穿膜肽GGPFV修飾的柔紅霉素/薯蕷皂苷脂質(zhì)體的處方優(yōu)化及細(xì)胞毒性研究

姚雪敏 荊鳴 蔡馥伊 孔亮 李學(xué)濤

摘 要 目的：制備穿膜肽GGPFV修飾的柔紅霉素/薯蕷皂苷脂質(zhì)體，對(duì)其處方進(jìn)行優(yōu)化，并初步評(píng)價(jià)其對(duì)乳腺癌細(xì)胞的體外毒性。方法：采用薄膜分散法和硫酸銨水化法，將柔紅霉素和薯蕷皂苷包載其中，在表面以聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺2000（DSPE-PEG2000）-GGPFV修飾，制備GGPFV修飾的柔紅霉素/薯蕷皂苷脂質(zhì)體。以包封率為指標(biāo)，采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化處方中水化體積、膽固醇用量和柔紅霉素用量;測(cè)定按最優(yōu)處方制備的3批脂質(zhì)體的包封率。比較柔紅霉素/薯蕷皂苷脂質(zhì)體、GGPFV修飾的柔紅霉素/薯蕷皂苷脂質(zhì)體和空白脂質(zhì)體作用后對(duì)人乳腺癌MDA-MB-435S細(xì)胞存活率的影響。結(jié)果：最優(yōu)處方為水化體積5 mL、膽固醇4 mg、蛋黃卵磷脂22 mg、柔紅霉素0.55 mg、薯蕷皂苷0.85 mg、DSPE- PEG2000 3.5 mg、DSPE-PEG2000-GGPFV 2 mg。所制3批脂質(zhì)體中，柔紅霉素的包封率為（96.21±1.54）%，薯蕷皂苷的包封率為（95.39±2.48）%。體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)顯示，GGPFV修飾的柔紅霉素/薯蕷皂苷脂質(zhì)體對(duì)MDA-MB-435S細(xì)胞的抑制作用顯著強(qiáng)于柔紅霉素/薯蕷皂苷脂質(zhì)體（P<0.05），膜材無(wú)細(xì)胞毒性。結(jié)論：成功制得GGPFV修飾的柔紅霉素/薯蕷皂苷脂質(zhì)體，其對(duì)人乳腺癌MDA-MB-435S細(xì)胞的體外抑制作用明顯增強(qiáng)。

關(guān)鍵詞 脂質(zhì)體;GGPFV;柔紅霉素;薯蕷皂苷;處方優(yōu)化;Box-Behnken響應(yīng)面法;細(xì)胞毒性

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To prepare GGPFV-modified Daunorubicin/dioscin liposomes， and to optimize their formulation and to preliminarily evaluate their cytotoxicity to breast cancer cells in vitro. METHODS： Daunorubicin and diosgenin were wrapped by thin film dispersion method and ammonium sulfate hydration method; the surface was modified with DSPE-PEG2000-GGPFV to prepare GGPFV-modified Daunorubicin/dioscin liposomes. Taking encapsulation rate as index， Box-Behnken response surface methodology was used to optimize the film hydration volume， cholesterol amount and daunorubicin amount in the formulation. The entrapment efficiency of 3 batches of liposomes prepared according to the optimal formulation was determined. The effects of Daunorubicin/dioscin liposomes， GGPFV-modified Daunorubicin/dioscin liposomes and blank liposomes on the survival rate of human breast cancer MDA-MB-435S cells were compared. RESULTS： The optimal formulation was as film hydration volume of 5 mL， cholesterol of 4 mg， yolk lecithin of 22 mg， daunorubicin of 0.55 mg， dioscin of 0.85 mg， DSPE-PEG2000 of 3.5 mg， DSPE-PEG2000-GGPFV of 2 mg. The encapsulation rate of daunorubicin was （96.21±1.54）% and that of dioscin was （95.39±2.48）% in the 3 batches of liposomes prepared. The in vitro cytotoxicity tests showed that the inhibition effect of GGPFV-modified Daunorubicin/dioscin liposome on MDA-MB-435S cells was significantly stronger than that of Daunorubicin/dioscin liposome （P<0.05）. There was no cytotoxicity in the membrane. CONCLUSIONS： GGPFV-modified Daunorubicin/dioscin liposomes are successfully prepared， and its inhibitory effect on human breast cancer MDA-MB-435S cells in vitro was significantly enhanced.

