傳染性胰臟壞死病酵母展示疫苗的免疫效果評(píng)價(jià)

董瑩，賀文斌，趙景壯，任廣明，盧彤巖，邵軼智，徐黎明、4*

(1.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306； 2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070； 3.上海海洋大學(xué) 國(guó)家水生動(dòng)物病原庫(kù)，上海 201306； 4.黑龍江省水生動(dòng)物病害與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150070)

傳染性胰臟壞死病(Infectious pancreatic necrosis,IPN)是一種高致病性的病毒性疾病，主要感染虹鱒Oncorhynchusmykiss、河鱒SalmofarioLinnaeus、大西洋鮭Salmonsalar等鮭科魚類的魚苗和稚魚[1]，死亡率可達(dá)到90%以上，實(shí)際生產(chǎn)中給鮭鱒魚養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。傳染性胰臟壞死病毒(Infectious pancreatic necrosis virus,IPNV)是IPN的病原，廣泛流行于歐洲、亞洲、美國(guó)等地[3]，中國(guó)的山西[2]、山東[4]、四川[5]、云南[6]等地均有IPN暴發(fā)的報(bào)道。IPNV是無(wú)囊膜的雙鏈RNA病毒，被歸類為雙RNA病毒科Birnaviridae水生雙RNA病毒屬Aquabirnavirus[7]，具有雙節(jié)段基因組，即A片段和B片段。A片段編碼VP2、VP3、VP4和VP5蛋白，B片段編碼VP1蛋白[8]。VP2蛋白是IPNV的結(jié)構(gòu)蛋白之一，是IPNV的重要保護(hù)性抗原[9]。

IPNV因其廣泛的流行性和致病性，被許多國(guó)家列為進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫對(duì)象。中國(guó)對(duì)于IPN尚無(wú)有效的防治藥物。疫苗接種是公認(rèn)的控制養(yǎng)殖動(dòng)物疾病的安全高效途徑，目前，關(guān)于IPNV疫苗的研究報(bào)道主要集中在DNA疫苗[10]、減毒疫苗[11]、滅活疫苗[12]和亞單位疫苗[13]方面，所采用的免疫方式主要為注射法。由于魚類生活在水中，群體量大，實(shí)際生產(chǎn)中注射免疫可操作性較低，且不適于小魚的群體免疫?？诜庖咴趯?shí)際操作中簡(jiǎn)單方便、不損傷機(jī)體，能降低動(dòng)物的應(yīng)激反應(yīng)，可免疫不同生長(zhǎng)階段的水生動(dòng)物。因此，制備口服疫苗預(yù)防IPNV感染具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

釀酒酵母能將抗原蛋白展示于酵母細(xì)胞表面，是一種理想的制備口服疫苗的載體。目前已有關(guān)于病毒的酵母展示疫苗的研究報(bào)道，如利用酵母表面展示技術(shù)(Yeast display technology)制備的傳染性造血器官壞死病毒[14](infectious haematopoietic necrosis virus,IHNV)和草魚呼腸孤病毒[15](grass carp reovirus,GCRV)的口服疫苗。本課題組于2013年從中國(guó)云南某養(yǎng)殖場(chǎng)患病虹鱒體內(nèi)分離獲得一株IPNV，命名為ChRtm213[6]，該毒株基因型為genogroup 1，屬于中國(guó)現(xiàn)行IPNV流行毒株[8]，本課題組前期利用酵母展示系統(tǒng)將IPNV ChRtm213的表面蛋白VP2展示在酵母細(xì)胞表面，構(gòu)建了重組酵母疫苗株[16]。本研究中以虹鱒為試驗(yàn)動(dòng)物，對(duì)該疫苗株誘導(dǎo)虹鱒免疫反應(yīng)能力及保護(hù)效力進(jìn)行了檢測(cè)與分析，同時(shí)對(duì)不同的免疫方案進(jìn)行了比較，以期為該口服疫苗的實(shí)際應(yīng)用提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

