苦菜愈傷組織誘導(dǎo)的初步研究

李闖 楚海嬌 劉磊 譚化 王洋 王鳳 張海 王忠偉

摘 要：以苦菜幼嫩葉片和葉柄作為外植體，采用3種誘導(dǎo)培養(yǎng)基、添加不同2，4-D濃度及碳源進(jìn)行苦菜愈傷組織誘導(dǎo)。結(jié)果表明：3種培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果為MS>N6>B5;以幼嫩葉片為外植體、蔗糖作為碳源、2.0mg·L-16-BA加0.2mg·L-12，4-D的激素配比最有利于苦菜愈傷組織的誘導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：愈傷組織;誘導(dǎo)條件;外植體

中圖分類號：S-3

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20201115001

收稿日期：2020-10-15

基金項(xiàng)目：吉林省科學(xué)技術(shù)廳項(xiàng)目（項(xiàng)目編號：20200702017NC）

作者簡介：李闖（1984-），男，助理研究員。研究方向：馬鈴薯的育種和栽培;通訊作者王忠偉，男，研究員。研究方向：馬鈴薯的育種和栽培。

苦菜[Ixeris Chinensis（Thunb.） Nakai]又稱苦苣菜，是一種藥食同源的無毒野生植物[1]。苦菜幼苗富含蛋白質(zhì)、糖類、維生素、氨基酸等多種營養(yǎng)成分，具有很高的食用價值[2]。同時其藥用價值也不容忽視，很多古典文獻(xiàn)上都出現(xiàn)了以苦菜為中藥成分的記載。研究表明，苦菜不僅具有殺菌消炎、防止貧血、清熱解毒等作用[3]，同時對葡萄球菌、大腸桿菌等多種細(xì)菌有抑制作用[4]。為了使得苦菜的藥用價值不斷提升，有關(guān)苦菜生物活性物質(zhì)的研究報道越來越多，而對苦菜的組織培養(yǎng)研究報道較少。組織培養(yǎng)屬于無性生殖的范疇，該技術(shù)對于培育新品種、快速繁殖、遺傳轉(zhuǎn)化、種質(zhì)資源保護(hù)和相關(guān)藥品開發(fā)等方面具有非常重要的意義[5]。愈傷組織的誘導(dǎo)是組織培養(yǎng)的起始階段，能否得到生長旺盛和易于分化的愈傷組織是試驗(yàn)成功的關(guān)鍵[6]。培養(yǎng)基在細(xì)胞生長過程中起決定性作用，其會影響苦菜愈傷組織誘導(dǎo)、分化及生根等一系列過程。本試驗(yàn)分別采用苦菜葉片和葉柄作為外植體，在3種誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織，同時探討不同2，4-D濃度和碳源的影響，以期獲得苦菜愈傷組織的最佳誘導(dǎo)條件，旨在為苦菜的快速繁殖提供有效途徑，同時為苦菜遺傳轉(zhuǎn)化和細(xì)胞工程研究創(chuàng)造有利條件[7]。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

野生苦菜，采于吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院校園。

1.2?誘導(dǎo)培養(yǎng)基

MS培養(yǎng)基、N6培養(yǎng)基、B5培養(yǎng)基。

1.3?試驗(yàn)方法

1.3.1?材料滅菌

選取葉片和葉柄分別放入500mL燒杯中，用自來水洗滌4次，每次約1min。分別用0.1%的HgCl2和70%的酒精浸泡消毒，無菌水沖洗[8，9]。

1.3.2?愈傷組織誘導(dǎo)條件的篩選

1.3.2.1?培養(yǎng)基的篩選

配制MS、N6和B5 3種誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行試驗(yàn)。在此過程中，不定芽較易萌發(fā)，影響愈傷組織的生長，用鑷子將芽夾去，可以提高愈傷誘導(dǎo)率。

1.3.2.2?外植體的篩選

將消毒后的嫩葉切成1cm2大小的方塊，葉柄為1cm左右的小段，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，觀察愈傷組織誘導(dǎo)情況。

1.3.2.3?2，4-D濃度的篩選

配制2，4-D濃度分別為0.00mg·L-1、0.05mg·L-1、0.10mg·L-1、0.20mg·L-1、0.50mg·L-1的MS培養(yǎng)基進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.2.4?碳源的篩選

配制不含碳源和含有相同濃度蔗糖、葡萄糖及麥芽糖的MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行試驗(yàn)，觀察愈傷組織誘導(dǎo)情況。

