人參根提取物對小鼠脾淋巴細(xì)胞自噬、增殖和細(xì)胞因子分泌的影響及機(jī)制研究

李芳宇 齊濱 邊帥 趙月 盧姝言 王佳雯 趙大慶

摘 要 目的：研究人參根提取物對小鼠脾淋巴細(xì)胞自噬、增殖及細(xì)胞因子分泌的影響，并研究其作用機(jī)制。方法：將小鼠脾淋巴細(xì)胞分為空白對照組、陽性對照組（刀豆蛋白A，5 μg/mL）和不同質(zhì)量濃度人參根提取物組（32、125、500 μg/mL，以凍干粉末計(jì)）。各組細(xì)胞加入相應(yīng)藥物培養(yǎng)48 h后，分別采用吖啶橙染色法檢測細(xì)胞的自噬情況;采用CCK-8法檢測細(xì)胞的增殖情況;采用酶聯(lián)免疫吸附法測定細(xì)胞培養(yǎng)液中白細(xì)胞介素4（IL-4）、IL-6、腫瘤壞死因子α（TNF-α）的水平;采用Western blotting法檢測細(xì)胞中微管相關(guān)蛋白輕鏈β3（LC3B）、酵母ATG6同源物（Beclin-1）的表達(dá)水平以及腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）、蛋白激酶B（AKT）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的磷酸化水平。結(jié)果：與空白對照組比較，32、125、500 μg/mL人參根提取物均能夠增加小鼠脾淋巴細(xì)胞酸性自噬體的數(shù)量（P<0.05或P<0.01）;125、500 μg/mL人參根提取物均可顯著提高細(xì)胞存活率，顯著提高細(xì)胞中IL-4、IL-6和TNF-α的水平，顯著促進(jìn)細(xì)胞中LC3BⅠ向LC3BⅡ轉(zhuǎn)化，顯著上調(diào)細(xì)胞中Beclin-1蛋白表達(dá)水平，顯著提高AMPK蛋白的磷酸化水平，顯著降低AKT和mTOR蛋白的磷酸化水平，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：人參根提取物能通過激活A(yù)MPK、抑制AKT活化來抑制mTOR活性，從而誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞發(fā)生自噬、激活脾淋巴細(xì)胞活性、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌以發(fā)揮免疫增強(qiáng)作用。

關(guān)鍵詞 人參根提取物;脾淋巴細(xì)胞;自噬;細(xì)胞因子;免疫增強(qiáng)作用

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To study the effects of ginseng root extract on autophagy， proliferation and cytokine of splenic lymphocyte of mice， and to study its mechanism. METHODS： The splenic lymphocyte of mice were divided into blank control group， positive control group （concanavalin A， 5 μg/mL）， different concentration of ginseng root extract groups （32， 125， 500 ? ? μg/mL， by lyophilized powder）. After 48 h of culture with the corresponding medicine， acridine orange staining method was used to detect autophagy of splenic lymphocyte; CCK-8 assay was used to detect the cell proliferation; ELISA assay was used to determine the levels of IL-4， IL-6 and TNF-α in cell culture; Western blotting method was used to detect the expression of LC3B and Beclin-1， as well as the phosphorylation of AMPK， AKT and mTOR. RESULTS： Compared with blank control group， 32， 125， 500 μg/mL ginseng root extract could increase the number of acidic autophagosomes in splenic lymphocytes of mice （P<0.05 or P<0.01）; 125， 500 μg/mL Ginseng root extract could significantly enhance the survival rate of splenic lymphocytes， the levels of IL-4， IL-6 and TNF-α and the transformation of LC3BⅠ to LC3BⅡ， significantly increased the protein expression of Beclin-1， the phosphorylation of AMPK protein， and significantly reduced the phosphorylation level of AKT and mTOR proteins， with statistical significance （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Ginseng root extract can induce autophagy of mice splenic lymphocytes， activate the activity of splenic lymphocytes， regulate the secretion of cytokine by activating AMPK and inhibiting the activation of AKT which can inhibit the activity of mTOR， so as to exert immune enhancement effect.

