耐酸耐膽鹽益生菌的篩選及其益生特性研究

劉之園，賈俊霞，姜昊蔚，李志蕓，郭 靜，劉志坤，高秀珍

（1.山東理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 淄博 255000；2.山東飛龍食品有限公司，山東 淄博 256102）

益生菌是一類能夠促進(jìn)腸內(nèi)菌群生態(tài)平衡，對(duì)宿主有益的活性微生物[1]。自它被提出以來，益生菌就被廣泛地應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域[2]。目前研究表明，益生菌具有調(diào)節(jié)腸道菌群、改善乳糖不耐癥、提高人體免疫力[3]、降低膽固醇[4]、抗癌[5-6]、抗氧化[7]等眾多益生功能。然而，適應(yīng)胃腸道的低pH環(huán)境、高滲透壓的膽鹽環(huán)境是益生菌成功定植并發(fā)揮益生功能的前提[8]。因此，篩選高耐酸、耐膽鹽的優(yōu)良益生菌株具有重要的研究意義和應(yīng)用價(jià)值。

近年來，國(guó)內(nèi)外對(duì)優(yōu)良益生菌菌株的篩選及益生菌益生特性的研究比較活躍。張振宇等[3]從11株乳酸菌中篩選出1株在pH3.0的人工胃液中存活率為119.53%且在0.3%的膽鹽中生長(zhǎng)率為41.64%的耐酸、耐膽鹽的優(yōu)良菌株；姚杰玢等[7]從8株乳酸菌中篩選出2株自由基清除能力較強(qiáng)的菌株R36和R39，它們對(duì)1,1-二苯基-2-三硝基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、羥自由基（·OH）和超氧陰離子（O2-·）3種自由基的清除能力分別為51.09%、67.86%、72.02%和50.26%、67.67%、72.16%；賀珊珊等[8]從5株益生菌中篩選出1株膽固醇去除率為20.03%、能夠長(zhǎng)時(shí)間耐受pH為2.5的高酸性環(huán)境、膽鹽濃度為0.5%的高膽鹽環(huán)境的菌株。但是，目前所篩選到的菌株的優(yōu)良特性往往僅表現(xiàn)在抗性或者益生特性方面，同時(shí)具有抗性和多種優(yōu)良益生特性的菌株還很少[9-10]。

本研究以13份農(nóng)用益生菌劑、土法發(fā)酵制備的酵素液及表層菌膜樣品為原料，通過初篩及耐酸、耐膽鹽能力的復(fù)篩獲得了4株性能優(yōu)良的益生菌株，并對(duì)它們進(jìn)行了進(jìn)一步的產(chǎn)酶、自由基清除、產(chǎn)酸等益生特性的研究，旨在為后續(xù)益生菌益生功能的研究及應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)及優(yōu)質(zhì)的菌種支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

農(nóng)用益生菌劑（市售有機(jī)農(nóng)業(yè)安全衛(wèi)士）：北京餐廚寶生物科技有限公司；酵素液：以生姜、枸杞、大棗、羅漢果、菊花、楊梅、櫻桃、香蕉、柚子、甜瓜等水果的不同組合為材料，采用土法發(fā)酵一年以上的酵素液及表層菌膜，樣品均采集自當(dāng)?shù)孛耖g；氫氧化鈉、濃鹽酸（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DPPH、牛膽鹽、豬膽鹽（均為分析純）：北京索萊寶科技有限公司；細(xì)菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒（離心柱型）：北京百泰克生物技術(shù)有限公司。

乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基（MRS液體培養(yǎng)基）：牛肉膏10.0 g，胰蛋白胨10.0 g，酵母浸粉5.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，檸檬酸鈉5.0 g，無水乙酸鈉5.0 g，七水硫酸鎂0.05 g，無水硫酸錳0.05 g，吐溫80 1.0 mL，葡萄糖20.0 g，蒸餾水1 000 mL。MRS固體培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基中加入15.0 g瓊脂。葡萄糖單獨(dú)滅菌，115 ℃滅菌30 min，其余培養(yǎng)基121 ℃滅菌20 min，滅菌完成后混勻使用。

