防治新型冠狀病毒肺炎納米制劑的研究進(jìn)展

張盈璐，陸澤華綜述，張培霞，高瑜審校

福州大學(xué)化學(xué)學(xué)院腫瘤轉(zhuǎn)移的預(yù)警和預(yù)防研究所 福建省腫瘤轉(zhuǎn)移藥物干預(yù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350108

嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory symptom coronavirus 2，SARS-CoV-2）是繼SARS-CoV、中東呼吸綜合征冠狀病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV）之后被發(fā)現(xiàn)的第3 種對(duì)人類具有高致病性的冠狀病毒。由于其極強(qiáng)的傳染性和極廣的傳播范圍，世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）在2020年3月11日正式將SARS-CoV-2 引起的新型冠狀病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019，COVID-19）疫情定性為大流行［1］。根據(jù)WHO 2022年6月20日發(fā)布的數(shù)據(jù)，全球累計(jì)COVID-19 確診病例超過5.36 億，死亡病例超過631 萬［2］。因此，亟需開發(fā)用于預(yù)防和治療COVID-19的藥物制劑。

納米技術(shù)在預(yù)防和治療病毒感染中起著不可估量的作用。如在口罩表面附著石墨烯納米材料，可利用太陽光產(chǎn)生光熱效應(yīng)達(dá)到滅菌效果［3］；用納米技術(shù)制備疫苗，納米材料既能傳遞抗原還可用作佐劑；在治療方面，包載藥物的納米粒子可通過調(diào)控形狀、尺寸等影響與病毒的作用方式，從而提高與病毒的相互作用效率。

本文對(duì)納米技術(shù)在制備COVID-19 疫苗和治療藥物制劑方面的應(yīng)用作一綜述，在“疫苗+藥物”的大框架下探討納米技術(shù)在控制COVID-19 大流行方面的潛力。

1 COVID-19的流行病學(xué)和發(fā)病機(jī)制

SARS-CoV-2 經(jīng)人與人之間的接觸或飛沫傳播［4］，感染該病毒所導(dǎo)致的男女死亡率為2.4∶1，中位死亡年齡為70.3歲［5］。從出現(xiàn)癥狀至死亡的中位時(shí)間為14 d，平均潛伏期為5.2 d，但在70 歲以下患者中，潛伏期可長達(dá)20 d。與年輕人相比，老年人的感染風(fēng)險(xiǎn)更高。此外，SARS-CoV-2 還會(huì)誘發(fā)其他慢性疾病，如糖尿病、心血管疾病和高血壓等［5］。

SARS-CoV-2 是一種單鏈RNA 病毒，長度為29 903 bp，直徑為50 ～150 nm［6］，外觀呈球形、橢圓形或多形形態(tài)，基因組可編碼刺突（S）、包膜（E）、基質(zhì)（M）和核衣殼（N）4 種結(jié)構(gòu)蛋白。其與人類SARSCoV 基因組的查詢覆蓋率超過98%，具有80.26%的序列同一性。隨著感染人數(shù)的增加，出現(xiàn)了大量SARS-CoV-2 的變異株，其中有5 種快速傳播的毒株被指定為“受關(guān)注突變體”（variants of concern，VOC），包括α（B.1.1.7）、β（B.1.351）、γ（P.1）、δ（B.1.617.2）和Omicron（B.1.1.529）變異。SARS-CoV-2 通過與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）受體結(jié)合進(jìn)入宿主細(xì)胞，當(dāng)SARS-CoV-2 與ACE2 受體結(jié)合后，跨膜蛋白酶絲氨酸2（transmembrane serine proteinase 2，TMPRSS2）開始在S 蛋白的第1個(gè)蛋白質(zhì)水解位點(diǎn)進(jìn)行切割，形成S1和S2亞基。遠(yuǎn)端S1 亞基含有受體結(jié)合部位（receptor binding domain，RBD），在受體的識(shí)別和結(jié)合中發(fā)揮作用，而錨定的S2 亞基介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞膜的融合。ACE2受體在肺、食道上皮細(xì)胞、回腸和結(jié)腸的腸上皮細(xì)胞以及腎小管中高表達(dá)，因此，呼吸道和消化道是感染的潛在入口［7］。