IPNV ChRtm213毒株為劉淼等[6]從云南某虹鱒養(yǎng)殖場(chǎng)中分離，并由黑龍江省水生動(dòng)物病害與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存(以下簡(jiǎn)稱本實(shí)驗(yàn)室)。虹鱒體質(zhì)量為(5±1)g，購(gòu)自本溪艾格莫林實(shí)業(yè)有限公司。大鱗大麻哈魚胚胎細(xì)胞(Chinook salmon embryo cells，CHSE-214)由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所魚類病害教研室曾令兵研究員惠贈(zèng)，亮氨酸和色氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型的釀酒酵母菌株EBY100和酵母展示載體pYD1(Invitrogen Life Technologies，V835-01)由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所黃倢研究員惠贈(zèng)；IPNV酵母展示疫苗株EBY100/pYD1-VP2、空載體酵母EBY100/pYD1[16]和鼠抗IPNV VP2蛋白多克隆抗體[17]由本實(shí)驗(yàn)室制備保存。山羊抗鼠IgG抗體(Cy3)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;TRIzol Reagent購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；One Step SYBR PrimeScript PLUS RT-PCR試劑盒(Perfect Real Time)購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 疫苗株最佳誘導(dǎo)時(shí)間 通過(guò)平板劃線分離法，將本實(shí)驗(yàn)室-80 ℃下保存的疫苗株EBY100/pYD1-VP2，用含0.01%亮氨酸的酵母氮源酪蛋白選擇培養(yǎng)基(不含色氨酸)在平板中30 ℃下培養(yǎng)2 d，挑取單菌落接種于含2%葡萄糖的酵母氮源酪蛋白氨基酸液體培養(yǎng)基(YNB-CAA)中，30 ℃下過(guò)夜培養(yǎng)。將菌液離心收集酵母細(xì)胞，加入含2%半乳糖的YNB-CAA培養(yǎng)基混勻至細(xì)胞懸液，調(diào)整培養(yǎng)菌液至OD600 nm=0.5～1.0，于30 ℃下誘導(dǎo)表達(dá)IPNV VP2蛋白。誘導(dǎo)后于0、24、36、48、60 h離心收集酵母細(xì)胞。用PBS溶液洗滌酵母細(xì)胞3次，將鼠抗VP2蛋白抗體稀釋1 000倍作為一抗，加入酵母細(xì)胞混勻，37 ℃下孵育1 h，使用PBS溶液洗滌細(xì)胞。將山羊抗鼠IgG抗體(Cy3)稀釋500倍作為二抗，37 ℃下孵育1 h。離心收集孵育后的細(xì)胞，用PBS溶液洗滌，用于細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)和流式細(xì)胞儀分析。取少量酵母細(xì)胞滴于載玻片，置于倒置熒光顯微鏡下(DMi8，Leica)檢測(cè)免疫熒光信號(hào)，使用Image J軟件分析10個(gè)顯微鏡視野下IPNV VP2陽(yáng)性酵母細(xì)胞比例。同時(shí)，將剩余酵母細(xì)胞用PBS制備成細(xì)胞懸液，用流式細(xì)胞分選儀(FACSAria，BD)測(cè)定細(xì)胞懸液的熒光強(qiáng)度，對(duì)每個(gè)樣本中的10 000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分析。

1.2.2 疫苗制備及口服免疫 將EBY100/pYD1-VP2疫苗株接種至150 mL 2%葡萄糖YNB-CAA液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，根據(jù)“1.2.1節(jié)”的誘導(dǎo)方法表達(dá)VP2蛋白，離心收集酵母細(xì)胞。將誘導(dǎo)的新鮮酵母細(xì)胞EBY100/pYD1-VP2和空載體酵母細(xì)胞EBY100/pYD1懸于PBS中，制備成終濃度為1×1010CFU/mL的酵母懸液。將健康虹鱒隨機(jī)分為5組，即疫苗株單次免疫組、疫苗株多次免疫組、空載體酵母單次免疫組、空載體酵母多次免疫組和PBS模擬免疫組，每組300尾。單次免疫組為連續(xù)口服免疫7 d，多次免疫組為單次免疫后間隔一周再次連續(xù)免疫7 d。用1% MS-222溶液輕度麻醉虹鱒后，每天口灌免疫劑量為100 μL酵母懸液。