淀粉培養(yǎng)基：酵母浸粉5.0 g，可溶性淀粉2.0 g，胰蛋白胨10.0 g，氯化鈉5.0 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1 000 mL。121 ℃滅菌20 min。

干酪素培養(yǎng)基：氯化鈉5.0 g，干酪素10.0 g，瓊脂15.0 g，加蒸餾水至1 000 mL，干酪素用0.1 mol/L稀堿溶液溶解后單獨(dú)滅菌，其他組分一起滅菌，滅菌完成后混勻使用，均為121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

LE303E型精密電子天平：深圳市恒科達(dá)檢測(cè)儀器有限公司；SX-500型全自動(dòng)高壓滅菌器：日本Tomy Digital Biology公司；MN-KJ型電熱恒溫水浴鍋：海南海森林公波儀器公司；PRG-84465型恒溫培養(yǎng)箱：浙江森林控股有限公司；MNVB-78K型恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱：上海智城儀器有限公司；DM750型生物顯微鏡：德國(guó)徠卡LEICA公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的初篩與形態(tài)學(xué)鑒定

將農(nóng)用益生菌劑、土法發(fā)酵制備的酵素液及表層菌膜等共13份樣品進(jìn)行梯度稀釋，梯度稀釋至10-7，選取適宜的濃度分別涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫過夜培養(yǎng)。根據(jù)菌落的形態(tài)差異挑取不同的單菌落于新的MRS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行恒溫過夜培養(yǎng)。對(duì)分離純化獲得的單菌株保藏，并進(jìn)行革蘭氏染色與鏡檢。

1.3.2 菌株的分子生物學(xué)鑒定

利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株的基因組DNA，并以其為模板進(jìn)行16S rDNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增。采用細(xì)菌通用引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3'和1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性10 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物送至測(cè)序公司進(jìn)行基因測(cè)序，利用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）數(shù)據(jù)庫對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)，從而確定菌株的種屬。

1.3.3 菌株的耐酸能力

取100 μL活化后的菌液接種至5 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)，直至OD600nm值=1.0，8000 r/min離心10 min棄上清，收集菌體。將菌體懸浮于等體積、pH分別為1.0、1.5、2.0、3.0、4.0的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)，于0 h和4 h分別取樣，用美藍(lán)染色法染色后使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，以培養(yǎng)0 h的活菌數(shù)為對(duì)照，計(jì)算存活率公式如下：

式中：A1為在不同pH的MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)0 h的活菌數(shù)，CFU/mL；A2為在不同pH的MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.3.4 菌株的耐膽鹽能力

取100 μL活化后的菌液接種至5 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)，直至OD600nm值=1.0，8 000 r/min離心10 min棄上清，收集菌體。將菌體懸浮于等體積、膽鹽濃度為0.3%、0.5%、1.0%、1.5%的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)，于0 h和4 h分別取樣，用美藍(lán)染色法染色后使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，以培養(yǎng)0 h的活菌數(shù)為對(duì)照，計(jì)算存活率公式如下：

式中：A1為在不同膽鹽濃度的MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)0 h的活菌數(shù)，CFU/mL；A2為在不同膽鹽濃度的MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.3.5 菌株的產(chǎn)酶能力

取100μL活化后的菌液接種至5mLMRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)，直至OD600nm值=1.0，8 000 r/min離心10 min收集上清。將牛津杯分別放置在淀粉培養(yǎng)基和干酪素培養(yǎng)基平板上，吸取上清液0.2mL加入牛津杯中，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察牛津杯周圍是否有明顯的酶解圈出現(xiàn)，并測(cè)量酶解圈直徑。

1.3.6 菌株的DPPH自由基清除能力

取100 μL活化后的菌液接種至5 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)，直至OD600nm值=1.0。DPPH自由基清除率的測(cè)定方法在文獻(xiàn)已報(bào)道的方法[11]上做了修改，取1 mL菌液，加入2 mL 0.5 mmol/L的DPPH乙醇溶液，混勻后避光反應(yīng)30 min，8 000 r/min離心10 min，取上清，于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度值?？瞻捉M以等體積無水乙醇代替DPPH乙醇溶液，對(duì)照組以等體積無水乙醇代替菌液。