2 納米技術(shù)在制備COVID-19疫苗中的應(yīng)用

2.1 疫苗的免疫學(xué)基礎(chǔ) 人體與病原體接觸后，可產(chǎn)生非特異性免疫反應(yīng)和特異性免疫反應(yīng)。特異性免疫反應(yīng)分為T 淋巴細(xì)胞引起的細(xì)胞免疫反應(yīng)和B淋巴細(xì)胞引起的體液免疫反應(yīng)。當(dāng)感染病原體的細(xì)胞提呈病原體抗原給淋巴細(xì)胞后，淋巴細(xì)胞的輔助T細(xì)胞（T helper cells）被激活，刺激B 淋巴細(xì)胞分化產(chǎn)生抗體，并誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T 細(xì)胞的生成，清除病原體。在免疫過程中同時(shí)可刺激產(chǎn)生記憶B 細(xì)胞和記憶T 細(xì)胞，當(dāng)病原體再次入侵時(shí)，記憶淋巴細(xì)胞即刻識(shí)別病原體，產(chǎn)生抗體和細(xì)胞毒性T 細(xì)胞將病原體清除。機(jī)體的免疫響應(yīng)受多種因素影響，如性別、年齡、懷孕與否和感染途徑等［8］。

在SARS-CoV-2 感染宿主細(xì)胞過程中，S 蛋白尤其是RBD位點(diǎn)是其誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答的主要抗原部位，因此，全球現(xiàn)階段主要以S 蛋白為目標(biāo)設(shè)計(jì)開發(fā)COVID-19 疫苗。接種疫苗并不能保證接種者不會(huì)被感染，但大規(guī)模的疫苗注射覆蓋率是形成群體免疫、消滅新冠的最佳途徑。有研究顯示，接種COVID-19 疫苗BNT162b2 加強(qiáng)針用于預(yù)防COVID-19的絕對(duì)有效性在97%～99%，且在10周內(nèi)其效力不減弱［9］。根據(jù)技術(shù)路線和生產(chǎn)工藝，COVID-19 疫苗可分為滅活疫苗、減毒活疫苗、蛋白亞單位疫苗、病毒載體疫苗（復(fù)制／非復(fù)制）、病毒樣顆粒疫苗和核酸疫苗，見圖1。

圖1 預(yù)防SARS-CoV-2的疫苗類型Fig.1 Types of vaccines against SARS-CoV-2

2.2 納米技術(shù)在疫苗開發(fā)中的應(yīng)用

納米技術(shù)在開發(fā)對(duì)抗各種病原體（包括SARSCoV-2）疫苗方面受到廣泛關(guān)注，這與納米粒子自身特性密切相關(guān)。納米粒子與病毒尺寸相近，具有高比表面，能更有效地刺激免疫系統(tǒng)；同時(shí)，納米材料的疏水性可增強(qiáng)炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的表達(dá)及釋放［10-11］。近年來，相關(guān)學(xué)者在創(chuàng)新納米疫苗配方（如脂質(zhì)體、聚合納米顆粒、病毒樣顆粒等）方面做出了不懈努力。通常以包含金納米顆粒、聚合物或蛋白質(zhì)裝配體為骨架，再將骨架與SARS-CoV-2 抗原（滅活或破壞的SARS-CoV-2）、表達(dá)某些SARS-CoV-2 蛋白的DNA 或特異性SARS-CoV-2 蛋白組成的活性成分綴合或偶聯(lián)，制備出納米疫苗，療效往往優(yōu)于非納米配方的同類產(chǎn)品。有些不含抗原的納米配方，如蛋白籠納米顆粒也能發(fā)揮類似疫苗的作用，注射該納米顆粒的小鼠能產(chǎn)生抗病毒抗體［12］。此外，納米技術(shù)也被用于開發(fā)納米佐劑增強(qiáng)抗原的靶向遞送以及機(jī)體對(duì)抗原的特異性免疫應(yīng)答，從而降低疫苗劑量［13］。以下詳細(xì)介紹幾類典型的納米疫苗和佐劑。

2.2.1 核酸疫苗 核酸疫苗分為DNA 疫苗和RNA疫苗，通過使用宿主細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)來合成抗原蛋白質(zhì)，從而引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生T 細(xì)胞免疫反應(yīng)以及中和抗體反應(yīng)［14］。使用病毒載體通常被認(rèn)為是將核酸傳遞至細(xì)胞最有效的方法，但其應(yīng)用常受到病毒載體免疫原性、生產(chǎn)和安全的限制［15］，因此，非病毒納米遞送系統(tǒng)成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