1.2.3 免疫相關(guān)基因的RT-qPCR分析 免疫結(jié)束后第7、14、21天從各試驗(yàn)組隨機(jī)抽取5尾虹鱒，用過(guò)量MS-222殺死，采集頭腎和后腸組織。用TRIzol Reagent提取各組織總RNA，并用分光光度計(jì)分析以保證RNA的純度和濃度。分別以提取的RNA為模板，以β-actin管家基因作為內(nèi)參，使用One Step SYBR PrimeScript PLUS RT-PCR試劑盒，并根據(jù)說(shuō)明書進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，以定量分析IgM[18]、IgT[19]、CD4[20]和CD8[21]基因的表達(dá)水平，并采用2-ΔΔCT方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量，以PBS模擬免疫組的虹鱒組織RNA為空白對(duì)照。

1.2.4 中和抗體效價(jià)測(cè)定 利用中和抗體試驗(yàn)測(cè)定各試驗(yàn)組虹鱒血清中IPNV中和抗體的效價(jià)。即在免疫結(jié)束后第21、49、70天時(shí)分別從各組挑取20尾虹鱒，從魚尾靜脈采集血液，將血液于4 ℃下靜置過(guò)夜至凝結(jié)，以500×g離心10 min收集血清，-80 ℃下暫時(shí)保存。將待測(cè)血清(50 μL)在96孔板上進(jìn)行二倍系列稀釋，與IPNV懸液(200 TCID50,50 μL)混合，加入96孔板中CHSE-214單層細(xì)胞上，15 ℃下培養(yǎng)1 h后換成新鮮培養(yǎng)基，15 ℃下培養(yǎng)7 d。以抑制50%細(xì)胞病變的血清最高稀釋倍數(shù)的倒數(shù)作為血清中和抗體效價(jià)。

1.2.5 IPNV攻毒試驗(yàn)及病毒載量測(cè)定 虹鱒口服免疫結(jié)束后第14、21天，取各組虹鱒用MS-222溶液進(jìn)行輕度麻醉，腹腔注射100 μL 100 TCID50/mL IPNV病毒懸液，然后置于獨(dú)立的循環(huán)水養(yǎng)殖魚缸中(15 ℃)，每組30尾，設(shè)3個(gè)平行。同時(shí)設(shè)置PBS模擬攻毒組。在攻毒后第14天，分別采集各組虹鱒頭腎、脾臟和肝臟的組織勻漿混合后提取RNA作為模板，以β-actin管家基因作為內(nèi)參，采用RT-qPCR測(cè)定疫苗株單次免疫組、疫苗株多次免疫組、空載體酵母單次免疫組和空載體酵母多次免疫組虹鱒VP1和VP2基因的表達(dá)水平，以PBS模擬攻毒組虹鱒組織RNA為空白對(duì)照。采用2-ΔΔCT方法計(jì)算VP1和VP2基因相對(duì)表達(dá)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示。使用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行多因素方差分析，采用Tukey法進(jìn)行多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 疫苗株最佳誘導(dǎo)時(shí)間

2.1.1 酵母細(xì)胞表面VP2蛋白的細(xì)胞免疫熒光檢測(cè) 通過(guò)細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)酵母細(xì)胞表面IPNV VP2蛋白的表達(dá)情況。試驗(yàn)中收集不同時(shí)間點(diǎn)的酵母細(xì)胞，依次與鼠抗IPNV VP2多克隆抗體和Cy3標(biāo)記的二抗孵育后，觀察誘導(dǎo)酵母菌株熒光情況。結(jié)果顯示，EBY100/pYD1-VP2酵母細(xì)胞在誘導(dǎo)24、36、48、60 h后均出現(xiàn)特異性紅色熒光(圖1)。利用Image J軟件對(duì)免疫熒光鏡檢視野(n=10)進(jìn)行分析可知，EBY100/pYD1-VP2中熒光酵母細(xì)胞比例隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)而增加，誘導(dǎo)24、36、48、60 h時(shí)熒光酵母細(xì)胞比例平均值分別為12.7%、33.2%、61.5%、91.3%，且各組間熒光酵母比例有顯著性差異(P<0.05)(圖1)。