式中：AS為樣品組的吸光度值；A為空白組的吸光度值；A0為對(duì)照組的吸光度值。

1.3.7 菌株的產(chǎn)酸能力

取100 μL活化后的菌液接種至5 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h、48 h后分別取樣，8 000 r/min離心10 min收集上清。加入酚酞作為指示劑，用0.1 mol/L NaOH滴定直至出現(xiàn)淺紅色，且30 s內(nèi)不褪色，分別記錄NaOH的消耗體積，并計(jì)算產(chǎn)酸量（以乳酸計(jì)）。計(jì)算公式如下：

式中：C1為NaOH溶液濃度，mol/L；C2為產(chǎn)酸量，g/L；K為酸換算系數(shù)，用乳酸表示，K=0.090；F為測(cè)試樣品稀釋倍數(shù)；V1為NaOH滴定48 h發(fā)酵液消耗的體積，mL；V2為NaOH滴定24 h發(fā)酵液消耗的體積，mL；V3為待測(cè)發(fā)酵液的體積[12]，mL。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，采用SPSS 16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并用GraphPad Prism 5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的初篩與鑒定

從MRS培養(yǎng)基上挑取形態(tài)不同的單菌落于新的固體培養(yǎng)基上，共分離得到形態(tài)不同的9株菌株。革蘭氏染色結(jié)果顯示，9株菌株均為革蘭氏陽性菌，其形態(tài)特征及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果見表1。由表1可知，在9株菌中，菌株B4、B6、B7菌落較小，其余菌落較大；菌株B4、B5、B7、B8表面有突起，其余均無突起；從菌落顏色看，菌株B1、B2、B3、B4為白色，菌株B5、B9為乳白色，菌株B6、B7、B8為淡黃色。將9株菌株的16S rDNA序列提交至NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對(duì)，初步判定菌株B1、B2、B3為魯梅利桿菌屬蘇旺氏桿菌（Rummeliibacillus suwonensis）、菌株B4和B7為干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、菌株B5為芽孢桿菌屬（Bacillus）、菌株B6為副干酪乳桿菌（L.paracasei）、菌株B8為巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）、菌株B9為植物乳桿菌（L.plantarum）。

表1 9株菌株菌落形態(tài)特征及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果Table 1 Colony morphological characteristics and molecular biological identification results of 9 strains

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，魯梅利桿菌屬（Rummeliibacillus）是2009年定義的菌屬，目前關(guān)于該菌屬菌株的研究還很少[13]。已報(bào)道的研究表明，Rummeliibacillus stabekisii可作為飼料添加劑提高羅非魚的生長(zhǎng)和健康狀況[14]；干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）被廣泛應(yīng)用于酸奶、芝士、乳制品的生產(chǎn)中[15]，且具有調(diào)節(jié)腸道菌群數(shù)量[16]、預(yù)防腫瘤[17]等益生功能；芽孢桿菌屬（Bacillus）的菌株在新型微生態(tài)制劑產(chǎn)品的研發(fā)[18]和凈化養(yǎng)殖水體[19]中起到重要作用；副干酪乳桿菌（L.paracasei）廣泛應(yīng)用于奶酪、泡菜等發(fā)酵食品的生產(chǎn)中，能增加干酪產(chǎn)品中游離氨基酸的數(shù)量，提高產(chǎn)品質(zhì)量[20]，還具有抑菌[21-22]、抗腫瘤[23-24]等功能；巴氏醋桿菌（A.pasteurianus）被廣泛應(yīng)用于醋酸發(fā)酵[25]，是多國(guó)食醋釀造的主要菌株之一[26]；植物乳桿菌（L.plantarum）被大量應(yīng)用于發(fā)酵產(chǎn)品中，并具有降低膽固醇[27]、降血糖[28]、抗菌消炎[29]、提高人體免疫力[30]等益生功能。鑒于以上菌株潛在的生理功能和應(yīng)用潛能，后續(xù)對(duì)它們開展了一系列性質(zhì)研究。