KEYWORDS ? Ginseng root extract; Splenic lymphocytes; Autophagy; Cytokine; Immune enhancement effect

人參是五加科人參屬植物人參Panax ginseng C. A. Mey.的干燥根及根莖[1]。據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》記載：“人參主補(bǔ)五臟，安精神，定魂魄，除邪氣，明目、開心、益智，久服輕身延年”[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，人參具有改善記憶力、抗疲勞、抗衰老、抗病毒以及提高免疫力等功效，并且對非特異性免疫、體液免疫和細(xì)胞免疫均有明顯的調(diào)節(jié)作用[3-9]。自噬是細(xì)胞吞噬自身細(xì)胞質(zhì)蛋白或細(xì)胞器進(jìn)入囊泡，與溶酶體形成自噬溶酶體并降解其包裹的內(nèi)容物的過程，以此可更新細(xì)胞器并完成細(xì)胞的自身代謝[10]。同時(shí)，自噬在淋巴細(xì)胞的活化過程中起著重要的作用[11]。多個(gè)研究指出，人參及其主要成分具有免疫調(diào)節(jié)的作用[12]。然而，人參對脾淋巴細(xì)胞自噬及免疫調(diào)節(jié)方面的作用鮮有報(bào)道。鑒于此，本研究選用人參根提取物體外作用于小鼠脾淋巴細(xì)胞，探究其對脾淋巴細(xì)胞自噬、增殖以及免疫因子分泌的影響，并初步探討其可能的作用機(jī)制，為人參根提取物的深入研究和開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

Infinite 200 Pro型酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）;3111型CO2培養(yǎng)箱、iBright型智能成像系統(tǒng)FL1000（美國 Thermo Fisher Scientific公司）;IX73型熒光顯微鏡（日本Olympus公司）;1645050型蛋白質(zhì)凝膠電泳儀、Mini- Protean 1658001型電泳槽（美國Bio-Rad公司）。

1.2 藥品與試劑

人參藥材采購自吉林撫松（采摘時(shí)間為2018年9月20日），由長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院肖井雷副教授鑒定為五加科人參屬植物人參Panax ginseng C. A. Mey.的干燥根;RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）;胎牛血清（美國Gibco公司）;刀豆蛋白A（美國Sigma公司，批號(hào)：C0412，純度：95%）;CCK-8試劑盒（美國Boster公司，批號(hào)：AR1160-500）;白細(xì)胞介素4（IL-4）、IL-6、腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（上海優(yōu)選生物科技有限公司，批號(hào)：YX-091204M、YX-091026M、YX-201606M）;紅細(xì)胞裂解液、二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：C3702、P0010）;吖啶橙（AO）染料（北京索萊寶科技有限公司）;兔抗蛋白激酶B（AKT）、磷酸化AKT（p-AKT）、腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）、磷酸化AMPK（p-AMPK）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、磷酸化mTOR（p-mTOR）、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）多克隆抗體（南京巴傲得生物科技有限公司，批號(hào)：BS90043、BS4006、BS6271、BS4010、BS1555、BS4706、AP0060）;兔抗微管相關(guān)蛋白輕鏈β3（LC3B）、酵母ATG6同源物（Beclin-1）單克隆抗體及辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（美國CST公司，批號(hào)：12741、3495、7074P2）;其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為超純水。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL/6小鼠20只，雄性，8周齡，體質(zhì)量18～20 g，購自長春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司，生產(chǎn)合格證號(hào)：SCXK（吉）2018-0007。本實(shí)驗(yàn)方案符合《吉林省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理辦法》對動(dòng)物倫理的要求。

