尼羅羅非魚TIRAP基因克隆、組織表達及其在無乳鏈球菌、脂多糖和聚肌胞苷酸刺激下的免疫應(yīng)答

劉潔，高風(fēng)英，盧邁新，陳剛，曹建萌， 劉志剛，王淼，韓雪晴、3

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點實驗室， 廣東 廣州 510380； 2.廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524025； 3.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306)

Toll樣受體家族(Toll-like receptors,TLRs)通過識別病原體相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular pattern)，經(jīng)由下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激活免疫細(xì)胞，在先天性免疫防御病原體中起著重要作用[1-2]。在TLR信號通路中，包含TIR結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白(TIR domain-containing adaptor protein,TIRAP)是第二個被描述的TLR接頭蛋白[3]。有研究表明，在TLR2和TLR4信號通路中，小鼠和人的TIRAP蛋白是髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor88,MyD88)依賴途徑的接頭蛋白[4-5]，通過其TIR結(jié)構(gòu)域與TLRs的TIR結(jié)構(gòu)域相互作用，形成異源二聚體，調(diào)節(jié)下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[4,6]。TIRAP蛋白含有235個氨基酸，包含一個N-末端磷脂酰基醇4,5二磷酸鹽(phoshatidylinositol 4,5-二磷酸鹽，PIP2)結(jié)合區(qū)域和一個C-末端TIR結(jié)構(gòu)區(qū)域，其結(jié)構(gòu)與MyD88不同之處在于缺乏N-末端死亡結(jié)構(gòu)域[3-4]。目前，對TLRs及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究不斷深入，但國內(nèi)外對于TIRAP基因的研究多集中在人[5,7]、牛、雞[8]和小鼠[4]，魚類中僅在草魚Cyprinuscarpio[9]、鯉Ctenopharyngodonidellus[10]、 鮸魚Miichthysmiiuy[11]和斑馬魚Daniorerio[12]中有相關(guān)報道。

羅非魚Oreochromisniloticus是中國淡水養(yǎng)殖的優(yōu)勢品種，養(yǎng)殖產(chǎn)量、產(chǎn)值和出口額均居世界第一位。但病害問題常對羅非魚養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟損失，特別是近年來鏈球菌Streptococcusagalactiae病的暴發(fā)，引起較高死亡率，已嚴(yán)重威脅到羅非魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[13-15]。免疫防治是當(dāng)前魚類病害最理想的控制手段，對魚類免疫相關(guān)的基礎(chǔ)研究至關(guān)重要[16]，因此，研究羅非魚免疫相關(guān)基因，了解羅非魚免疫應(yīng)答過程中的機理十分必要。目前，研究人員對尼羅羅非魚TLR家族的部分成員已進行相關(guān)基因免疫研究[17]。本研究中，首次克隆尼羅羅非魚TIRAP基因的cDNA 全長，分析其在各組織中的表達和病原菌感染和刺激后的誘導(dǎo)表達，旨在為進一步研究TIRAP基因在天然免疫系統(tǒng)中的作用及機制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用健康尼羅羅非魚取自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所高要水產(chǎn)種質(zhì)中心，暫養(yǎng)期間養(yǎng)殖水溫為(30±2)℃，試驗魚體長為10～15 cm，體質(zhì)量為20～40 g。無乳鏈球菌由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點實驗室采集、分離、鑒定并保存，保存于-80 ℃超低溫冰箱中[14]。

試劑：通用型RNA小量提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒均購自美基公司(廣州)；pMD19-T載體、大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime Script Ⅱ1st strand cDNA Synthesis Kit均購自寶生物(大連)工程有限公司；Power SYBR Green Master Mix購自Applied Biosystems公司(美國)；LPS和PolyI:C購自Sigma公司(美國)。引物合成及測序由廣州生工生物工程有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 尼羅羅非魚TIRAP基因全長cDNA的克隆