KEYWORDS ? Liposome; GGPFV; Daunorubicin; Dioscin; Formulation optimization; Box-Behnken design response surface methodology; Cytotoxicity

柔紅霉素是一種蒽環(huán)類抗腫瘤抗生素，易溶于水且水溶液性質(zhì)穩(wěn)定，被廣泛用于治療急性白血病、慢性粒細(xì)胞性白血病、惡性淋巴瘤、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌等[1-2]。柔紅霉素的抗癌機(jī)制主要是其經(jīng)肝臟代謝可生成柔紅霉素醇，后者可通過(guò)嵌入癌細(xì)胞DNA堿基對(duì)來(lái)改變DNA拓?fù)錉顟B(tài)，并可通過(guò)抑制DNA聚合酶活性及損傷DNA來(lái)影響基因表達(dá)，從而達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞、治療癌癥的目的[3]。但是，柔紅霉素在臨床上表現(xiàn)出骨髓抑制、心肌損傷、胃腸道刺激、肝腎損傷及局部組織壞死等明顯的毒副作用，故有研究者將其包裹在脂質(zhì)體內(nèi)核中，可明顯降低其在機(jī)體其余部位的分布，從而起到降低藥物毒性的作用[4]。薯蕷皂苷是一種天然化合物，廣泛存在于薯蕷科、百合科、石竹科等植物中，具有很高的藥用價(jià)值，常作為抗腫瘤轉(zhuǎn)移佐劑應(yīng)用于癌癥治療研究中[5]。研究表明，薯蕷皂苷可通過(guò)誘導(dǎo)阻滯細(xì)胞周期S期、通過(guò)Caspase途徑誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞分裂增殖等方式干預(yù)癌細(xì)胞的生命過(guò)程[6-8];同時(shí)，其可破壞癌細(xì)胞形成的血管生成擬態(tài)，抵抗癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，從而起到抗癌效果[9]。但是，薯蕷皂苷的水溶性差，導(dǎo)致其生物利用度較低，而將其包載在脂質(zhì)體的磷脂雙分子層中可有效解決這一問(wèn)題[9]。Gly-Gly-Pro-Phe-Val-Tyr-Leu- Ile （GGPFVYLI，簡(jiǎn)稱為“GGPFV”）作為一種穿膜肽，具有水溶性好、可裂解性低、轉(zhuǎn)運(yùn)能力高的優(yōu)點(diǎn);并且其穿透作用無(wú)飽和性，能有效地協(xié)助藥物進(jìn)入細(xì)胞，故將其修飾在脂質(zhì)體表面，可增強(qiáng)脂質(zhì)體的內(nèi)化效率，從而更好地發(fā)揮藥物療效[10]。

脂質(zhì)體是以磷脂雙分子層為基本骨架的類細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，具有較好的生物相容性。本研究通過(guò)薄膜分散法聯(lián)合硫酸銨水化法將柔紅霉素包載在脂質(zhì)體的親水性內(nèi)核中，將薯蕷皂苷包載在脂質(zhì)體的疏水性磷脂雙分子層之間，并在脂質(zhì)體表面修飾GGPFV，制備了GGPFV修飾的柔紅霉素/薯蕷皂苷脂質(zhì)體，以改善柔紅霉素對(duì)機(jī)體的毒副作用，并提高薯蕷皂苷的溶解度;同時(shí)，采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)選了GGPFV修飾的柔紅霉素/薯蕷皂苷脂質(zhì)體的最佳處方，并通過(guò)磺酰羅丹明B（SRB）法考察了所制脂質(zhì)體制劑對(duì)人乳腺癌MDA- MB-435S細(xì)胞的毒性作用，旨在初步考察各脂質(zhì)體對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑制作用，同時(shí)評(píng)價(jià)GGPFV在脂質(zhì)體表面修飾的優(yōu)勢(shì)。