2 方法

2.1 人參根提取物的制備

精密稱取人參根50 g，粉碎，過篩（80目），加入10倍量水（mL/g，下同），40 ℃水浴超聲（頻率：40 kHz，功率：600 W）提取2 h，將提取液以3 500 r/min離心5 min后，濾過，收集濾液并進(jìn)行超濾濃縮。殘?jiān)?0倍量水，80 ℃水浴提取1.5 h，將提取液以3 500 r/min離心5 min后，濾過，收集濾液并進(jìn)行超濾濃縮。分別將2次濃縮液凍干，即得（人參根提取物收率為21.58%），其中有效成分含量為人參蛋白7.32%、人參多糖8.7%、人參皂苷9.5%。

2.2 小鼠脾淋巴細(xì)胞的制備

將小鼠處死，按文獻(xiàn)方法[13]在無菌操作條件下取出其脾組織并制備脾淋巴細(xì)胞懸液，用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，備用。

2.3 人參根提取物對小鼠脾淋巴細(xì)胞自噬的影響考察

采用AO染色法進(jìn)行測定。將小鼠脾淋巴細(xì)胞按5×106個(gè)/孔接種至6孔板中，將細(xì)胞分為空白對照組（空白培養(yǎng)基）、陽性對照組（刀豆蛋白A，5 μg/mL[14]）和不同質(zhì)量濃度人參根提取物組（32、125、500 μg/mL，以凍干粉末計(jì)，質(zhì)量濃度按照前期預(yù)試驗(yàn)設(shè)置）。各組細(xì)胞加入相應(yīng)藥物在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中（下同）培養(yǎng)48 h。以1 000 r/min離心5 min，收集各孔細(xì)胞，以磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次后，以4%多聚甲醛室溫固定10 min，然后以1 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞;再次用PBS洗滌3次，然后加入AO染液（終質(zhì)量濃度為15 ? ? ? ?μg/mL），室溫避光孵育15 min后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)并拍照。采用Image Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行免疫熒光分析。當(dāng)自噬水平較低時(shí)主要觀察到綠色熒光，當(dāng)自噬水平較高時(shí)紅色熒光增強(qiáng)，兩者合成后呈黃色熒光，黃色熒光強(qiáng)度值越大則表明細(xì)胞自噬水平越高。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 人參根提取物對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響考察

采用CCK-8法進(jìn)行測定。將小鼠脾淋巴細(xì)胞按1×105個(gè)/孔接種至96孔板中，按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行細(xì)胞分組、給藥。培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，然后培養(yǎng)2 h。另設(shè)不加藥物和細(xì)胞的陰性對照組。采用酶標(biāo)儀于450 nm波長下測定各孔的光密度（OD）值[15]，并計(jì)算各組細(xì)胞的存活率[細(xì)胞存活率（%）=（給藥組OD值-空白對照組OD值）/（陰性對照組OD值-空白對照組OD值）×100%]。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 人參根提取物對小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-4、IL-6和TNF-α水平的影響考察

采用ELISA法進(jìn)行測定。將小鼠脾淋巴細(xì)胞按1×105個(gè)/孔接種至96孔板中，按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行細(xì)胞分組、給藥。培養(yǎng)48 h后，以3 000 r/min離心10 min，收集各孔細(xì)胞培養(yǎng)上清液。參照相應(yīng)試劑盒說明書方法操作，檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-4、IL-6和TNF-α水平。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 人參根提取物對小鼠脾淋巴細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響考察