使用RNA小量提取試劑盒從尼羅羅非魚鰓組織提取總RNA，并用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測其濃度和質(zhì)量。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA。根據(jù)GenBank中尼羅羅非TIRAP基因推測序列(GenBank XM_005474605.4)，利用Premier 5.0分兩段設(shè)計引物TIRAP-sf1-sr1和TIRAP-sf2-sr2進行擴增(表1)，預(yù)計產(chǎn)物長度分別為1 755 bp、2 340 bp。PCR反應(yīng)體系(共50 μL)包括：cDNA模板1.0 μL，20 μmol/L上、下游引物各1.0 μL，10×LA PCR buffer(含Mg2+)5.0 μL，2.5 mmol/L dNTP Mixture 4.0 μL，5 U/μL LA Taq DNA 聚合酶0.5 μL，ddH2O 37.5 μL。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃下預(yù)變性3 min；94 ℃下循環(huán)變性30 s，退火復(fù)性30 s(TIRAPcDNA中間片段和下游片段退火溫度分別為63、55 ℃)，72 ℃下延伸 2 min，共進行35個循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸 10 min，4 ℃下保存。將PCR得到的目的條帶切膠回收，克隆到pMD19-T載體上，隨后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，利用氨芐抗性平板篩選陽性克隆并進行菌液PCR檢測，篩選陽性克隆進行測序。

利用DNAStar軟件中SeqMan對獲得的兩段序列進行拼接，獲得其cDNA序列。根據(jù)所獲得的cDNA序列，利用Premier 5.0設(shè)計一對引物TIRAP-ORF1和TIRAP-ORF2(表1)進行PCR擴增以驗證拼接的準(zhǔn)確性，片段長度為1 036 bp。模板、反應(yīng)體系及條件、膠回收、克隆和測序方法同上。

1.2.2TIRAP基因生物信息學(xué)分析 使用NCBI網(wǎng)站的Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi)程序進行序列同源性分析；使用Vector NTI 8.0等軟件分析該基因的cDNA序列，確定開放閱讀框并推導(dǎo)其氨基酸序列。運用ExPASy ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)在線工具分析該氨基酸序列的理化性質(zhì)，用ExPASy ProtScale(https://web.expasy.org / cgi-bin /protscale/protscale.pl)預(yù)測其疏水性。使用TMpred(embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html)預(yù)測跨膜區(qū)。利用SOPMA在線網(wǎng)站(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預(yù)測蛋白的二級空間結(jié)構(gòu)，利用Phyre2在線網(wǎng)站(http://www.sbg.bio.ic. ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)預(yù)測蛋白的三級空間結(jié)構(gòu)，以在線軟件SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)預(yù)測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。利用軟件Vector NTI 8.0和Clustal Omega Program(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)對尼羅羅非魚及其他物種TIRAP的氨基酸序列進行多重序列比對，使用 MEGA 7 軟件中的鄰接法(Neighbor-Joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.3 人工感染無乳鏈球菌 取暫養(yǎng)的健康尼羅羅非魚60尾，平均分成1個對照組和3個試驗組。將無乳鏈球菌于37 ℃下培養(yǎng)16 h，濃度約為3×109CFU/mL(colonyforming units)，使用磷酸緩沖液(phosphate-buffered saline,PBS)將其稀釋為3×106、3×107、3×108CFU/mL 3個濃度，試驗組腹腔注射200 μL稀釋菌液，對照組注射等量PBS溶液，獲得半致死濃度為3×107CFU/mL。