1 材料

1.1 儀器

FA1004型電子分析天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）;DZKW-S-4型電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）;SG3300H型超聲波清洗器（上海冠特超聲儀器有限公司）;RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）;JY92-2D型超聲波細(xì)胞破碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）;20AT型高效液相色譜（HPLC）儀（日本Shimadzu公司）;葡聚糖凝膠（Sephadex）G50柱（上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司）;TS-1000型搖床振蕩器（江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司）;HBS-1096A型酶標(biāo)儀（南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）;YA1072型透析袋MD34（8 000～14 000D）（北京索萊寶科技有限公司）;85-1型磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 藥品與試劑

柔紅霉素對(duì)照品（大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：28008-55-1，純度：>98%）;薯蕷皂苷對(duì)照品（成都德銳可生物科技有限公司，批號(hào)：19057-60-4，純度：≥98%）;蛋黃卵磷脂（EPC，日本NOF公司，純度：>98%）;聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺2000（DSPE-PEG2000，日本NOF公司）;膽固醇（批號(hào)：F0119A）、SRB（批號(hào)：A0702A）均購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司;pH 7.4磷酸緩沖鹽溶液（PBS，北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：1022Q021）;DSPE-PEG2000-GGPFV由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥劑實(shí)驗(yàn)室靶向研究室合成;DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青鏈霉素雙抗、胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;水為娃哈哈牌純凈水，其余試劑均為分析純或色譜純。

1.3 細(xì)胞

人乳腺癌MDA-MB-435S細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，在含10%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，于5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 脂質(zhì)體的制備

通過(guò)薄膜分散法和硫酸銨水化法制備GGPFV修飾的柔紅霉素/薯蕷皂苷脂質(zhì)體。精密稱取膽固醇、EPC、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-GGPFV、薯蕷皂苷各適量，以甲醇溶解后置于圓底燒瓶中，超聲（功率：200 W，頻率：40 kHz，下同）混勻，于40 ℃水浴下減壓旋蒸，待圓底燒瓶中形成一層薄膜后向其中加入250 mmol/L的硫酸銨水溶液5 mL，待薄膜溶解完全后將混懸液轉(zhuǎn)移至10 mL EP管中。將盛有混懸液的EP管置于冰水浴中超聲10 min（超聲間隔5 s，單次超聲時(shí)長(zhǎng)10 s），以防止因過(guò)熱導(dǎo)致脂質(zhì)體破裂。待超聲結(jié)束后，將脂質(zhì)體混懸液連續(xù)2次在0.22 μm聚碳酸酯膜上擠出，以使微粒大小均一化。將擠出后的脂質(zhì)體裝入透析袋，于500 mL PBS中在磁力攪拌下避光透析24 h，每隔8 h更換1次透析液。精密稱取柔紅霉素對(duì)照品適量置圓底燒瓶中，以甲醇溶解，于40 ℃水浴下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑后加入透析后的脂質(zhì)體混懸液，40 ℃水浴下振搖20 min以包載柔紅霉素，即得GGPFV修飾的柔紅霉素/薯蕷皂苷脂質(zhì)體。

按上述制備方法，除不加入柔紅霉素和薯蕷皂苷外，其余步驟相同，制備空白脂質(zhì)體;除不加入DSPE- PEG2000-GGPFV外，其余步驟相同，制備柔紅霉素/薯蕷皂苷脂質(zhì)體。

2.2 柔紅霉素和薯蕷皂苷的含量測(cè)定

采用HPLC法[11-12]測(cè)定樣品含量。

2.2.1 柔紅霉素含量測(cè)定的色譜條件 色譜柱：Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）;流動(dòng)相：乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫鈉溶液（含0.45% 三乙胺，以磷酸調(diào)pH至4）（32 ∶ 68，V/V）;柱溫：30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)：233 nm;流速：1 mL/min;進(jìn)樣量：20 μL。