采用Western blotting法進(jìn)行測定。將小鼠脾淋巴細(xì)胞按5×106個(gè)/孔接種至6孔板中，將細(xì)胞分為空白對照組和不同質(zhì)量濃度人參根提取物組（按“2.3”項(xiàng)下方法設(shè)置為32、125、500 μg/mL，以凍干粉末計(jì)）。培養(yǎng)48 h后，以1 000 r/min離心5 min，收集各孔細(xì)胞，用PBS洗滌3次，然后加入細(xì)胞裂解液充分裂解后，再采用BCA法測定蛋白濃度。將蛋白變性處理后，取50 μg在80 V電壓下行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳90 min，然后以200 mA濕法轉(zhuǎn)膜80 min至硝酸纖維素膜（NC）上。將膜放入含5%脫脂奶粉的PBST緩沖液中室溫封閉1 h后，加入LC3B、Beclin-1、AKT、p-AKT、AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、β-actin一抗（稀釋度均為1 ∶ 1 000），4 ℃孵育過夜;以PBST緩沖液洗膜3次，然后加入二抗（稀釋度為1 ∶ 1 000），室溫孵育1 h;以PBST緩沖液再次洗膜3次，然后在智能成像系統(tǒng)中采用ECL化學(xué)發(fā)光液顯色。采用Image J 1.52a軟件對蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析，以目標(biāo)蛋白條帶灰度值與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值表示目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平，分別以p-AKT/AKT、p-AMPK/AMPK、p-mTOR/mTOR比值表示AKT、AMPK、mTOR蛋白的磷酸化水平，以LC3BⅡ/LC3BⅠ的比值反映IC3BⅠ向LC3BⅡ轉(zhuǎn)化的情況。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 人參根提取物對小鼠脾淋巴細(xì)胞自噬的影響

與空白對照組比較，各給藥組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度（指合成后的黃色熒光強(qiáng)度，下同）均顯著增大（P<0.05或P<0.01），說明給藥后細(xì)胞的自噬水平均顯著升高，且人參根提取物的作用具有一定的濃度依賴趨勢。各組細(xì)胞的AO染色顯微圖見圖1，熒光強(qiáng)度測定結(jié)果見表1。

3.2 人參根提取物對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

與空白對照組比較，陽性對照組和125、500 μg/mL人參根提取物組細(xì)胞的OD值均顯著升高（P<0.05或P<0.01），其中500 μg/mL人參根提取物組細(xì)胞的存活率達(dá)到了150.00%。由此可見，125～500 μg/mL人參根提取物可刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖。各組細(xì)胞的OD值和存活率測定結(jié)果見表2。

3.3 人參根提取物對小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IL-4、IL-6和TNF-α的影響

與空白對照組比較，各給藥組細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-4、IL-6和TNF-α水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01），表明給藥后可促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌免疫因子IL-4、IL-6和TNF-α，且人參根提取物的作用具有一定的濃度依賴趨勢。各組細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-4、IL-6和TNF-α水平測定結(jié)果見表3。

3.4 人參根提取物對細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與空白對照組比較，125、500 μg/mL人參根提取物組細(xì)胞中LC3BⅡ/LC3BⅠ、p-AMPK/AMPK均顯著升高（P<0.05或P<0.01），p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR均顯著降低（P<0.01）; 32、125、500 μg/mL人參根提取物組細(xì)胞中Beclin-1蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01）。各組細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的電泳圖見圖2，蛋白表達(dá)水平測定結(jié)果見表4。

4 討論

本課題組前期經(jīng)過設(shè)置人參根提取物樣品溶液的系列質(zhì)量濃度梯度，確定了其在32～500 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對小鼠脾淋巴細(xì)胞無毒性，且能夠提高細(xì)胞活性，并具有濃度依賴趨勢。因此，本研究選用32、125、500 μg/mL這3個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)行研究。脾淋巴細(xì)胞增殖是反映機(jī)體細(xì)胞免疫與體液免疫最直接的指標(biāo)[16]。本研究結(jié)果顯示，人參根提取物作用于小鼠脾淋巴細(xì)胞后，細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)。這說明人參根提取物能促進(jìn)小鼠體外淋巴細(xì)胞增殖，具有增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能的作用。

淋巴細(xì)胞是適應(yīng)性免疫應(yīng)答中的關(guān)鍵部分[17]，本研究主要測定了小鼠脾淋巴細(xì)胞中IL-4、IL-6和TNF-α這3種細(xì)胞因子的分泌情況。IL-4是由輔助T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，主要作用于B細(xì)胞，可促進(jìn)B細(xì)胞的增殖[18];IL-6在細(xì)胞吞噬、抗原提呈、炎癥調(diào)節(jié)中均扮演著重要角色，其能夠同時(shí)調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫和體液免疫[19];TNF-α能夠加強(qiáng)免疫反應(yīng)，并誘導(dǎo)其他免疫因子的分泌[20-21]。本研究結(jié)果表明，人參根提取物能夠誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IL-4、IL-6和TNF-α，從而增強(qiáng)免疫功能，并且其作用具有一定的濃度依賴趨勢。

