參附注射液對LPS誘導的RAW264.7細胞HMGB1核轉位的干預作用

艾飛 劉霞 黎暉 褚春薇 陳向云 郭俊峰 楊毅 梅麗艷 苗紀飛 溫泉 葉森

摘 要 目的：探討參附注射液（SFI）對脂多糖（LPS）誘導的巨噬細胞中高遷移率族蛋白B1（HMGB1）核轉位的干預作用。方法：以經(jīng)LPS誘導的小鼠單核巨嗜細胞RAW264.7為對象，以組蛋白去乙?；敢种苿㏑GFP966為陽性對照，在CCK-8法篩選給藥劑量的基礎上，采用免疫熒光法觀察低、中、高劑量（3、6、12 μL/mL）SFI對細胞中HMGB1核轉位的影響，采用實時熒光聚合酶鏈式反應法檢測細胞中HMGB1 mRNA的表達情況;采用Western blotting法檢測細胞中HMGB1、Toll樣受體4（TLR4）的表達情況，并比較細胞胞核、胞漿中HMGB1的表達情況;采用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測細胞上清液中HMGB1、白細胞介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平。結果：在空白對照組中，HMGB1主要定位于細胞核;經(jīng)LPS誘導后，HMGB1由細胞核向胞漿遷移。與空白對照組比較，LPS組細胞中HMGB1 mRNA及其蛋白、TLR4的蛋白表達量以及上清液中HMGB1、IL-1β、TNF-α水平均顯著升高（P<0.01）;細胞胞核中HMGB1的蛋白表達量顯著降低，而胞漿中HMGB1的蛋白表達量顯著升高（P<0.01）。經(jīng)SFI作用后，各給藥組細胞HMGB1的核移位及分泌均受到不同程度的抑制;與LPS組比較，各給藥組細胞中HMGB1 mRNA及其蛋白的表達量，陽性對照組和SFI中、高劑量組細胞中TLR4的蛋白表達量以及各給藥組細胞上清液中HMGB1、IL-1β、TNF-α水平均顯著降低（P<0.01）;陽性對照組和SFI中、高劑量組細胞胞核中HMGB1的蛋白表達量均顯著升高，而各給藥組細胞胞漿中HMGB1的蛋白表達量均顯著降低（P<0.01）。結論：SFI可能通過抑制RAW264.7細胞中HMGB1的核移位及分泌出胞，避免炎癥通路的激活和炎癥因子的產(chǎn)生，從而發(fā)揮減輕LPS致炎癥反應的作用。

關鍵詞 參附注射液;RAW264.7細胞;高遷移率族蛋白B1;炎癥因子;核轉位

ABSTRACT?OBJECTIVE： To investigate the intervention effect of Shenfu injection （SFI） on the nuclear translocation of high mobility group box 1（HMGB1） in lipopolysaccharide （LPS）-induced RAW264.7 cells. METHODS： Using LPS-induced RAW264.7 cells as objects， the histone deacetylase inhibitor RGFP966 as positive control， CCK-8 assay was used to screen drug dosage， and the effects of low， medium and high doses （3， 6， 12 μL/mL） of SFI on HMGB1 nuclear translocation in RAW264.7 cells were observed by immunofluorescence method; mRNA expression of HMGB1 in RAW264.7 cells were detected by real time fluorescent PCR. Western blotting assay was used to determine protein expression of HMGB1 and Toll-like receptor 4（TLR4）; the expression of HMGB1 were compared between nucleus and cytoplasm. The levels of HMGB1， IL-1β and TNF-α in supernatant of cells were detected by ELISA. RESULTS： In blank control group， HMGB1 was mainly located in the nucleus; after LPS induction， HMGB1 migrated from nucleus to cytoplasm. Compared with blank control group， mRNA and protein expression of HMGB1， protein expression of TLR4 in RAW264.7 cells as well as the levels of HMGB1， IL-1β and TNF-α in supernatant of cells were increased significantly in LPS group （P<0.01）. The protein expression of HMGB1 was decreased significantly in nucleus while was increased significantly in cytoplasm （P<0.01）. After SFI treatment， the nuclear translocation and secretion of HMGB1 were inhibited in different degrees; compared with LPS group， mRNA and protein expression of HMGB1 in administration groups， protein expression of TLR4 in RAW264.7 cells of positive control group， SFI medium- and high-dose groups as well as the levels of HMGB1， IL-1β and TNF-α in supernatant of cells in administration groups were decreased significantly （P<0.01）. In positive control group， SFI medium- and high-dose groups， the protein expressions of HMGB1 in nucleus were increased significantly， while protein expressions of HMGB1 in cytoplasm were decreased significantly （P<0.01）. CONCLUSIONS： SFI may inhibit the nuclear translocation and secretion of HMGB1 in RAW264.7 cells， thus avoiding the activation of inflammatory pathways and the production of inflammatory factors， so as to reduce the inflammatory response induced by LPS.