2.2.2 薯蕷皂苷測(cè)定的色譜條件 色譜柱：Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）;流動(dòng)相：乙腈-水（70 ∶ 30，V/V）;柱溫：30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm;流速：1 mL/min;進(jìn)樣量：20 μL。

2.2.3 溶液的制備 （1）空白溶液：取1 mL空白脂質(zhì)體與3 mL甲醇混合均勻，超聲破乳，即得。（2）供試品溶液：取1 mL GGPFV修飾的柔紅霉素/薯蕷皂苷脂質(zhì)體與3 mL甲醇混合均勻，超聲破乳，即得。（3）柔紅霉素對(duì)照品溶液：精密稱取10 mg柔紅霉素對(duì)照品，以甲醇溶解制成1 mg/mL的柔紅霉素對(duì)照品母液;精密吸取該母液20 μL與980 μL甲醇混合均勻，即得20 μg/mL的柔紅霉素對(duì)照品溶液。（4）薯蕷皂苷對(duì)照品溶液：精密稱取10 mg薯蕷皂苷對(duì)照品，以甲醇溶解制成1 mg/mL的薯蕷皂苷對(duì)照品母液;精密吸取該母液40 μL與960 μL甲醇混合均勻，即得40 μg/mL的薯蕷皂苷對(duì)照品溶液。上述所有溶液均以12 000 r/min離心3 min后取上清液，連續(xù)2次以0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)后使用。

2.2.4 柔紅霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取“2.2.3”項(xiàng)下柔紅霉素對(duì)照品母液適量，加甲醇稀釋制成柔紅霉素質(zhì)量濃度分別為240、120、80、40、20、10 μg/mL的系列對(duì)照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，μg/mL）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=59.335x-19.145（R2=0.999 0），表明柔紅霉素在10～240 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.2.5 薯蕷皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取“2.2.3”項(xiàng)下薯蕷皂苷對(duì)照品母液適量，加甲醇稀釋制成薯蕷皂苷質(zhì)量濃度分別為240、120、80、40、20、10 μg/mL的系列對(duì)照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，μg/mL）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=5.810 9x+14.270（R2=0.999 6），表明薯蕷皂苷在10～240 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.2.6 專屬性考察 取“2.2.3”項(xiàng)下空白溶液、供試品溶液、柔紅霉素對(duì)照品溶液、薯蕷皂苷對(duì)照品溶液各適量，按“2.2.1”“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，詳見(jiàn)圖1。由圖1可知，柔紅霉素和薯蕷皂苷色譜峰在各自的色譜圖中分離度良好，理論板數(shù)分別為31 608（柔紅霉素）和18 635（薯蕷皂苷）;空白溶液均不干擾測(cè)定。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 取“2.2.3”項(xiàng)下柔紅霉素對(duì)照品溶液和薯蕷皂苷對(duì)照品溶液，分別按“2.2.1”“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄色譜圖。結(jié)果，柔紅霉素和薯蕷皂苷峰面積的RSD分別為1.75%、1.84%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取GGPFV修飾的柔紅霉素/薯蕷皂苷脂質(zhì)體，共6份，分別按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，并按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算柔紅霉素和薯蕷皂苷的含量。結(jié)果，兩者含量的RSD分別為1.55%、0.70%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)，按“2.2.1”“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，柔紅霉素和薯蕷皂苷峰面積的RSD分別為1.62%、1.40%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 按“2.1”項(xiàng)下方法制備GGPFV修飾的柔紅霉素/薯蕷皂苷脂質(zhì)體，平行制備6份，加入等體積甲醇，稱定質(zhì)量，超聲破乳，靜置15 min后重新稱定并以甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，再以12 000 r/min離心3 min，取上清液，即得破乳液。將已知成分含量的破乳液與相應(yīng)對(duì)照品溶液按1 ∶ 1（m/m）混合均勻，連續(xù)2次以0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，按“2.2.1”“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，柔紅霉素和薯蕷皂苷的平均加樣回收率分別為103.64%、99.83%，RSD分別為0.98%、0.92%（n=6），表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.3 GGPFV修飾的柔紅霉素/薯蕷皂苷脂質(zhì)體包封率的測(cè)定