2.1.2 酵母細(xì)胞表面VP2蛋白的流式細(xì)胞儀分析

為進(jìn)一步確定EBY100/pYD1-VP2疫苗株的最佳誘導(dǎo)時(shí)間，將誘導(dǎo)時(shí)間不同的酵母細(xì)胞分別用鼠抗IPNV VP2多克隆抗體和Cy3標(biāo)記的二抗進(jìn)行孵育，利用流式細(xì)胞儀對(duì)酵母熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析，以未誘導(dǎo)的酵母細(xì)胞(誘導(dǎo)0 h)作為陰性對(duì)照。結(jié)果顯示，EBY100/pYD1-VP2酵母的熒光強(qiáng)度與誘導(dǎo)時(shí)間呈正比，0、24、36、48、60 h酵母細(xì)胞的熒光強(qiáng)度分別為712、351 0、712 6、11 717、14 329，且各時(shí)間點(diǎn)間有顯著性差異(P<0.05)(圖2)。

綜合考慮細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)結(jié)果和流式細(xì)胞儀分析結(jié)果，本研究中選取60 h 作為EBY100/pYD1-VP2疫苗株的最佳誘導(dǎo)時(shí)間。

2.2 免疫相關(guān)基因的定量分析

2.2.1 RT-qPCR定量評(píng)估IgM和IgT基因表達(dá) 通過(guò)RT-qPCR定量測(cè)定各組虹鱒中頭腎和后腸組織中IgM、IgT基因的表達(dá)量，以PBS模擬免疫組的虹鱒組織RNA作為空白對(duì)照。從圖3可見(jiàn)：在各個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，EBY100/pYD1-VP2免疫組虹鱒頭腎和后腸中的IgM和IgT基因表達(dá)水平均顯著高于空載體酵母免疫組(P<0.05)；疫苗株多次免疫組虹鱒頭腎和后腸的IgM和IgT基因表達(dá)水平顯著高于單次免疫組(P<0.05)；在多次免疫后14 d，IgM和IgT基因在頭腎和后腸組織的上調(diào)倍數(shù)達(dá)到最高，分別為空載體酵母多次免疫組的9.8、6.1倍(IgM)和7.9、11.7倍(IgT)。

2.2.2 RT-qPCR定量評(píng)估CD4和CD8基因表達(dá)

為評(píng)估口服酵母疫苗對(duì)介導(dǎo)T細(xì)胞免疫應(yīng)答情況,通過(guò)RT-qPCR方法定量測(cè)定了各組虹鱒頭腎和后腸組織CD4、CD8基因的表達(dá)量，以PBS模擬免疫組的虹鱒組織RNA作為空白對(duì)照。從圖4可見(jiàn)：與空載體酵母免疫組相比，在各個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，免疫EBY100/pYD1-VP2的虹鱒頭腎和后腸中CD4和CD8基因均上調(diào)表達(dá)(P<0.05)，且多次免疫組的CD4和CD8基因表達(dá)量顯著高于單次免疫組(P<0.05)；在多次免疫后第21天時(shí)CD4和CD8基因在頭腎和后腸組織中的上調(diào)倍數(shù)達(dá)到最高水平，分別為空載體酵母多次免疫組的8.7、7.6倍(CD4)和8.5、7.9倍(CD8)。

2.3 中和抗體效價(jià)

在免疫后第21、49、70天時(shí)，對(duì)各組虹鱒血清中IPNV中和抗體水平進(jìn)行評(píng)估。從圖5可見(jiàn)：各個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn),疫苗株多次免疫組的IPNV中和抗體水平顯著高于疫苗株單次免疫組(P<0.05)；在免疫后第49天時(shí)，疫苗株單次免疫組和多次免疫組虹鱒血清IPNV中和抗體效價(jià)達(dá)到最高水平，分別為32.15和39.28；在免疫后第70天時(shí)血清中IPNV中和抗體水平明顯下降;空載體酵母免疫組和PBS模擬免疫組血清中未檢出IPNV中和抗體。