KEYWORDS ? Shenfu injection; RAW264.7 cells; HMGB1; Inflammatory factors; Nuclear translocation

感染性休克的病程發(fā)展與免疫細胞過度激活有關，大量炎癥因子的產(chǎn)生使得炎癥反應從可控進展為不可控，最終導致患者多器官功能衰竭，甚至死亡[1]。高遷移率族蛋白B1（High mobility group box 1，HMGB1）為感染性休克晚期的致死性炎癥因子，在細菌脂多糖（LPS）等致炎因子的作用下，定位于細胞核內(nèi)的HMGB1將向胞漿遷移，最后分泌出胞，在胞外的HMGB1通過結合細胞膜上的晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）和Toll樣受體4（TLR4）來啟動炎癥反應，共同激活核因子κB（NF-κB）及下游炎癥因子級聯(lián)反應，這可能是感染性休克高死亡率的原因之一[2-4]。

中醫(yī)認為，感染性休克屬“厥脫”范疇，運用源自《傷寒論》四逆加人參湯的參附注射液（SFI）治療具有較好的效果[5-6]。本課題組前期通過動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，SFI可抑制內(nèi)毒素休克模型大鼠肺組織中HMGB1的轉錄、表達和血漿中HMGB1的分泌水平，但其機制還有待深入研究[7-8]。在此基礎上，本研究擬考察SFI對LPS誘導的RAW264.7細胞中HMGB1蛋白核轉位的影響及可能機制，以期為SFI的臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Form 321型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）;EnSpire型多功能酶標儀（美國PerkinElmer公司）;DHP-9012型恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）;PowerPac300型電泳儀、170-3930型轉膜儀、CFX96型熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）儀（美國Bio-Rad公司）;GN98-ⅢD超聲波細胞裂解儀（上海谷寧儀器有限公司）;Tanon 5200型全自動化學發(fā)光圖像分析儀（上海天能科技有限公司）;Ama240型高壓滅菌鍋（英國Astell公司）;LSM800型激光共聚焦掃描顯微鏡（德國Leica公司）;SW-CJ-2D型超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）;CKX41型普通光學倒置顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 藥品與試劑