取GGPFV修飾的柔紅霉素/薯蕷皂苷脂質(zhì)體1 mL，以PBS為洗脫劑，按1 mL/min的流速在Sephadex G50凝膠柱上層析分離，收集乳光部分，以PBS定容至1 mL，取0.5 mL，與0.5 mL甲醇混勻后，超聲破乳并以0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，備用。另取GGPFV修飾的柔紅霉素/薯蕷皂苷脂質(zhì)體0.5 mL，加入0.5 mL甲醇后超聲破乳，并以0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)后備用。將上述溶液分別按“2.2.1”“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算柔紅霉素和薯蕷皂苷的含量，并通過(guò)以下公式計(jì)算包封率：包封率（%）=Wa/Wb[Wa代表柔紅霉素（或薯蕷皂苷）過(guò)柱后的含量，Wb代表柔紅霉素（或薯蕷皂苷）過(guò)柱前的含量]。

2.4 處方優(yōu)化

采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化處方。根據(jù)本課題組前期研究結(jié)果[13]及文獻(xiàn)方法[14]，本研究考察了膽固醇用量（A）、水化體積（B）、柔紅霉素用量（C）3個(gè)因素對(duì)包封率的影響。以包封率加權(quán)值（Y）為考察指標(biāo)，Y=50%×（Y1+Y2），其中Y1表示柔紅霉素的包封率，Y2表示薯蕷皂苷的包封率。固定EPC用量為22 mg、柔紅霉素與薯蕷皂苷的摩爾比為1 ∶ 1，確定各因素的范圍（A：1～7 mg;B：1～5 mL;C：0.5～1 mg），每因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平。因素與水平見(jiàn)表1;Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

根據(jù)表2結(jié)果，通過(guò)Design Expert 8.0.6軟件得到了Y的擬合方程：Y=46.480 1-8.522 5A-1.011 7B+159.423 3C+1.087 9AB+3.326 7AC+4.730 0BC+0.349 6A2- 0.104 7B2-173.460 0C2（R2=0.918 2，P<0.05）。由此表明，該擬合模型可較好地反映響應(yīng)值Y的變化，可用于篩選GGPFV修飾的柔紅霉素/薯蕷皂苷脂質(zhì)體的最佳處方。對(duì)上述擬合模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，B、C、AB、BC、B2、C2項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值Y具有顯著影響（P<0.05），而A、AC、A2項(xiàng)對(duì)其無(wú)顯著影響（P>0.05）。固定其中任一因素水平為0，即可生成其余2個(gè)因素對(duì)包封率影響的等高線圖（圖2）和響應(yīng)面圖（圖3）。由圖2、圖3可見(jiàn)，在固定磷脂用量、柔紅霉素與薯蕷皂苷摩爾比的情況下，B和C對(duì)響應(yīng)值Y的影響較大，而A對(duì)其無(wú)顯著影響。

根據(jù)本課題組前期研究結(jié)果以及上述處方優(yōu)化結(jié)果，將GGPFV修飾的柔紅霉素/薯蕷皂苷脂質(zhì)體最優(yōu)處方確定為水化體積5 mL、膽固醇4 mg、EPC 22 mg、柔紅霉素0.55 mg、薯蕷皂苷0.85 mg，DSPE-PEG2000 3.5 mg、DSPE-PEG2000-GGPFV 2 mg。依照該處方平行制備3批GGPFV修飾的柔紅霉素/薯蕷皂苷脂質(zhì)體，并測(cè)定其包封率。結(jié)果顯示，柔紅霉素的包封率為（96.21±1.54）%，預(yù)測(cè)值為98.05%，相對(duì)誤差為1.91%;薯蕷皂苷的包封率為（95.39±2.48）%，預(yù)測(cè)值為82.71%，相對(duì)誤差為13.29%。另對(duì)按上述方法（不加DSPE- PEG2000-GGPFV）制備的柔紅霉素/薯蕷皂苷脂質(zhì)體的包封率進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示柔紅霉素的包封率為（91.38±2.53）%，薯蕷皂苷的包封率為（92.01±1.86）%，表明GGPFV修飾對(duì)兩藥的包封率無(wú)明顯影響。