2.4 IPNV病毒載量

利用RT-qPCR測(cè)定各組虹鱒攻毒后頭腎、肝臟和脾臟混合組織樣品中VP1和VP2基因表達(dá)量，以PBS模擬攻毒組虹鱒組織RNA為空白對(duì)照。從圖6可見(jiàn)：在第14、21天時(shí)，空載體酵母免疫組虹鱒組織中VP1和VP2基因表達(dá)量均顯著高于疫苗免疫組(P<0.05)，其中空載體酵母單次和多次免疫組VP1基因表達(dá)量分別為疫苗株單次和多次免疫組的95、202倍和90、280倍，空載體酵母單次和多次免疫組VP2基因表達(dá)量分別為疫苗株單次和多次免疫組的90、237倍和83、220倍；在第14、21天，疫苗株單次免疫組VP1和VP2基因的表達(dá)量顯著高于疫苗株多次免疫組(P<0.05)，疫苗株單次免疫組為疫苗株多次免疫組的2.25、3.33倍(VP1)和2.67、2.80倍(VP2)。本研究結(jié)果表明，該酵母口服疫苗可使虹鱒體內(nèi)的病毒載量顯著降低(P<0.05)，且多次免疫具有更強(qiáng)的抗病毒效果，各組攻毒虹鱒未出現(xiàn)IPNV病理性死亡。

3 討論

3.1 中國(guó)IPN口服疫苗研究現(xiàn)狀

IPNV是一種高傳染性、高致死率的病原體，對(duì)鮭鱒水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。對(duì)魚類病毒性疾病來(lái)說(shuō)，疫苗是一種安全、高效的理想防控藥物。目前全球只有挪威有一種IPN商業(yè)化疫苗為亞單位疫苗，該商業(yè)化亞單位疫苗主要針對(duì)Sp血清型IPNV，而中國(guó)現(xiàn)行IPNV毒株并非全是SP血清型。因此，中國(guó)IPN的有效防控只能依靠疫苗的自主研發(fā)，無(wú)法引進(jìn)國(guó)外商業(yè)化疫苗。目前，漁用疫苗的免疫方式主要包括口服免疫、腹腔或肌肉注射免疫和浸泡免疫?？诜呙缈刹僮餍詮?qiáng)，過(guò)程簡(jiǎn)單方便，利于多次免疫，適合魚苗的大規(guī)模免疫，可減小勞動(dòng)強(qiáng)度，并且避免注射帶來(lái)的疼痛和應(yīng)激反應(yīng)，尤其對(duì)于幼齡魚，口服免疫帶來(lái)的便利和安全更為顯著[22]。另外，口服免疫需要的免疫劑量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于浸泡免疫，降低了經(jīng)濟(jì)成本[23]。本研究領(lǐng)域已見(jiàn)口服免疫預(yù)防IPN的報(bào)道，并取得了一定的效果。如張英[24]利用植物乳桿菌制備了IPNV(Sp血清型)VP2-VP3重組亞單位口服疫苗，Ahmadivand等[25]采用殼聚糖/三聚磷酸鹽(CS-TPP)納米顆粒和海藻酸鹽包被IPNV(Sp血清型)核酸疫苗制備了口服疫苗。

3.2 IPN酵母展示疫苗的免疫效果評(píng)價(jià)

酵母表面展示系統(tǒng)是可以將外源蛋白展示在酵母表面的一種真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，主要包括a凝集素和α凝集素展示系統(tǒng)，外源蛋白通過(guò)結(jié)合酵母細(xì)胞壁蛋白形成融合蛋白錨定并表達(dá)于酵母細(xì)胞表面[26]。釀酒酵母能將抗原蛋白展示于酵母菌表面，是一種較好的制備口服疫苗的載體[27]?？诜呙缤ㄟ^(guò)胃腸黏膜進(jìn)行抗原遞呈，能有效地誘導(dǎo)黏膜免疫和全身的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生免疫保護(hù)作用[28]。IgM和IgT免疫球蛋白在保護(hù)性免疫中起著重要作用[18]。