參附注射液（雅安三九藥業(yè)有限公司，批號：20170324，規(guī)格：10 mL）;RGFP966原料藥[美國Selleck公司，批號：S7229，純度：≥98%，用二甲基亞砜（DMSO）溶解至10 mmol/L，于4 ℃保存，備用];LPS（美國Sigma公司，批號：20170920，純度：≥99%;來源于大腸桿菌055：B5，用水配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的工作溶液，于4 ℃保存，備用）;DMEM高糖培養(yǎng)基（美國HyClone公司，批號：AD16191267）;0.25%胰酶（批號：0035017）、胎牛血清（FBS，批號：1741844）均購自以色列Biological Industries公司;青霉素/鏈霉素雙抗（北京索萊寶科技有限公司，批號：AD20170804）;BCA蛋白定量試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司，批號：SL260210）;核/漿蛋白分離試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司，批號：20170605）;兔HMGB1單克隆抗體（美國Epitomics公司，批號：YH081809）;兔TLR4單克隆抗體（批號：ab13556）、辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG二抗（批號：GR313248-1）、CCK-8試劑盒（批號：ab228554）均購自英國Abcam公司;兔β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體（批號：AA128-1）、兔H3單克隆抗體（批號：AF0009）、Cy3標記的山羊抗兔IgG二抗（批號：A0516）、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染料（批號：C1002）、Trizol試劑（批號：101006）、苯甲磺酰氟（PMSF）蛋白酶抑制劑（批號：410051）、磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4，批號：ST476）、Triton X-100試劑（批號：SY1020）、吐溫20（批號：ST825）、山羊血清（批號：C0265）、RIPA裂解液（批號：P0013B）均購自碧云天生物技術研究所;逆轉錄試劑盒（批號：M20100）、定量聚合酶鏈反應（qPCR）試劑盒（批號：M30510）均購自北京全式金生物科技有限公司;ECL化學發(fā)光試劑盒（美國Millipore公司，批號：1801501）;小鼠HMGB1（批號：M173318-215a）、腫瘤壞死因子α（TNF-α，批號：M170318- 102a）、白細胞介素1β（IL-1β，批號：M190325-318a）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測試劑盒均購自欣博盛生物科技有限公司;PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設計、合成（見表1）;其余試劑均為實驗室常用規(guī)格，水為超純滅菌水。

1.3 細胞

小鼠單核巨噬細胞RAW264.7細胞株購自中國科學院上海細胞庫。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

將RAW264.7細胞置于含10%FBS、青霉素/鏈霉素雙抗（青霉素、鏈霉素濃度分別為100 U/mL、100 μg/mL）的DMEM高糖培養(yǎng)基中（以下簡稱“培養(yǎng)基”），于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)條件下同）。使用倒置顯微鏡觀察示細胞呈圓形且折光性好，部分細胞突起。取對數(shù)生長期（融合度達70%～80%）的細胞進行后續(xù)試驗。

2.2 給藥劑量篩選

取RAW264.7細胞適量，經(jīng)胰酶消化、計數(shù)后，按5×103個/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)至對數(shù)生長期。將細胞隨機分為對照組和藥物組（SFI最終劑量分別為1、2、4、8、12、16、20 μL/mL，劑量設置參考前期研究方法[9]和預試驗結果）。對照組加入培養(yǎng)基100 μL，各藥物組加入含相應量SFI的培養(yǎng)基100 μL，每組設5個復孔;同時，設置5個不含細胞、只含培養(yǎng)基100 μL的空白孔。細胞培養(yǎng)24 h后，加入CCK-8溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，使用酶標儀于450 nm波長處測量各孔光密度（OD）值，并計算細胞存活率：細胞存活率（%）=（檢測孔OD值-空白孔OD值）/（對照組孔OD值-空白孔OD值）×100%。選擇不影響細胞存活率的最高劑量作為后續(xù)試驗的高劑量，并以其1/2、1/4分別作為中、低劑量。

