照,說明mESCs細胞克隆AP染色陽性(圖1F)。
用含5% KSR的N2B27培養(yǎng)液培養(yǎng)mESCs,分別比較MEFs飼養(yǎng)層、Matrigel及AF細胞培養(yǎng)板對mESCs細胞形態(tài)特征及克隆集落形成的影響,結(jié)果見圖2。
由圖2可以看出:MEFs飼養(yǎng)層能很好地維持mESCs圓頂狀形態(tài);Matrigel處理細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)的mESCs邊緣遮光性好,但形態(tài)不是規(guī)則的圓頂狀;AF細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)的mESCs中有少量mESCs形態(tài)呈扁平狀,類似于Primed狀態(tài)的EpiSCs;另外,AF細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)的mESCs黏附數(shù)量少,形成的集落數(shù)量顯著少于MEFs飼養(yǎng)層和Matrigel細胞培養(yǎng)板。
利用免疫熒光檢測不同處理mESCs中多能性調(diào)控因子Oct4和Sox2蛋白的表達情況,結(jié)果見圖3。
由圖3可以看出,3種不同處理mESCs均檢測到多能性調(diào)節(jié)因子Oct4和Sox2蛋白的表達。
分別收集Matrigel和AF細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)的mESCs,用qRT-PCR檢測mESCs中多能性調(diào)控因子的mRNA表達,結(jié)果見圖4。
由圖4可以看出:Matrigel細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)的mESCs中Oct4 mRNA表達略高于AF,但差異不顯著(P>0.05);而Matrigel細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)的mESCs中Nanog和Sox2的mRNA表達水平顯著或極顯著高于AF(P<0.05或P<0.01)。
ESCs增殖及自我更新需要穩(wěn)定的微環(huán)境,微環(huán)境改變會影響ESCs多能性維持而觸發(fā)分化。細胞外基質(zhì)是干細胞自我更新和增殖的重要微環(huán)境,對細胞外基質(zhì)的優(yōu)化有助于明確ESCs培養(yǎng)必需的微環(huán)境和建立穩(wěn)定的ESCs培養(yǎng)體系。為深入研究和優(yōu)化ESCs培養(yǎng)體系,本試驗對MEFs、Matrigel和AF制作的培養(yǎng)基底進行了比較分析。
目前,MEFs是最常用的干細胞培養(yǎng)基底。MEFs飼養(yǎng)層的優(yōu)勢在于能夠分泌出誘導(dǎo)多能干細胞未分化生長所必需的細胞因子[7]。然而,MEFs飼養(yǎng)層制備要求高,MEFs的代數(shù)、密度及增殖滅活方式均會影響MEFs飼養(yǎng)層質(zhì)量,從而影響細胞因子的分泌。細胞因子表達和分泌的不一致,很難確定哪些成分是在未分化狀態(tài)下支持ESCs所必需的[8]。此外,γ照射飼養(yǎng)層細胞不僅會阻礙其增殖,還會導(dǎo)致細胞凋亡,進而改變可溶性因子的分泌和細胞外基質(zhì)的沉積,這些因素都可能對ESCs的自我更新和一致性培養(yǎng)產(chǎn)生負面影響[9]。因此,MEFs飼養(yǎng)層細胞微環(huán)境的不確定性限制了人們深入解析ESCs生物學(xué)特性的分子機制。本試驗中,MEFs飼養(yǎng)層可以高效制備mESCs,并有效維持mESCs圓頂狀的Na?ve狀態(tài)。然而,對于人類干細胞或家畜干細胞培養(yǎng),MEFs飼養(yǎng)層可能分泌異種物質(zhì)而引發(fā)免疫應(yīng)答和分化[6],因此,建立一種成分明確且穩(wěn)定的細胞外基質(zhì)有助于開展人類干細胞及家畜干細胞的研究及應(yīng)用。
Matrigel是基于無飼養(yǎng)層理念研發(fā)出來并廣泛應(yīng)用于人干細胞體外培養(yǎng)的細胞培養(yǎng)基底。本試驗中,Matrigel細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)的mESCs克隆形態(tài)不是規(guī)則的Na?ve圓頂狀,且克隆集落生成效率慢于MEFs。目前,Matrigel成功用于人類ESCs和PSC誘導(dǎo)培養(yǎng),但不能有效用于牛胚胎干細胞建系及傳代培養(yǎng)[10]。此外,由于MEFs和Matrigel存在異種成分,使得這兩種基底培養(yǎng)的干細胞難以應(yīng)用于臨床治療。AF的主要成分是明膠,本試驗中利用AF包被培養(yǎng)皿后接種mESCs,在5% KSR濃度的N2B27培養(yǎng)液條件下能維持mESCs的增殖和多能性,但有少量mESCs的形態(tài)接近于Primed的扁平狀。
ESCs的自我更新及多能性由復(fù)雜的基因調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)控制,其中轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2和Nanog發(fā)揮至關(guān)重要的作用而被作為ESCs多能性標記。Oct4在ESCs多能性維持中發(fā)揮不可或缺的作用;Oct4水平升高或降低50%,可分別分化為表達內(nèi)胚層、中胚層或滋養(yǎng)外胚層標記的細胞[11]。Sox2通過其高度保守的HMG-box結(jié)構(gòu)域與DNA結(jié)合,與其他多能性調(diào)控因子Oct4和Nanog合作,主要發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用而參與ES細胞多能性及誘導(dǎo)分化調(diào)控[12]。Nanog是胚胎發(fā)育初期在Oct4啟動表達后維持ICM多能性的又一必需基因,Nanog高表達與ESCs多能性的維持緊密相關(guān)。Nanog主要通過與靶基因調(diào)控區(qū)結(jié)合,選擇性抑制分化基因表達或促進多能性基因表達,維持ESCs多能性和自我更新。Nanog與甲基化羥化酶TET1、TET2結(jié)合并調(diào)控其活性,增加Esrrb和Oct4的5-羥甲基化水平,啟動它們的表達以誘導(dǎo)重編程及維持多能性[13]。本試驗中,在含5% KSR的N2B27培養(yǎng)條件下,與Matrigel相比,AF細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)的mESCs中Oct4、Sox2和Nanog的轉(zhuǎn)錄表達均下調(diào)。這一結(jié)果提示AF細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)的mESCs更易于發(fā)生分化。此外,鑒于不同種屬ESCs對培養(yǎng)體系要求不同,如Lif重組蛋白能有效維持mESCs的多能性[14],而生長因子FGF-2在豬、牛胚胎干細胞建系及多能性維持中起重要作用[10,15],如何使Matrigel、AF細胞培養(yǎng)板適用于大家畜胚胎干細胞分離及培養(yǎng),還需要針對ESCs的種屬特性對培養(yǎng)體系進行進一步探索、優(yōu)化。
Matrigel和AF作為細胞外基質(zhì)培養(yǎng)的mESCs具有一定的多能性,傳代后細胞黏附數(shù)量和集落形成數(shù)量少于MEFs基底;此外,AF基底培養(yǎng)的mESCs易于發(fā)生分化,因此,需要在培養(yǎng)體系及細胞傳代密度上有所調(diào)整。