取個體大小相近的160尾尼羅羅非魚，平均分為兩組，試驗組腹腔注射200 μL(3×107CFU/mL)無乳鏈球菌，對照組注射等體積PBS溶液。注射后0 h、8 h及1、2、3、6、9 d時，取腸、鰓、脾、腎和血5個組織，每個時間點取4尾魚，用液氮速凍后轉(zhuǎn)入-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 LPS和PolyI:C刺激試驗 取個體大小相近的150尾健康尼羅羅非魚個體，平均分成1個對照組和2個試驗組。將LPS和PolyI:C用PBS配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液，2個試驗組分別腹腔注射配制好的LPS和PolyI:C溶液100 μL，對照組注射等體積的PBS溶液。注射后0、8 h及1、2、3、4、5 d時，從2個試驗組分別取腸、肝、脾和腎4個組織，每個時間點取4尾魚，用液氮速凍后轉(zhuǎn)入-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 健康羅非魚基因組織表達樣品采集 隨機選擇暫養(yǎng)的6尾健康尼羅羅非魚個體，取其肝、皮膚、心臟、腎、胃、鰓、腦、脾、腸、血液和肌肉11個組織，用液氮速凍后轉(zhuǎn)入-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 實時熒光定量PCR檢測尼羅羅非魚TIRAP基因組織表達 取出-80 ℃超低溫冰箱中保存的人工感染無乳鏈球菌、LPS、PolyI:C的各組織樣品，分別提取每尾魚各組織樣品RNA，并取1 μg反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為RT-qPCR模板。

定量引物的設(shè)計基于TIRAP的cDNA全長序列(表1)，內(nèi)參基因為翻譯延伸因子基因(elongation factor-1 alpha,EF-1α)[18]，標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作參照高風(fēng)英等[19]的方法，試驗在StepOnePlusTM Real-Time PCR儀上以SYBR Green Ⅰ法進行定量擴增。反應(yīng)體系(共20 μL)包括：cDNA模板1 μL，20 μmol/L上、下游引物各0.3 μL，Power SYBR Green Master Mix 10 μL，去離子水 8.4 μL。PCR反應(yīng)程序為：50 ℃ 下作用2 min；95 ℃下預(yù)變性2 min；95 ℃ 下循環(huán)變性15 s，55 ℃ 下退火復(fù)性30 s，72 ℃ 下延伸1 min，共進行40個循環(huán)。溶解曲線分析：95 ℃下反應(yīng)15 s，60 ℃下反應(yīng)1 min，95 ℃下反應(yīng)15 s。每個待測cDNA樣品設(shè)置3個重復(fù)，每板均設(shè)陰性對照。TIRAP基因相對表達量的計算公式為

F=(a/b)/(c/d)。

其中：a為試驗組中目的基因濃度；b為試驗組中內(nèi)參基因濃度；c為對照組中目的基因濃度；d為對照組中內(nèi)參基因濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析，采用LSD 法進行多重比較，試驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(means±S.E.)表示，顯著性水平設(shè)為 0.05。

表1 試驗所用引物Tab.1 Primers used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 尼羅羅非魚TIRAP基因的cDNA序列分析

運用分段擴增技術(shù)得到尼羅羅非魚TIRAPcDNA序列全長為3913 bp，5′端非翻譯區(qū)(5′UTR)長度為137 bp，3′端非翻譯區(qū)(3′UTR)長度為2 900 bp，開放閱讀框序列(ORF)為876 bp，編碼291個氨基酸殘基(圖1)。預(yù)測其蛋白相對分子質(zhì)量為32 650，理論等電點(pI)為6.59。用ProtParam在線工具分析可得，TIRAP分子中帶負(fù)電荷的氨基酸殘基(Asp+Glu)有29個，帶正電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys)有27個，脂肪族指數(shù)為74.02，預(yù)測其不穩(wěn)定指數(shù)為66.06，劃分為不穩(wěn)定蛋白。疏水性分析顯示，TIRAP氨基酸序列親水性平均值為-0.480，屬于親水性蛋白，且在第31位達到最高疏水性，疏水指數(shù)為1.944；第457位達到最高親水性，親水指數(shù)為-2.844。用TMpred軟件分析發(fā)現(xiàn)，TIRAP蛋白第26～46位氨基酸之間存在21個由膜內(nèi)向膜外的跨膜氨基酸，在第27～45位氨基酸間存在19個由膜外向膜內(nèi)的跨膜氨基酸。用SOPMA預(yù)測TIRAP的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，116個氨基酸殘基呈現(xiàn)α-螺旋結(jié)構(gòu)(占肽鏈氨基酸總數(shù)的39.86%)，31個氨基酸殘基呈延伸鏈結(jié)構(gòu)(占10.65%)，19個氨基酸殘基呈β-折疊結(jié)構(gòu)(占6.53%)，125個氨基酸殘基呈無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)(占42.96%)。用Phyre2構(gòu)建尼羅羅非魚TIRAP蛋白可能的三級結(jié)構(gòu)模型如圖2(a)所示。運用SMART在線工具對尼羅羅非魚TIRAP蛋白的二級結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測，結(jié)果顯示，該蛋白第77～217位氨基酸處存在TIR結(jié)構(gòu)域(圖2(b))。