自噬是細(xì)胞吞噬受損的細(xì)胞器及其變性的蛋白質(zhì)，并將吞噬物轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體中進(jìn)行降解和再循環(huán)，是一種廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的自我降解機(jī)制[22]。自噬的激活受多種途徑調(diào)控，其中mTOR信號(hào)傳導(dǎo)途徑為細(xì)胞自噬過程中最重要的調(diào)控途徑，起負(fù)向調(diào)控作用[23]。AMPK是一種絲/蘇氨酸激酶，其活化（磷酸化）后在細(xì)胞生長、自噬、凋亡等生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用[14]。Akt（或稱PKB）同樣也是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，其可協(xié)同磷脂酰肌醇依賴性蛋白激酶1/2促進(jìn)三磷酸磷脂酰肌醇與其自身結(jié)合，Akt由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜并發(fā)生活化（即磷酸化），Akt活化后可激活下游蛋白mTOR（即使其磷酸化）[24]。研究證實(shí)，AMPK/mTOR與Akt/mTOR是兩條經(jīng)典的自噬信號(hào)通路[25-26]。近年來，大量的研究表明，自噬參與淋巴細(xì)胞的發(fā)育、固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答途徑[27]。在過去的10年里，自噬已經(jīng)成為T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、激活和分化的重要調(diào)節(jié)因素，基礎(chǔ)自噬能夠維持T細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，活化誘導(dǎo)的巨自噬被認(rèn)為是細(xì)胞增殖和代謝的關(guān)鍵調(diào)控因素，也是效應(yīng)CD8+T細(xì)胞記憶產(chǎn)生的關(guān)鍵[28]。Beclin1是哺乳類動(dòng)物中第一個(gè)被確認(rèn)的自噬特異性調(diào)控基因，通過BH3區(qū)域、CCD及ECD在細(xì)胞自噬和凋亡過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[29]。LC3是控制自噬膜的形成和自噬體與溶酶體融合的關(guān)鍵蛋白，在自噬體膜的延伸和成熟中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其分為 LC3Ⅰ和LC3Ⅱ兩種亞型，自噬發(fā)生時(shí)，可溶性LC3Ⅰ被活化，并修飾形成LC3-Ⅱ后通過融合蛋白轉(zhuǎn)位至自噬體膜，從而促進(jìn)自噬體的成熟，參與自噬體形成[30-32]。LC3Ⅱ是自噬體的標(biāo)志分子，其含量的多少與自噬泡數(shù)量的多少呈正比，因此自噬程度與 LC3Ⅱ表達(dá)水平呈正相關(guān)[30]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人參根提取物可增加小鼠脾淋巴細(xì)胞自噬水平，使AMPK的磷酸化水平提高，AKT與mTOR的磷酸化水平降低，并可上調(diào)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1的表達(dá)，增加LC3BⅠ到LC3BⅡ的轉(zhuǎn)化[10]，這說明人參根提取物可活化小鼠脾淋巴細(xì)胞，并通過AMPK/mTOR和AKT/mTOR途徑誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。

綜上所述，人參根提取物能通過激活A(yù)MPK、抑制AKT活化來抑制mTOR活性，從而誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞發(fā)生自噬、激活脾淋巴細(xì)胞活性、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌來發(fā)揮免疫增強(qiáng)作用。后續(xù)本課題組將在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探究其作用的分子機(jī)制及其對淋巴細(xì)胞不同亞群的影響。

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（收稿日期：2020-05-22 修回日期：2020-09-21）

（編輯：林 靜）