1.3.3?誘導(dǎo)率的計算

誘導(dǎo)率=愈傷組織數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%

2?結(jié)果與討論

2.1?培養(yǎng)基的篩選

誘導(dǎo)培養(yǎng)基中包含大量元素、微量元素、有機(jī)元素、生長激素及碳源等[10]，其植物生長提供所需的各種營養(yǎng)成分。本試驗(yàn)中MS、N6、B5 3種培養(yǎng)基對苦菜愈傷組織的誘導(dǎo)產(chǎn)生了不同效果。接種14d左右時發(fā)現(xiàn)，在MS培養(yǎng)基中的葉片卷曲，切口處有突起，開始出現(xiàn)初始愈傷。繼續(xù)培養(yǎng)28d左右發(fā)現(xiàn)，N6和B5培養(yǎng)基中的葉片表面也開始有初始愈傷出現(xiàn);而此時以葉柄為外植體的3種培養(yǎng)基中也均誘導(dǎo)出初始愈傷。繼續(xù)培養(yǎng)直至所有愈傷組織狀態(tài)穩(wěn)定后，統(tǒng)計結(jié)果見表1。

由表1可以看出，在MS培養(yǎng)基中，葉片和葉柄的愈傷組織誘導(dǎo)率均最高，其原因可能為MS培養(yǎng)基中氮、鉀等無機(jī)鹽濃度較高，能促進(jìn)愈傷組織的快速形成[11];葉片在N6培養(yǎng)基中的誘導(dǎo)率也較高，但形成愈傷組織所需的時間較長;而在B5培養(yǎng)基中的出愈率僅為12%，且長時間誘導(dǎo)葉片絕大部分褐化。以葉柄為外植體，在N6和B5培養(yǎng)基中的出愈率均較低。因此認(rèn)為，3種培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果為MS>N6>B5。在進(jìn)行植物組織培養(yǎng)時，經(jīng)常出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，有試驗(yàn)表明酚類物質(zhì)的含量增加時，褐化率也隨之增大，成活率隨之減小[12]。本試驗(yàn)中由于外植體切塊太小、所用培養(yǎng)基不適宜而造成了部分褐化現(xiàn)象。

2.2?外植體的篩選

試驗(yàn)分別選取苦菜葉片和葉柄作為外植體。接種14d左右時發(fā)現(xiàn)，在MS培養(yǎng)基中的葉片卷曲，切口處有突起，開始出現(xiàn)初始愈傷。繼續(xù)培養(yǎng)28d左右發(fā)現(xiàn)，以葉柄為外植體的3種培養(yǎng)基中也均誘導(dǎo)出初始愈傷。繼續(xù)培養(yǎng)直至所有愈傷組織狀態(tài)穩(wěn)定后，此時可進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計（見表2）。

由表2可以看出，MS培養(yǎng)基中的葉片誘導(dǎo)率高于葉柄，但二者相比較，葉柄生長速度較慢，往往需要較長時間才能形成可見的初始愈傷，同時褐化現(xiàn)象也較嚴(yán)重;在N6培養(yǎng)基中，葉片的誘導(dǎo)率也較高，因此認(rèn)為葉片更適合作為苦菜愈傷組織誘導(dǎo)的外植體。進(jìn)行植物愈傷組織誘導(dǎo)時，應(yīng)盡量選擇易于增殖和再生，具有良好遺傳穩(wěn)定性的外植體。

2.3?2，4-D濃度的篩選

2，4-D濃度是影響植物愈傷組織誘導(dǎo)率的一個重要激素[13]。6-BA和2，4-D在愈傷組織形成的不同時期具有明顯促進(jìn)作用，6-BA與植株再生有關(guān)，2，4-D與愈傷組織的生長狀態(tài)有關(guān)，是愈傷組織生長的關(guān)鍵[14]。本試驗(yàn)在愈傷組織誘導(dǎo)階段采用6-BA和2，4-D 2種激素，固定6-BA的濃度為2.0mg·L-1，選取5種濃度的2，4-D進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，統(tǒng)計結(jié)果見表3。