已在全球獲批上市的BNT162b2 和mRNA-1273兩種mRNA 疫苗，采用脂質(zhì)納米顆粒（lipid nanoparticles，LNPs）作為遞送載體［16］，編碼的抗原均是兩個(gè)脯氨酸突變修飾的SARS-CoV-2 全長刺突蛋白，以保留更多融合前的構(gòu)象信息［17］。LNPs通常包括4種成分：陽離子或可電離脂質(zhì)、膽固醇、輔助磷脂以及聚乙二醇化脂質(zhì)［16］，幫助BNT162b2 和mRNA-1273 兩種疫苗達(dá)到了90%和94.1%的有效性［18］。這類疫苗產(chǎn)生的高滴度抗體對(duì)于SARS-CoV-2 毒株和新變體均相當(dāng)有效，該效果與激活的濾泡輔助性T 細(xì)胞（T follicular helper cells，TFH）密切相關(guān)。TFH 在促進(jìn)高親和力抗體生成的同時(shí)，也在分化發(fā)展成記憶細(xì)胞［19］。

mRNA 疫苗在快速應(yīng)對(duì)疫情大流行上作出了巨大貢獻(xiàn)，但從穩(wěn)定性和疫苗儲(chǔ)存方面來說，DNA疫苗更勝一籌。除了已上市的ZyCoV-D，大多數(shù)新冠DNA疫苗尚在研發(fā)中。INO-4800 為美國INOVIO 生物制藥公司開發(fā)的DNA 疫苗，其使用pGX9501 質(zhì)粒編碼SARS-CoV-2 刺突蛋白。通過CELLECTRA?設(shè)備發(fā)射的短暫電脈沖，質(zhì)粒得以進(jìn)入細(xì)胞產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)［20］。

2.2.2 病毒樣顆粒（virus-like particles，VLPs） VLPs是一種由病毒衍生的結(jié)構(gòu)蛋白和佐劑組成的衣殼［10］。VLPs 大小為20 ～300 nm，可被樹突細(xì)胞或其他抗原提呈細(xì)胞有效識(shí)別。在病原體相關(guān)分子模式的幫助下，VLPs 有助于激活先天免疫應(yīng)答，釋放出Ⅰ型干擾素［21］。與必須在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中制備的滅活或減毒病毒相比，VLPs 的優(yōu)勢(shì)是能在異種系統(tǒng)如細(xì)菌、酵母、昆蟲細(xì)胞或植物中產(chǎn)生［22］。如NVXCoV2373 疫苗使用了桿狀病毒／昆蟲細(xì)胞平臺(tái)，對(duì)癥狀性病例有89.7%的保護(hù)作用［23］。Medicago 公司開發(fā)的植物源VLPs 疫苗，是通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，將SARS-CoV-2 穗狀基因序列導(dǎo)入本氏氮芥植株中并表達(dá)所需的抗原蛋白［24］。組裝生產(chǎn)出的VLPs在大小和形狀上與原SARS-CoV-2 病毒粒子非常相似。對(duì)于VLPs 生產(chǎn)平臺(tái)的選擇，需考慮所生產(chǎn)的VLPs 的結(jié)構(gòu)、功能、可擴(kuò)展性和生產(chǎn)過程的成本等要素。哺乳動(dòng)物細(xì)胞是進(jìn)行翻譯后修飾和VLPs 正確組裝的最佳平臺(tái)，但所需生產(chǎn)成本較高［25］。

2.2.3 納米佐劑 佐劑是用于激活先天免疫系統(tǒng)的藥理學(xué)或免疫制劑，可使先天免疫系統(tǒng)對(duì)感染迅速作出反應(yīng)，并刺激針對(duì)病毒感染的適應(yīng)性免疫反應(yīng)。其可有效地穩(wěn)定抗原構(gòu)象，促進(jìn)抗原提呈細(xì)胞識(shí)別，進(jìn)而增強(qiáng)免疫應(yīng)答［26］。佐劑對(duì)疫苗的成功開發(fā)至關(guān)重要。Novavax重組蛋白疫苗中的Matrix M佐劑是由皂苷與膽固醇和磷脂組成的納米顆粒制成，可增強(qiáng)輔助性T 細(xì)胞1（Th1）和Th2 反應(yīng)，誘導(dǎo)多種亞類抗體，增強(qiáng)免疫細(xì)胞遷移，并節(jié)約抗原劑量［27］。ReCOV疫苗中添加了新型佐劑BFA03（一種類似于AS03 的角鯊烯佐劑），使家兔模型的免疫效果顯著增強(qiáng)。此外，該疫苗采用了NTD-RBD-Foldon三聚體蛋白結(jié)構(gòu)，與RBD 或N-末端結(jié)構(gòu)域（N-terminal domain，NTD）組成的單一免疫原相比，增強(qiáng)了中和性抗體反應(yīng)和降低病毒逃逸宿主免疫的可能性，同時(shí)對(duì)主要流行的病毒變異株具有很好的交叉免疫作用［28］。