2.3 SFI對LPS誘導RAW264.7細胞炎癥反應的干預作用考察

2.3.1 細胞中HMGB1定位觀察 采用免疫熒光法檢測。參照文獻方法[10]制作細胞炎癥模型，將滅菌蓋玻片置于24孔板（每孔含培養(yǎng)基0.5 mL）中，取對數(shù)生長期細胞，按2×104個/孔滴加至各孔蓋玻片上，培養(yǎng)24 h后，將細胞隨機分為空白對照組、LPS組、陽性對照組（RGFP966，最終濃度為10 μmol/L[11]）和SFI低、中、高劑量組（劑量設置參考“2.2”項下結果），空白對照組加入含雙抗、不含血清的DMEM高糖培養(yǎng)基（以下簡稱“完全培養(yǎng)基”）0.5 mL，LPS組加入含0.2 μg/mL LPS的完全培養(yǎng)基0.5 mL，各給藥組先加入等量LPS培養(yǎng)30 min后再加入含相應藥物的完全培養(yǎng)基0.5 mL，每組設3個復孔。細胞培養(yǎng)24 h后，用4 ℃預冷的PBS清洗，置于4%多聚甲醛溶液中室溫固定20 min;用PBS清洗3次，加入0.5% TritonX-100試劑適量，室溫反應20 min;用PBS清洗5 min×3次，以10%山羊血清封閉1 h;加入HMGB1一抗（稀釋度為1 ∶ 200），于4 ℃孵育過夜;用磷酸鹽吐溫緩沖溶液（PBST）清洗5 min×3次，加入Cy3標記的二抗（稀釋度為1 ∶ 500），室溫避光孵育1 h;用PBST清洗5 min×4次（此步驟及后續(xù)所有步驟均需避光操作），以DPAI染料（1 mL反應液中加入DPAI染液1 μL）染核5 min;用PBST清洗5 min×4次，用含熒光淬滅劑的甘油封片后，置于激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察HMGB1的染色情況及其在細胞內(nèi)的定位并拍照。

2.3.2 細胞中HMGB1 mRNA表達情況檢測 采用實時熒光PCR法檢測。取對數(shù)生長期細胞，按1×105個/孔接種于6孔板中，按“2.3.1”項下方法分組、給藥（每孔總體積為2 mL）。細胞培養(yǎng)24 h后，用Trizol試劑提取細胞總RNA，采用逆轉錄試劑盒將其逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應體系（共20 ? ? ?μL）：cDNA模板1 μL、dNTP 0.2 μL、上/下游引物各0.15 μL、Taq酶0.2 μL、PCR Buffer 2 μL、ddH2O 16.3 μL。反應條件：95 ℃預變性3 min;95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法[12]計算HMGB1 mRNA的表達量。

2.3.3 細胞中HMGB1、TLR4蛋白表達情況檢測 采用Western blotting法檢測。取對數(shù)生長期細胞，按“2.3.2”項下方法分組、給藥，培養(yǎng)24 h后，各組取部分細胞用4 ℃預冷的PBS清洗2次，加入RIPA裂解液（含PMSF蛋白酶抑制劑）200 μL，于冰上裂解30 min，以12 000 r/min離心15 min，取上清液，即得總蛋白。按核/漿蛋白試劑盒說明書方法提取蛋白：各組取另一部分細胞加預冷的Buffer A 200 μL，渦旋劇烈振搖15 s，冰上放置15 min;加預冷的Buffer B 11 μL，渦旋劇烈振搖5 s，冰上放置1 min;于4 ℃下以12 500 r/min離心5 min后，收集上清液，即得漿蛋白。在離心沉淀物（即細胞核）中加入預冷的Buffer C 100 μL，超聲（功率：150 W，頻率：25 kHz）裂解2 min，冰上放置40 min，其間每隔10 min渦旋15 s;于4 ℃下以12 500 r/min離心10 min，收集上清液，即得核蛋白。采用BCA法檢測總蛋白濃度后，沸水煮5 min使蛋白變性。取變性蛋白適量，經(jīng)SDS-PAGE分離后，轉移至PVDF膜上，以脫脂牛奶室溫封閉2 h，再分別加入HMGB1、TLR4、β-actin、H3一抗（稀釋度均為1 ∶ 1 000），于4 ℃孵育過夜;用三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（TBST）溶液清洗3次，加入HRP標記的二抗（稀釋度為1 ∶ 5 000），室溫孵育1 h;用TBST溶液清洗3次，以ECL法顯色后，于全自動化學發(fā)光圖像分析儀上成像。采用Image J 1.8.0軟件分析圖像，以目標蛋白與內(nèi)參（總蛋白、漿蛋白內(nèi)參：β-actin;核蛋白內(nèi)參：H3）條帶灰度值的比值作為目標蛋白的表達量，分別記為細胞中HMGB1、TLR4蛋白以及細胞胞核、胞漿中HMGB1蛋白的表達量。