2.2 氨基酸序列比對及系統(tǒng)進化分析

TIRAP氨基酸序列的比對分析顯示，在TIR結(jié)構(gòu)域3信號框(Signaling Box)的典型結(jié)構(gòu)中，參與比對的哺乳類TIRAP蛋白TIR結(jié)構(gòu)域Box1、Box2、Box3基本一致，與魚類保守區(qū)域存在差異(圖3)。Blast分析顯示，尼羅羅非魚TIRAP蛋白和其他魚類TIRAP蛋白序列具有較高的相似性，其中與快樂東方鯛AstatotilapiacallipteraTIRAP的一致性最高，為92.78%，與斑馬宮麗魚Maylandiazebra的一致性也較高，為92.44%，與斑馬魚、小鼠、人和牛的一致性較低，分別為40.55%、42.86%、39.56%和40.21%(圖4)。系統(tǒng)進化分析結(jié)果顯示，尼羅羅非魚與快樂東方鯛、斑馬宮麗魚聚為一簇，親緣關(guān)系較近(圖4)。

2.3 尼羅羅非魚TIRAP基因的組織表達

2.3.1 健康尼羅羅非魚TIRAP基因的組織表達分析 尼羅羅非魚胃、腎、肝、鰓、皮膚、腸、腦、心臟、血液、脾和肌肉中TIRAP基因均有表達，但表達量存在顯著性差異(P<0.05)；以胃中的TIRAP表達量作為對照，肌肉和脾臟中的TIRAP表達量最高，分別為對照組的12.85和4.43倍；胃和腎臟中的表達量顯著低于皮膚、腸、腦、心臟、血液、脾和肌肉組織(P<0.05)(圖5)。

2.3.2 人工感染無乳鏈球菌后TIRAP基因的表達變化 從圖6可見：尼羅羅非魚腸、鰓和腎中TIRAP的表達量呈現(xiàn)先上調(diào)再下調(diào)的趨勢，感染后1 d時其表達量均達到最大值(P<0.05)，分別為對照組的4.56、1.49和3.30倍；脾和血液中TIRAP的表達量呈現(xiàn)波動式變化，均在感染后1 d時表達量出現(xiàn)顯著下調(diào)(P<0.05)，感染后2 d時表達量回升，感染后3～9 d時表達量呈下調(diào)趨勢。

2.3.3 LPS刺激后TIRAP基因的表達變化 從圖7可見：尼羅羅非魚腸中TIRAP的表達量3 d后呈現(xiàn)下調(diào)趨勢；肝臟和腎中TIRAP的表達量均在注射后8 h時達到最大值，分別為對照組的2.87和4.13倍；脾中TIRAP的表達量總體呈上調(diào)趨勢，注射1 d時達到最大值，為對照組的2.51倍。

2.3.4 PolyI:C刺激后TIRAP基因的表達變化 從圖8可見：腸中TIRAP的表達量呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，注射后8 h時達到最小值；肝臟、脾臟和腎臟中TIRAP的表達量均在注射后1 d時達到最大值，分別為對照組的5.04、1.97、2.78倍，整體呈現(xiàn)波動式變化趨勢。