3 納米技術(shù)在制備治療COVID-19 藥物制劑中的應(yīng)用

3.1 用于COVID-19 治療的藥物 在病毒迅速傳播的背景下，藥物再利用已成為治療COVID-19的一線策略之一［29］。常見的用于抗SARS-CoV-2的藥物及其作用機(jī)理見圖2。瑞德西韋（Remdesivir）是一種腺苷類似物，其活性代謝物為瑞德西韋三磷酸。瑞德西韋三磷酸的結(jié)構(gòu)與三磷酸腺苷（ATP）類似，可通過RNA聚合酶將其整合到新生病毒RNA上，從而導(dǎo)致復(fù)制過程中鏈的延遲終止，進(jìn)而抑制病毒復(fù)制［30］。除瑞德西韋外，RNA聚合酶抑制劑還有法匹拉韋（Favipiravir）、莫那比拉韋（Molnupiravir）和AT-527［31］。

圖2 SARS-CoV-2 感染宿主細(xì)胞增殖機(jī)制及各藥物用于抗SARS-CoV-2作用機(jī)理Fig.2 Proliferation mechanism of SARS-CoV-2 in host cells and action mechanism of various drugs against SARS-COV-2

抗病毒藥物不僅可作用于RNA，還可靶向病毒蛋白。阿比多爾（Umifenovir）是一種吲哚衍生小分子，可阻斷S 蛋白與ACE2 受體結(jié)合，以抑制病毒融合到宿主細(xì)胞膜內(nèi)［32］?？鼓孓D(zhuǎn)錄病毒藥物洛匹那韋（Lopinavir，LPV）和利托那韋（Ritonavir，RTV）作為針對(duì)主要蛋白酶（Mpro）的COVID-19 治療藥物被用于臨床試驗(yàn)中［31］。但LPV／RTV 聯(lián)合用藥存在腹瀉、惡心和肝損傷的副作用，且半衰期較短，因此可利用內(nèi)源性細(xì)胞外囊泡的新配方提高蛋白酶抑制劑的安全性和有效性［33］。帕昔洛韋（Paxlovid）亦是一種治療組合，由兩種化合物PF-07，321，332（SARS-CoV-2 的3CL 蛋白酶抑制劑）和利托那韋（HIV-1 和HIV-2 蛋白酶抑制劑）組成。利托那韋同時(shí)也是細(xì)胞色素P4503A和CYP2D6的抑制劑，可減緩PF-07，321，332的體內(nèi)代謝，降低給藥劑量［30］。

3.2 用于COVID-19治療藥物遞送的納米載體

雖然藥物再利用解決了臨床亟需用藥的需求，但隨之帶來的安全性和有效性挑戰(zhàn)也不容忽視，如穩(wěn)定性差，溶解度、膜通透性弱，生物利用度低等。一些研究人員從藥物配方或藥物傳遞方法入手，來解決已批準(zhǔn)藥物的物理化學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)或安全問題［33］。納米技術(shù)能夠促進(jìn)藥物遞送系統(tǒng)的開發(fā)，減少藥物的毒性并提高其功效，持續(xù)且有針對(duì)性地將藥物輸送至靶部位，見圖3［34］，為應(yīng)對(duì)傳統(tǒng)藥物療法帶來的挑戰(zhàn)提供了新的思路。這可歸功于納米材料的特性：①表面電荷（可幫助藥物通過細(xì)胞膜）；②顆粒?。ㄊ顾幬镛D(zhuǎn)移至易于誘發(fā)免疫的部位）；③表面積大（有助于藥物有效載荷）；④內(nèi)在抗病毒性（仿生特性）［35］。

圖3 納米技術(shù)用于制備治療COVID-19 納米制劑中的顯著優(yōu)勢(shì)Fig.3 Significant advantages of nanotechnology used in development of nano-preparations for treatment of COVID-19

3.2.1 脂質(zhì)納米遞送系統(tǒng) 脂質(zhì)體是最早開發(fā)的納米遞送系統(tǒng)之一，大小通常在50 ～200 nm，是由單個(gè)或多個(gè)脂質(zhì)雙分子層組成的球形囊泡。這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)允許在水核中裝載親水藥物，在脂質(zhì)雙分子層的酰基烴鏈中裝載疏水藥物，充分體現(xiàn)了脂質(zhì)與藥物組合的靈活性［18，36］。磷酸奧司他韋脂質(zhì)體吸入粉劑展現(xiàn)了脂質(zhì)體在肺部給藥方面的優(yōu)越性，并能降低給藥頻率［37］。由脂質(zhì)材料制備的脂質(zhì)納米顆粒具有淋巴靶向的優(yōu)點(diǎn)。將3 種逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物包括疏水性的LPV 和RTV 以及親水性的替諾福韋（Tenofovir，TFV）轉(zhuǎn)載入LNPs制備成納米懸浮液，解決了口服組合藥物在淋巴結(jié)處藥物蓄積量不足的問題［38］。