2.3.4 細胞上清液中炎癥因子水平檢測 采用ELISA法檢測。取對數(shù)生長期細胞，按“2.3.2”項下方法分組、給藥，培養(yǎng)24 h后，收集細胞上清液，以酶標儀檢測各細胞上清液中HMGB1、IL-1β、TNF-α的水平。嚴格按照相應試劑盒說明書操作，孵育過程在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進行。

2.4 統(tǒng)計學方法

上述各項試驗均平行操作3次。采用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料均以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 給藥劑量篩選結果

與對照組比較，SFI 16 μL/mL組細胞的存活率顯著降低（P<0.05）;而其余各劑量組細胞存活率與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），詳見表2。基于此，本研究選擇12 μL/mL作為SFI高劑量，6、3 μL/mL分別作為中、低劑量進行后續(xù)試驗。

3.2 SFI對LPS誘導的RAW264.7細胞中HMGB1核轉位的影響

SFI對LPS誘導的RAW264.7細胞中HMGB1核轉位影響的顯微圖見圖1（圖中，“Cy3”“DAPI”分別標記胞內(nèi)、胞核HMGB1蛋白，“Merge”為前兩者重疊）。由圖1可見，空白對照組中，Cy3標記的HMGB1主要定位于胞核，與DAPI標記的胞核重疊;LPS組中，可見HMGB1同時定位于胞核和胞漿中（圖中白色箭頭所示為遷移至胞漿的HMGB1，下同），提示LPS可促進HMGB1從胞核向胞漿遷移;各給藥組中，HMGB1主要定位于胞核中，其遷移較LPS組減少，提示SFI可抑制LPS誘導的HMGB1核轉位。

3.3 SFI對LPS誘導的RAW264.7細胞中HMGB1 mRNA表達的影響

與空白對照組比較，LPS組細胞中HMGB1 mRNA的表達量顯著升高（P<0.01）;與LPS組比較，各給藥組細胞中HMGB1 mRNA的表達量均顯著降低（P<0.01），詳見表3。

3.4 SFI對LPS誘導的RAW264.7細胞中HMGB1、TLR4蛋白表達的影響

與空白對照組比較，LPS組細胞中HMGB1、TLR4蛋白的表達量均顯著升高（P<0.01）;與LPS組比較，各給藥組細胞中HMGB1蛋白的表達量以及陽性對照組和SFI中、高劑量組細胞中TLR4蛋白的表達量均顯著降低（P<0.01），詳見圖2、表4。

3.5 SFI對LPS誘導的RAW264.7細胞胞核、胞漿中HMGB1蛋白表達的影響

與空白對照組比較，LPS組細胞胞核中HMGB1蛋白表達量顯著降低，而胞漿中HMGB1蛋白表達量顯著升高（P<0.01）;與LPS組比較，陽性對照組和LPS中、高劑量組細胞胞核中HMGB1蛋白表達量均顯著升高，各給藥組細胞胞漿中HMGB1蛋白表達量均顯著降低（P<0.01），詳見圖3、表5。

3.6 SFI對LPS誘導的RAW264.7細胞上清液中HMGB1、IL-1β、TNF-α水平的影響

與空白對照組比較，LPS組細胞上清液中HMGB1、IL-1β、TNF-α水平均顯著升高（P<0.01）;與LPS組比較，各給藥組細胞上清液中HMGB1、IL-1β、TNF-α水平均顯著降低（P<0.01），詳見表6。