3 討論

3.1 尼羅羅非魚TIRAP基因的序列特征

本研究中克隆獲得了尼羅羅非魚TIRAP基因的cDNA序列，全長為2 900 bp，包含完整的ORF，可編碼291個氨基酸。序列分析表明，尼羅羅非魚TIRAP與Toll樣受體一樣含有TIR結(jié)構(gòu)域，推測當(dāng)受體胞外區(qū)和配體結(jié)合后，導(dǎo)致Toll樣受體胞內(nèi)區(qū)通過TIR-TIR結(jié)構(gòu)域的相關(guān)作用而俘獲TIRAP接頭蛋白[20]。 研究表明，哺乳動物TIRAP可作為TLR2、TLR4與MyD88間的橋梁，參與信號傳導(dǎo)并激活下游轉(zhuǎn)錄因子[4-5,7]。Liu等[12]發(fā)現(xiàn)，斑馬魚TIRAP的過表達未能激活人胚腎細(xì)胞293T中的NF-κB(nuclear factor-kappa B)，但可輕微激活鯉白細(xì)胞中NF-κB，這是由于斑馬魚與人類TIRAP的N末端氨基酸差異及斑馬魚Box2中保守的脯氨酸突變?yōu)榱涟彼?，從而?dǎo)致其功能障礙。尼羅羅非魚Box2中脯氨酸未發(fā)生突變，推測未影響其對NF-κB激活的功能。Xu等[11]研究表明，鮸TIRAP無法激活293T細(xì)胞中的NF-κB報告基因，但可通過與MyD88相互作用在TLR1信號通路中激活NF-κB。此外，Shan等[10]發(fā)現(xiàn)，鯉TLR8可能募集TIRAP接頭蛋白并在免疫應(yīng)答中激活活化蛋白1(activator protein 1,AP-1)通路。上述研究表明，不同魚類TIRAP參與的TLRs信號通路及其功能可能存在不同。同源性比較和系統(tǒng)進化分析顯示，在魚類中，尼羅羅非魚TIRAP與快樂東方鯛及斑馬宮麗魚TIRAP相似性最高，一致性分別為92.78%和92.44%，在進化上表現(xiàn)出一定的保守性。

3.2 尼羅羅非魚TIRAP基因在免疫應(yīng)答中的表達分析

RT-qPCR檢測表明，尼羅羅非魚TIRAP在檢測的各個組織中均有表達，表明其在多種組織中起作用。各組織表達的差異，表明TIRAP在不同器官中起作用不同。在肌肉中其表達量最高，其次為脾臟和血液，在胃和腎中的表達量較低。在肌肉中高表達可能暗示尼羅羅非魚TIRAP基因已經(jīng)獲得了非特異信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能[20-21]。此外，TIRAP在非免疫組織肌肉中的高表達，說明其并不僅限于在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮作用，也可能具有調(diào)控肌肉生長的生物學(xué)功能，這還有待進一步研究證實。在周作勇[8]的研究中也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，雞TIRAP在肌肉中的表達高于肝臟、腎臟和腸道等免疫組織和器官。脾臟和血液在魚類免疫中發(fā)揮著重要的作用，分別是魚體中重要的免疫器官和免疫場所[22]。在斑馬魚脾臟中TIRAP也有較高的表達量[12]。免疫相關(guān)基因在脾臟和血液中存在較高的表達水平在以往的研究中也有所報道，在尼羅羅非魚的11個組織中，脾臟和血液中TRIM16和TRIM25均有較高水平表達量[23]。以上結(jié)果提示，TIRAP基因與這些組織器官中的免疫應(yīng)答過程密切相關(guān)。