2.5 不同脂質(zhì)體制劑對(duì)人乳腺癌MDA-MB-435S細(xì)胞的抑制作用

采用SRB法[15]測(cè)定空白脂質(zhì)體、柔紅霉素/薯蕷皂苷脂質(zhì)體、GGPFV修飾的柔紅霉素/薯蕷皂苷脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人乳腺癌MDA-MB-435S細(xì)胞鋪在96孔板上，鋪板密度為1.7×104個(gè)/孔，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，待其長(zhǎng)滿單層后，分別向孔中加入以上3種脂質(zhì)體制劑。將脂質(zhì)體中柔紅霉素的濃度梯度調(diào)整為0.5、1、2、4、6、8、10 μmol/L，以DMEM培養(yǎng)基為空白對(duì)照，每個(gè)濃度設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，給藥后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。吸棄培養(yǎng)液，將細(xì)胞在4 ℃的10%三氯乙酸溶液中固定1 h，棄去固定液并用水洗板5次;晾干，以SRB試劑染色30 min，1%冰醋酸溶液洗板5次以清除多余SRB;晾干，每孔加入200 μL Tris堿溶液，于搖床振蕩器振蕩30 min后，用酶標(biāo)儀于540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞存活率[細(xì)胞存活率（%）=藥物組OD值/空白對(duì)照組OD值×100%]并繪制存活率曲線，詳見(jiàn)圖4。

由圖4可知，空白脂質(zhì)體對(duì)人乳腺癌MDA-MB- 435S細(xì)胞幾乎沒(méi)有細(xì)胞毒性，而柔紅霉素/薯蕷皂苷脂質(zhì)體和GGPFV修飾的柔紅霉素/薯蕷皂苷脂質(zhì)體可使MDA-MB-435S細(xì)胞存活率降低，表現(xiàn)出一定細(xì)胞毒性。經(jīng)Graphpad Prism 7.0軟件計(jì)算可得兩種含藥脂質(zhì)體的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為（8.87±0.12）、（5.53±0.09） μmol/L。利用SPSS 17.0軟件對(duì)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，可得不同脂質(zhì)體對(duì)MDA-MB-435S細(xì)胞的抑制作用大小排序：GGPFV修飾的柔紅霉素/薯蕷皂苷脂質(zhì)體>柔紅霉素/薯蕷皂苷脂質(zhì)體>空白脂質(zhì)體，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果表明，該脂質(zhì)體的膜材對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，且GGPFV的修飾增強(qiáng)了含藥脂質(zhì)體對(duì)人乳腺癌MDA- MB-435S細(xì)胞的抑制作用。

3 討論

柔紅霉素作為一種臨床常用的抗腫瘤藥，因其靶向性較低，導(dǎo)致對(duì)機(jī)體會(huì)產(chǎn)生毒副作用[16-17];薯蕷皂苷可通過(guò)多通路、多靶點(diǎn)、多途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移，然而其疏水性限制了其臨床應(yīng)用[18]。將柔紅霉素和薯蕷皂苷同時(shí)包載到脂質(zhì)體中的制劑策略可顯著彌補(bǔ)兩藥在應(yīng)用中的不足（柔紅霉素被包載于脂質(zhì)體的親水性內(nèi)核，薯蕷皂苷被包載于疏水性的磷脂雙分子層之間）。脂質(zhì)體具有可穿過(guò)腫瘤區(qū)域微血管內(nèi)皮間隙的理想粒徑（20～200 nm），可通過(guò)高滲透長(zhǎng)滯留（EPR）效應(yīng)進(jìn)入腫瘤組織，使藥物盡可能多地分布在腫瘤區(qū)域[19];GGPFV作為一種高效新型穿膜肽，可攜帶藥物或藥物載體通過(guò)胞吞作用進(jìn)入癌細(xì)胞[14]。本研究通過(guò)薄膜分散法和硫酸銨水合法制備GGPFV修飾的柔紅霉素/薯蕷皂苷脂質(zhì)體，將GGPFV修飾在脂質(zhì)體表面，可增加癌細(xì)胞對(duì)藥物的攝入量，增強(qiáng)抗癌效果。同時(shí)，通過(guò)人乳腺癌MDA-MB-435S細(xì)胞體外抑制試驗(yàn)證實(shí)，GGPFV修飾的柔紅霉素/薯蕷皂苷脂質(zhì)體的細(xì)胞抑制作用強(qiáng)于未加GGPFV修飾的柔紅霉素/薯蕷皂苷脂質(zhì)體。