4 討論

內(nèi)毒素休克屬于感染性休克，多因感染革蘭氏陰性菌后機體多種免疫細胞釋放促炎因子，進一步誘發(fā)全身性炎癥反應綜合征及器官功能障礙等病理反應[1]。根據(jù)祖國醫(yī)學的辨證思維，內(nèi)毒素休克是因邪盛正衰、正氣欲脫而邪毒欲閉，屬于中醫(yī)外感病“厥脫”范疇[5-6]。SFI組方源自《傷寒論》四逆加人參湯，由紅參、附子組成。方中，紅參為君藥，具益氣固脫，回陽救逆之效;附子為臣藥，可補火助陽，尚能溫經(jīng)止痛、通痹散結;兩藥配伍，共奏回陽救逆、益氣固脫之效，故臨床上將其用于治療外感陽氣脫失的外感厥脫證，即感染性休克、失血性休克等[13-16]，但其具體作用機制還有待深入研究和完善。

HMGB1是由215個氨基酸構成的高度保守的核內(nèi)結構蛋白，具有穩(wěn)定核小體結構、修復及重組DNA、調(diào)控基因轉錄、調(diào)節(jié)細胞增殖和分化等多種生理功能[2-4]。1999年，Wang H[17]首次通過膿毒癥小鼠模型證實，胞外HMGB1是一種重要的炎癥介質(zhì)，且具有較強的致死性，這一發(fā)現(xiàn)使得學者們開始認識到HMGB1作為晚期炎癥因子的重要意義。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，胞外HMGB1與特異性受體RAGE和TLRs家族結合，可激活NF-κB信號通路，導致促炎因子如TNF-α、IL-1β等大量產(chǎn)生，而這些促炎因子又可激活單核/巨噬細胞主動分泌HMGB1[2-4]。可見，HMGB1的分泌是一個正反饋過程，其可作為促炎因子在細胞因子級聯(lián)放大效應中不斷觸發(fā)并維持下游炎癥反應，加速膿毒血癥的進程[18]。由此可見，HMGB1是重癥炎癥相關性疾病發(fā)病機制中的關鍵調(diào)控因子。

有研究表明，核內(nèi)HMGB1在炎癥反應過程中可能扮演著與胞內(nèi)HMGB1完全不同的角色，如髓源性HMGB1編碼基因敲除小鼠對LPS的敏感性增加，其肺內(nèi)巨噬細胞分泌的炎癥因子水平顯著高于野生型小鼠，肺組織損傷也更為嚴重[19]。類似的情況在胰腺HMGB1編碼基因敲除小鼠和肝臟HMGB1編碼基因敲除小鼠體內(nèi)得以證實[20-21]。上述研究結果提示，一方面，HMGB1遷移到細胞外，可作為致死性炎癥因子促發(fā)炎癥“瀑布效應”;另一方面，核內(nèi)HMGB1丟失，又可導致細胞對損傷因素的刺激反應更為劇烈，這可能是組織器官受損和功能障礙的重要原因。因此，抑制HMGB1的核移位顯得尤為重要?；谏鲜鲈?，本研究以HMGB1為對象，并將可反映炎癥嚴重程度的HMGB1/TLR4信號通路下游炎癥因子（TNF-α、IL-1β）作為考察指標。