由表3可以看出，2，4-D濃度為0.2mg·L-1時，苦菜愈傷組織的誘導(dǎo)率最高，且愈傷組織狀態(tài)良好，大部分呈黃綠色，結(jié)構(gòu)松軟;當(dāng)2，4-D濃度>0.2mg·L-1時，誘導(dǎo)率隨2，4-D濃度的增大而減小，誘導(dǎo)形成的愈傷組織大部分為淺綠色，結(jié)構(gòu)較為致密，生長速度較慢，并且出現(xiàn)嚴(yán)重褐化，表明高濃度的2，4-D不利于愈傷組織的誘導(dǎo)和生長，同時加快外植體的褐化;當(dāng)2，4-D濃度<0.2mg·L-1時，誘導(dǎo)率隨2，4-D濃度的減小而減小;當(dāng)2，4-D濃度=0時，愈傷組織全部死亡。

2.4?碳源的篩選

細(xì)胞的生長不僅需要能量，還需要調(diào)節(jié)生長環(huán)境中的滲透壓，糖作為碳源能夠滿足這些需求，因此培養(yǎng)基中的碳源是培養(yǎng)過程中的關(guān)鍵因素[15]。本試驗(yàn)分別在培養(yǎng)基中加入濃度為30g·L-1 3種碳源進(jìn)行苦菜愈傷誘導(dǎo)研究，結(jié)果表明，培養(yǎng)14d后，含有蔗糖的培養(yǎng)基中的苦菜葉片表面形成初始愈傷，其它培養(yǎng)基中的葉片無明顯變化;培養(yǎng)21d左右，添加葡萄糖的培養(yǎng)基中的葉片表面也開始形成愈傷，統(tǒng)計結(jié)果見表4。

結(jié)果顯示，不加碳源的培養(yǎng)基中無愈傷組織形成，說明碳源是苦菜葉片愈傷組織形成的必要元素。分別添加不同碳源的3種培養(yǎng)基中均有愈傷組織形成，但誘導(dǎo)率和誘導(dǎo)效果存在很大差別。添加蔗糖的培養(yǎng)基中的出愈率高達(dá)到96%，且愈傷組織呈黃綠色，結(jié)構(gòu)松軟，生長狀態(tài)良好;添加葡萄糖的培養(yǎng)基中的出愈率不足50%，且呈現(xiàn)淺綠色，結(jié)構(gòu)較為致密，生長情況較差;麥芽糖的誘導(dǎo)效果最差，幾乎沒有完整的愈傷組織形成，只有少量葉片的切口處出現(xiàn)點(diǎn)狀突起。由此可見，蔗糖為苦菜愈傷組織誘導(dǎo)的最適碳源。

2.5?愈傷組織的繼代培養(yǎng)

固定2，4-D濃度為0.1mg·L-1，分別配制MS、N6和B53種培養(yǎng)基進(jìn)行繼代試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在N6和B5培養(yǎng)基上，隨著培養(yǎng)時間的增加苦菜葉片愈傷組織的存活數(shù)減少，直到最后全部褐化死亡，其中B5褐化的速度最快，因此這2種培養(yǎng)基不適合繼代培養(yǎng);而接種到MS培養(yǎng)基上的大部分生長良好，能保持良好的生長狀態(tài)，并成功分化出苗。

3?結(jié)論

本試驗(yàn)采用不同培養(yǎng)基、外植體、2，4-D濃度和碳源種類對苦菜愈傷組織進(jìn)行初步誘導(dǎo)研究。得出以下結(jié)論：以苦菜葉片和葉柄做外植體，3種誘導(dǎo)培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果均為MS>N6>B5;同時苦菜的2種外植體均能誘導(dǎo)形成愈傷組織，但葉片的誘導(dǎo)率要高于葉柄，且愈傷組織生長狀態(tài)較好，誘導(dǎo)時間較短，所以苦菜葉片較適合作為苦菜愈傷誘導(dǎo)的外植體。試驗(yàn)表明，2，4-D濃度為0.2mg·L-1時適合苦菜葉片愈傷組織的誘導(dǎo);3種碳源的誘導(dǎo)效果比較發(fā)現(xiàn)，蔗糖>葡萄糖>麥芽糖，因此蔗糖可作為理想碳源;繼代培養(yǎng)時，愈傷組織在MS培養(yǎng)基中的生長狀況良好且培養(yǎng)后愈傷組織活性很高，能夠繼續(xù)進(jìn)行分化培養(yǎng)，同時在繼代培養(yǎng)時應(yīng)適當(dāng)降低2，4-D濃度。

本試驗(yàn)僅對影響苦菜愈傷組織誘導(dǎo)的條件進(jìn)行優(yōu)化，為建立完善的苦菜組織培養(yǎng)體系，其繼代、分化及生根培養(yǎng)的影響因素，還有待于進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯?李媛媛）