3.2.2 聚合物納米遞送系統(tǒng) 聚合物納米顆粒是一種有效的遞送系統(tǒng)，可通過調(diào)節(jié)聚合物性質(zhì)調(diào)整其功能［10，39］。通過與治療性化合物結(jié)合，殼聚糖可增強(qiáng)聚合物納米顆粒在黏膜環(huán)境中的持久性及對(duì)黏膜組織的滲透性［10］。瑞士Bioavanta-Bosti 公司公布的Novochizol?為一種殼聚糖納米顆粒氣溶膠配方，可用來靶向輸送抗SARS-CoV-2 治療藥物至患者肺部［34］。聚乳酸-羥基乙酸共聚物（polylactic-co-glycolic acid，PLGA）也在新冠藥物遞送中被廣泛應(yīng)用。用PLGA 包裹LPV后再覆蓋巨噬細(xì)胞膜，制成的藥物遞送系統(tǒng)顯示出良好的抗炎和靶向抗病毒效果，可能對(duì)COVID-19具有綜合治療價(jià)值［40］。樹枝狀大分子也是藥物或疫苗傳遞劑的優(yōu)秀候選之一。將Remdesivir封裝在聚乙二醇樹枝狀大分子中，藥物溶解度可提高100 倍，并能在皮下給藥后緩慢釋藥，與傳統(tǒng)的靜脈注射相比，減輕了門診治療和醫(yī)療系統(tǒng)的負(fù)擔(dān)［34］。3.2.3 無機(jī)納米顆粒 一些無機(jī)納米顆粒顯示出一定的抗病毒活性。納米金能模擬病毒從而像病毒一樣攜帶特殊蛋白質(zhì)至機(jī)體，促使T 細(xì)胞明顯增殖［41］。多孔硅納米顆粒也已被證明對(duì)各種包膜和非包膜致病性人類病毒具有顯著的抗病毒吸附（殺病毒）功效［42］。氧化石墨烯-銀納米粒子可阻斷貓冠狀病毒和包膜病毒進(jìn)入細(xì)胞。另外，氧化鐵納米顆?？膳cSARS-CoV-2 的S1-RBD 相互作用，亦是COVID-19 治療的一種替代方案［43］。

3.2.4 細(xì)胞膜納米囊泡 細(xì)胞外囊泡是一種異質(zhì)性的膜納米囊泡，能夠阻斷SARS-CoV-2 與宿主細(xì)胞的結(jié)合、中和細(xì)胞因子、減少炎癥并改善COVID-19 治療藥物的傳遞［44］。有報(bào)道通過仿生合成技術(shù)開發(fā)了一種與天然蛋白質(zhì)具有相同結(jié)構(gòu)和活性的細(xì)胞膜納米泡，因具有高水平的ACE2 和豐富的細(xì)胞因子受體，可作為與宿主細(xì)胞競爭病毒和細(xì)胞因子結(jié)合的納米誘餌，從而抑制SARS-CoV-2 的復(fù)制和感染，并能有效結(jié)合和中和IL-6、GM-CSF 等炎性細(xì)胞因子［10］。通過膜水合方法制備的包含25-羥基膽固醇（25-hydroxycholesterol，25-HC）和22十二烷基二甲基溴化銨（didodecyldimethylammonium bromide，DDAB）的納米囊泡（25-HC@DDAB）可顯著促進(jìn)25-HC 介導(dǎo)細(xì)胞因子抑制和炎癥相關(guān)信號(hào)下調(diào)［45］。

4 結(jié)論

COVID-19 已在全球范圍內(nèi)造成嚴(yán)重?fù)p失，迫切需要找到有效的解決方案來控制其大流行。納米技術(shù)憑借其尺寸效應(yīng)和免疫活性等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于開發(fā)COVID-19 納米疫苗和納米藥物，研發(fā)的BNT162b2 mRNA 疫苗即為納米技術(shù)應(yīng)用于疫苗領(lǐng)域的成功案例。在各國的共同努力下，會(huì)有更多更加安全有效的納米制劑被開發(fā)出來，幫助人類戰(zhàn)勝新病毒。