本課題組前期研究表明，SFI對內(nèi)毒素休克模型大鼠肺組織有較好的保護作用，且能抑制大鼠肺組織中NF-κB、HMGB1的表達，推測SFI可能通過抑制免疫細胞HMGB1的表達、遷移和分泌來抑制NF-κB信號通路的活化和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，從而發(fā)揮對器官起到保護的作用[7-8]?；诖耍狙芯客ㄟ^建立細胞炎癥模型，以具有確切炎癥反應抑制作用的組蛋白去乙酰化酶抑制劑RGFP966[22]為陽性對照，對SFI治療內(nèi)毒素休克的機制進行進一步研究。結果顯示，在LPS的誘導下，RAW264.7細胞內(nèi)HMGB1 mRNA及蛋白的表達均顯著上調(diào)，且上調(diào)的HMGB1主要分布于胞漿，而核內(nèi)的HMGB1則顯著減少，提示核內(nèi)HMGB1大量向核外遷移，甚至大量分泌到細胞上清液中;與此同時，HMGB1的特異性受體TLR4的蛋白表達量亦顯著增加，提示胞外HMGB1可能與受體結合激活炎癥通路;隨著HMGB1分泌增加，細胞上清液中炎癥因子IL-1β、TNF-α也顯著上調(diào)，提示炎癥通路被激活，大量致炎因子產(chǎn)生。經(jīng)SFI作用后，各給藥組細胞中HMGB1 mRNA及其蛋白的表達量，陽性對照組和SFI中、高劑量組細胞中TLR4的蛋白表達量以及各給藥組細胞上清液中HMGB1、IL-1β、TNF-α水平均較LPS組顯著降低;同時，陽性對照組和LPS中、高劑量組細胞核中HMGB1蛋白表達量均顯著升高，各給藥組細胞胞漿中HMGB1蛋白表達量均顯著降低。由此可見，SFI不僅抑制了HMGB1的轉錄、翻譯、核轉位及分泌，同時還增加了細胞核內(nèi)HMGB1的蛋白表達，從源頭上降低了HMGB1出胞作為致死性炎癥因子及誘導后續(xù)炎癥反應的可能性，這可能是SFI發(fā)揮“扶陽固脫”功效的具體體現(xiàn)。此外，本研究還觀察到SFI抑制了HMGB1特異性受體TLR4蛋白的表達，并同時抑制了HMGB1/TLR4信號通路下游的炎癥因子的分泌，提示SFI可通過抑制HMGB1/TLR4信號通路的活化從而減少炎癥因子的產(chǎn)生。

綜上所述，SFI可通過抑制巨噬細胞中HMGB1核移位，從而減少HMGB1分泌出胞，避免炎癥通路的進一步激活和炎癥因子的產(chǎn)生，這可能是其治療危急重癥的關鍵機制。但SFI為什么可抑制HMGB1出核、這種作用是否跟抑制HMGB1的乙?；接嘘P等問題均有待后續(xù)深入研究。

參考文獻

[ 1 ] MARSHALL JC. Sepsis definitions：a work in progress[J]. Crit Care Clin，2018，34（1）：1-14.

[ 2 ] INGELS C，DERESE I，WOUTERS PJ，et al. Soluble RAGE and the RAGE ligands HMGB1 and S100A12 in critical illness：impact of glycemic control with insulin and relation with clinical outcome[J]. Shock，2015，43（2）：109-116.

[ 3 ] SU Z，WANG T，ZHU H，et al. HMGB1 modulates Lewis cell autophagy and promotes cell survival via RAGE- HMGB1-Erk1/2 positive feedback during nutrient depletion[J]. Immunobiology，2015，220（5）：539-544.

[ 4 ] LI Y，CHEN Q，JI W，et al. HMGB1 binding to the RAGE receptor contributes to the pathogenesis of asthma[J]. Pediat Allergy Immunol Pulm，2018，31（3）：174-179.

[ 5 ] 胡晶，符子藝，謝雁鳴，等.參附注射液治療感染性休克的系統(tǒng)評價[J].中國中藥雜志，2013，38（18）：3209-3214.

[ 6 ] 陳鵬，郭瑞敏，孫燕妮.參附注射液對感染性休克患者的血流動力學影響的研究進展[J].中國中醫(yī)急癥，2018，27（5）：911-914.

[ 7 ] 劉霞，艾飛，褚春薇，等.參附注射液抑制HMGB1核轉位保護內(nèi)毒素休克大鼠肺損傷[J].中藥藥理與臨床，2019，35（1）：2-6.