近年來(lái)，研究者多以正交設(shè)計(jì)方法優(yōu)化藥物脂質(zhì)體制劑處方及制備工藝，方法雖簡(jiǎn)單，但是優(yōu)選結(jié)果不會(huì)超越所取水平的范圍，不能給深入優(yōu)化研究提供明確的指向性。而B(niǎo)ox-Behnken響應(yīng)面法具有試驗(yàn)設(shè)計(jì)水平數(shù)偏少、預(yù)測(cè)準(zhǔn)確、更具經(jīng)濟(jì)性的優(yōu)勢(shì)[20-21]，因而本研究采用該方法優(yōu)化GGPFV修飾的柔紅霉素/薯蕷皂苷脂質(zhì)體處方。結(jié)果表明，GGPFV修飾的柔紅霉素/薯蕷皂苷脂質(zhì)體的最優(yōu)處方為：水化體積5 mL、膽固醇 4 mg、EPC 22 mg、柔紅霉素0.55 mg、薯蕷皂苷0.85 mg、DSPE- PEG2000 3.5 mg、DSPE-PEG2000-GGPFV 2 mg。按照最優(yōu)處方平行制備了3批樣品并測(cè)定其包封率，結(jié)果均符合2015年版《中國(guó)藥典》（四部）要求[22]。

綜上所述，本研究篩選了GGPFV修飾的柔紅霉素/薯蕷皂苷脂質(zhì)體的最優(yōu)處方，測(cè)定了所得脂質(zhì)體中柔紅霉素和薯蕷皂苷的藥物含量，并比較了空白脂質(zhì)體、柔紅霉素/薯蕷皂苷脂質(zhì)體、GGPFV修飾的柔紅霉素/薯蕷皂苷脂質(zhì)體對(duì)人乳腺癌MDA-MB-435S細(xì)胞的毒性，確定了GGPFV修飾的柔紅霉素/薯蕷皂苷脂質(zhì)體可應(yīng)用于進(jìn)一步的抗乳腺癌研究。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 林鵬.不同蒽環(huán)類藥物為基礎(chǔ)的誘導(dǎo)方案治療成人初治急性髓系白血病的療效觀察[D].石家莊：河北醫(yī)科大學(xué)，2016.

[ 2 ] JU RJ，CHENG L，PENG XM，et al. Octreotide-modified liposomes containing daunorubicin and dihydroartemi- sinin for treatment of invasive breast cancer[J]. Artificial Cells，2018，46（Suppl 1）：1-13.

[ 3 ] 李丁. NF-κB/LncRNA-uc002jit.1/PARP1形成環(huán)路調(diào)節(jié)柔紅霉素誘導(dǎo)的急性髓系白血病細(xì)胞DNA損傷修復(fù)[D].福州：福建醫(yī)科大學(xué)，2019.

[ 4 ] LIU XL，HAN MT，XU JW，et al. Asialoglycoprotein receptor-targeted liposomes loaded with a norcantharimide derivative for hepatocyte-selective targeting[J]. Int J Pharm，2017，520（1/2）：98-110.

[ 5 ] 宋正偉，張奇能.薯蕷皂苷下調(diào)ABCC1表達(dá)對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2/ADM耐藥的影響[J].中國(guó)藥師，2020，23（1）：34-39.