TIRAP作為一類重要的銜接蛋白，在MyD88依賴型信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中具有重要作用。本研究中通過用革蘭氏陽性菌(無乳鏈球菌)、革蘭氏陰性菌(LPS)和病毒類似物(PolyI:C)作為病原體對尼羅羅非魚進行人工感染和刺激，研究了TIRAP基因在免疫組織中mRNA水平的定量表達模式。結(jié)果表明，這3種不同的病原均可引起尼羅羅非魚TIRAP基因的表達變化，而每種組織的基因表達模式并不相同。由于不同組織中存在的免疫細(xì)胞種類差異，如吞噬細(xì)胞中的粒細(xì)胞主要分布在脾臟中，腸道中主要有上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和杯狀細(xì)胞，因此，在受到不同病原刺激后，各組織中的免疫細(xì)胞可能處于不同的防御狀態(tài)，導(dǎo)致TIRAP基因在不同組織中的表達模式存在差別[24]。人工感染無乳鏈球菌后，尼羅羅非魚脾臟和血液中TIRAP的表達量表現(xiàn)出上升和下降交替，腸、鰓和腎中TIRAP的表達量呈現(xiàn)先上升再下降的表達譜。高風(fēng)英等[19]的研究中也發(fā)現(xiàn)，尼羅羅非魚人工感染無乳鏈球菌后，鰓、腎、心臟和脾臟中β2m基因的表達呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。推測是一種免疫系統(tǒng)的自我保護與自我調(diào)整，當(dāng)表達量升高到一定程度，機體會通過免疫負(fù)調(diào)控降低其表達量，避免因免疫調(diào)控因子過度表達引起對機體的傷害[18]。

本研究顯示，受LPS刺激后，TIRAP在肝臟、脾臟和腎臟中的表達呈先上升再下降的趨勢，TIRAP基因表達先上調(diào)，以誘導(dǎo)干擾素表達抵抗LPS入侵，之后表達下調(diào)可能是因為細(xì)菌為逃避宿主先天免疫防御的作用效果，同時LPS也下調(diào)了TIRAP在腸中的表達。丁少青[25]也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，東北七鰓鰻Lethenteronmorii受銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa(G-)感染后，TLR2d基因在腸中的表達量呈下降趨勢，在感染后12、48 h時降到最低值。有研究表明，包含腸黏膜在內(nèi)的魚類黏膜系統(tǒng)，可能相對于包含傳統(tǒng)免疫器官如頭腎、脾臟等的系統(tǒng)在免疫過程中具有一定的自主性和獨立性[26]。在腸中的下調(diào)趨勢說明TIRAP基因參與了尼羅羅非魚對LPS的響應(yīng)，但可能是負(fù)調(diào)控機制。

PolyI:C為雙鏈RNA的類似物，可以刺激魚類的非特異性免疫。PolyI:C能明顯上調(diào)尼羅羅非魚TIRAP在肝臟、脾臟和腎中的表達，這與赤眼鱒Squaliobarbuscurriculus受病毒刺激后MyD88的反應(yīng)相似[27]。而在腸中的表達呈顯著下調(diào)趨勢，同樣是接頭蛋白的TRIF，青島文昌魚Branchiostomabelcheritsingtauense應(yīng)對PolyI:C刺激后，腸中TRIF的表達呈波動式變化，在注射后72 h表達量達到最高[28]。這可能與宿主不同相關(guān)，同時，這也可能是這兩個接頭分子受到不同Toll樣受體刺激后信號傳導(dǎo)差異的結(jié)果。這些結(jié)果表明，無乳鏈球菌感染及LPS和Poly I:C刺激均能引起TIRAP基因表達變化，但時間點、反應(yīng)強度有較大差異。尼羅羅非魚TIRAP參與了細(xì)菌和病毒相關(guān)的免疫應(yīng)答反應(yīng)，暗示其在宿主抵御病原入侵過程中可能發(fā)揮重要作用。

4 結(jié)論

1)使用反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)克隆獲得了尼羅羅非魚TIRAPcDNA全長為2 900 bp，發(fā)現(xiàn)尼羅羅非魚TIRAP具有TIR結(jié)構(gòu)域。

2)TIRAP基因在健康尼羅羅非魚肌肉和脾臟中的表達量最高。

3)無乳鏈球菌、LPS和Poly I:C刺激均能誘導(dǎo)TIRAP基因表達，表明TIRAP在先天免疫屏障中發(fā)揮作用，參與了尼羅羅非魚抗病免疫反應(yīng)。