[ 8 ] 劉霞，艾飛，褚春薇，等.參附注射液對內(nèi)毒素休克模型大鼠肺組織炎癥的改善作用及抗炎機制研究[J].中國藥房，2019，30（11）：1492-1497.

[ 9 ] 曾振國，龔洪翰，李勇，等.參附注射液對脂多糖誘導的肺泡巨噬細胞微小RNA-146a表達的影響[J].中國危重病急救醫(yī)學，2012，24（3）：166-169.

[10] 明浩，邱珍，夏中元.組蛋白去乙?；?在HK-2細胞高糖缺氧復氧損傷中的作用及機制[J].武漢大學學報（醫(yī)學版），2020，41（2）：178-182.

[11] XU Q，LIU X，MEI LY，et al. Paeonol reduces the nucleocytoplasmic transportation of HMGB1 by upregulating HDAC3 in LPS-induced RAW264.7 cells[J]. Inflammation，2018，41（4）：1536-1545.

[12] HEJAZIZADEH M，MOTALLEB GR，YEGANEH MOG- HADAM A，et al. The study of CYP1A1 gene expression in patients with esophageal cancer by real time PCR[J]. J Shahrekord Univ Med Sci，2017，18（6）：35-43.

[13] WU W，JIANG RL，WANG LC，et al. Effect of Shenfu injection on intestinal mucosal barrier in a rat model of sepsis[J]. Am J Emerg Med，2015，33（9）：1237-1243.

[14] LIU X，LIU R，DAI Z，et al. Effect of Shenfu injection on lipopolysaccharide （LPS）-induced septic shock in rabbits[J]. J Ethnopharmacol，2019. DOI：10.1016/j.jep.2019. 01.008.

[15] 廖文生，李衛(wèi)青，陳世偉，等.參附注射液對慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者炎癥細胞因子和肺功能的影響[J].中國中西醫(yī)結合急救雜志，2008，15（3）：149-151.

[16] 羅福全，李大珍，葉茂，等.參附注射液預先給藥對內(nèi)毒素血癥大鼠腸黏膜上皮的影響[J].重慶醫(yī)科大學學報，2013，38（7）：746-750.

[17] WANG H. HMG-1 as a late mediator of endotoxin lethality in mice[J]. Science，1999，285（5425）：248-251.

[18] HUEBENER P，PRADERE JP，HERNANDEZ C，et al. The HMGB1/RAGE axis triggers neutrophil-mediated injury amplification following necrosis[J]. J Clin Invest，2015，125（2）：539-550.

[19] YANAI H，MATSUDA A，AN J，et al. Conditional ablation of HMGB1 in mice reveals its protective function against endotoxemia and bacterial infection[J]. Proc Natl Acad Sci U S A，2013，110（51）：20699-20704.

[20] KANG R，ZHANG Q，HOU W，et al. Intracellular HMGB1 inhibits inflammatory nucleosome release and limits acute pancreatitis in mice[J]. Gastroenterology，2014，146（4）：1097-1107.

[21] HUANG H，NACE GW，MCDONALD KA，et al. Hepatocyte-specific high-mobility group box 1 deletion worsens the injury in liver ischemia/reperfusion：a role for intracellular high-mobility group box 1 in cellular protection[J]. Hepatology，2014，59（5）：1984-1997.

[22] LEUS NG，VAN DER WOUDEN PE，VAN DEN BOSCH T，et al. HDAC 3-selective inhibitor RGFP966 demonstrates anti-inflammatory properties in RAW 264.7 macrophages and mouse precision-cut lung slices by attenuating NF-κB p65 transcriptional activity[J]. Biochem Pharmacol，2016. DOI：10.1016/j.bcp.2016.03.010.

（收稿日期：2020-04-03 修回日期：2020-08-05）

（編輯：張元媛）