[ 6 ] ZHAO XW，TAOXF，XU LN，et al. Dioscin induces apoptosis in human cervical carcinoma HeLa and SiHa cells through ROS-mediated DNA damage and the mitochon- drial signaling pathway[J]. Molecules，2016. DOI：10. 3390/molecules21060730.

[ 7 ] DING QY，ZHANG WD，CHENG C，et al. Dioscin inhi- bits the growth of human osteosarcoma by inducing ? ? ? G2/M-phase arrest，apoptosis，and GSDME-dependent cell death in vitro and in vivo[J]. J Cell Physiol，2020，235（3）：2911-2924.

[ 8 ] ZHANG YS，MA YL，THAKUR K，et al. Molecular me- chanism and inhibitory targets of dioscin in HepG2 cells[J]. Food ChemToxicol，2018. DOI：10.1016/j.fct. 2018.07.016.

[ 9 ] KONG L，CAI FY，YAO XM，et al. RPV-modified epirubicin and dioscin co-delivery liposomes suppress non- small cell lung cancer growth by limiting nutrition supply[J]. Cancer Sci，2020，111（2）：621-636.

[10] R?DIS-BAPTISTA G，CAMPELO IS，MORLIGHEM JRL，et al. Cell-penetrating peptides （CPPs）：from delivery of nucleic acids and antigens to transduction of engineered nucleases for application in transgenesis[J]. J Biotechnol，2017. DOI：10.1016/j.jbiotec.2017.05. 002.

[11] 黃周鋒，胡筱希，黃建猷，等. Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化小槐花中檸檬酚的超聲輔助乙醇-硫酸銨雙水相提取工藝[J].中國(guó)藥房，2020，31（9）：1085-1090.

[12] WANG YY，F(xiàn)U M，LIU JJ，et al. Inhibition of tumor metastasis by targeted daunorubicin and dioscincodelivery liposomes modified with PFV for the treatment of non-small-cell lung cancer[J]. Int J Nanomedicine，2019，DOI：10.2147/IJN.S194304.

[13] YAO XM，NIU FJ，KONG L，et al. GGP modified daunorubicin plus dioscin liposomes inhibit breast cancer by suppressing epithelial-mesenchymal transition[J]. Drug Dev Ind Pharm，2020，46（6）：916-930.

[14] 高菲，劉莉.酒石酸長(zhǎng)春瑞濱殼聚糖納米粒的制備及質(zhì)量評(píng)價(jià)[J].西北藥學(xué)雜志，2019，34（2）：217-222.

[15] LIU JJ，TANG W，F(xiàn)U M，et al. Development of R8 modified epirubicin-dihydroartemisinin liposomes for treatment of non-small-cell lung cancer[J]. Artif Cells Nanomed Biotechnol，2019，47（1）：1947-1960.

[16] 康瑜，謝紅軍. OCT修飾柔紅霉素與雙氫青蒿素脂質(zhì)體的處方優(yōu)選及主藥含量測(cè)定[J].西藏醫(yī)藥，2019，40（4）：19-22.

[17] 張紅. pH敏感羧甲基殼聚糖-柔紅霉素納米載藥系統(tǒng)的構(gòu)建與評(píng)價(jià)[D].武漢：武漢理工大學(xué)，2016.

[18] GUO XQ，DING X. Dioscin suppresses the viability of ovarian cancer cells by regulating the VEGFR2 and PI3K/AKT/MAPK signaling pathways[J]. Oncol Lett，2018，15（6） ：9537-9542.

[19] 王海軍.仿生響應(yīng)性納米載藥體系用于腫瘤精準(zhǔn)診療研究[D].上海：東華大學(xué)，2020.

[20] 許天陽(yáng)，董坤園，宋鳳媛，等. Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化炒赤芍炮制工藝[J].中國(guó)藥房，2019，30（20）：2845-2850.

[21] 劉聰，梁廣裕，周韻秋，等.白藜蘆醇聚合物膠束制備工藝的Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2020，31（4）：856-859.

[22] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：四部[S]. 2015年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：371-374.

（收稿日期：2020-02-17 修回日期：2020-09-21）

（編輯：胡曉霖）