CD4+和CD8+T細(xì)胞是消除細(xì)胞內(nèi)病毒感染的最重要免疫手段[21]。目前相關(guān)研究中，Zhu等[29]利用酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)成功地在酵母菌表面表達(dá)了哈氏弧菌的血溶素，口服免疫魚類保護(hù)率可達(dá)60%。Zhao等[14]通過(guò)改進(jìn)的酵母表面展示技術(shù)研發(fā)了IHNV口服酵母疫苗，該重組酵母可刺激虹鱒后腸、脾臟和頭腎中IFN-1、Mx-1、IgM、IgT、CD4和CD8上調(diào)表達(dá)，保護(hù)率為48%。以上結(jié)果均表明，將目的蛋白展示于酵母細(xì)胞表面然后口服免疫試驗(yàn)動(dòng)物可起到不同程度的免疫保護(hù)作用。

目前，本課題組前期克隆了IPNV主要抗原蛋白基因VP2，將其構(gòu)建到了酵母展示載體pYD1上構(gòu)建了酵母疫苗株。本研究中利用細(xì)胞免疫熒光結(jié)合流式細(xì)胞儀分析技術(shù)，確定了該疫苗株的最佳誘導(dǎo)時(shí)間，保證所制備的酵母展示足夠的VP2抗原蛋白用于虹鱒的口服免疫，結(jié)果顯示，VP2蛋白的表達(dá)水平在誘導(dǎo)60 h后達(dá)到峰值。本課題組曾對(duì)該疫苗株的最佳誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行了探索，所設(shè)置的最長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間為48 h，且發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)48 h的酵母VP2蛋白表達(dá)水平顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)。本研究中，筆者進(jìn)一步延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間至60 h，結(jié)果表明，表達(dá)VP2的酵母細(xì)胞比例顯著提高，且達(dá)到90%以上，完全能夠滿足試驗(yàn)需求。因此，本研究中選擇60 h為該疫苗株的最佳誘導(dǎo)時(shí)間。

為了建立合理的口服給藥方案，本研究中通過(guò)單次免疫和多次免疫兩種方式對(duì)虹鱒進(jìn)行接種試驗(yàn)，根據(jù)免疫相關(guān)基因表達(dá)量、中和抗體效價(jià)分析結(jié)果，探討了多次免疫能否比單次免疫引起更強(qiáng)的免疫應(yīng)答。本研究中選擇對(duì)IgM、IgT、CD4和CD8基因進(jìn)行定量分析以揭示免疫反應(yīng)與該口服疫苗的關(guān)系，結(jié)果表明，疫苗株免疫組的虹鱒體內(nèi)上述基因均顯著上調(diào)表達(dá)，且多次免疫組的IgM、IgT、CD4和CD8基因上調(diào)程度顯著高于單次免疫組，疫苗株多次免疫組的虹鱒也具有更高的IPNV中和抗體效價(jià)。此外，病毒載量測(cè)定方法目前已廣泛應(yīng)用于IPNV疫苗保護(hù)效果評(píng)價(jià)研究[30-31]。因此，本研究中也利用該方法評(píng)價(jià)該口服疫苗的免疫保護(hù)效果，結(jié)果表明，疫苗株多次免疫組的病毒載量較單次免疫組低，且與預(yù)期相符。

本研究中充分證明了所構(gòu)建的IPN酵母口服疫苗能刺激虹鱒非特異性免疫和特異性免疫反應(yīng)并顯著降低虹鱒體內(nèi)IPNV病毒載量，且多次免疫比單次免疫具有更好的免疫保護(hù)效果。該結(jié)果可為IPNV新型口服活載體疫苗的研發(fā)提供數(shù)據(jù)資料，同時(shí)為魚類口服疫苗的開(kāi)發(fā)提供科學(xué)參考。口服疫苗能減小動(dòng)物的應(yīng)激反應(yīng)，操作簡(jiǎn)單方便，但同時(shí)口服免疫易受到胃腸道酸堿度、蛋白酶及微生物的影響，從而降低疫苗的免疫效果。因此，今后還需進(jìn)一步探索以保證口服疫苗保護(hù)效力的穩(wěn)定性。