2.2 菌株的耐酸能力分析

益生菌必須進(jìn)入人體的胃腸道才能發(fā)揮其益生功能，在從口腔到人體腸道的過程中益生菌需要耐受胃部的低pH環(huán)境[31]，所以，對(duì)酸的耐受是衡量?jī)?yōu)良益生菌的重要指標(biāo)。根據(jù)食物在胃中的停留時(shí)間[32]，把菌株在不同pH下的MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h，隨后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)以計(jì)算其存活率。9株益生菌在pH為2、3、4條件下的存活率結(jié)果見圖1。

圖1 9株菌株在pH 2、3、4條件下的活菌存活率Fig.1 Survival rates of nine strains under pH 2,3 and 4

由圖1可知，除菌株B1、B2以外，其余菌株的存活率均隨著pH的降低而降低。但是，在pH為2、3、4的酸度下孵育4 h后，菌株B1、B2、B3、B4、B6、B7、B9的存活率仍均＞60%，其中菌株B1、B2、B4、B6、B9在pH=2時(shí)的存活率＞70%，耐酸能力較強(qiáng)。其中，菌株B1尤為突出，在pH=2時(shí)的存活率為100%。綜合看來，菌株B1、B2、B4、B9的耐酸性能較好。為進(jìn)一步探究耐酸能力較好的菌株B1、B2、B4、B9的耐酸性能，將pH降低到1.0和1.5，再次進(jìn)行了耐酸實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，菌株B2和B4在pH=1.0、pH=1.5的酸度下孵育4 h后，仍然表現(xiàn)出了50%以上的存活率。而菌株B1、B9則表現(xiàn)出了更好的耐酸性能，在pH=1.0、pH=1.5的酸度下孵育4 h后，菌株B1的存活率分別為（93.69±2.25）%和（95.57±3.07）%、菌株B9的存活率分別為（87.83±2.00）%和（88.28±0.83）%。目前已報(bào)道了大量關(guān)于菌株耐酸能力的研究，但這些研究所選取的酸脅迫條件主要集中在pH=2.0及以上，對(duì)于菌株在pH=2.0以下的耐酸能力的研究還很少。在已有的報(bào)道中，耐酸能力較強(qiáng)的益生菌為韓墨等[30]從內(nèi)蒙古傳統(tǒng)酸奶中分離出的鼠李糖乳桿菌217-3，該菌在pH=1.5的酸度下孵育4 h后的存活率為72%，仍低于本研究中菌株B1、B9在相同實(shí)驗(yàn)條件下的存活率。因此，綜合來說，菌株B1、B9具有更高的耐酸能力，可以作為具有潛在益生特性的耐酸菌株豐富菌株庫。

圖2 菌株B1、B2、B4及B9在pH 1.0、1.5條件下的活菌存活率Fig.2 Survival rates of strain B1,B2,B4 and B9 under conditions of pH 1.0 and 1.5

2.3 菌株的耐膽鹽能力分析

膽鹽具有抑菌功能，適應(yīng)人體小腸中的膽鹽脅迫是益生菌發(fā)揮益生功能的重要前提[31]，所以，對(duì)膽鹽的耐受也是衡量?jī)?yōu)良益生菌的重要指標(biāo)。根據(jù)食物在胃中的停留時(shí)間[32]，把菌株在不同膽鹽濃度的MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)4h，隨后，通過計(jì)算菌株的存活率表征它們的耐膽鹽能力。9株益生菌在膽鹽濃度0.3%和0.5%下的耐膽鹽能力測(cè)試結(jié)果見圖3。

圖3 9株菌株在膽鹽濃度為0.3%、0.5%條件下的活菌存活率Fig.3 Survival rates of nine strains with bile salt concentration of 0.3%and 0.5%

由圖3可知，與膽鹽濃度0.3%相比，在0.5%的膽鹽濃度下菌株的存活率有所下降。在膽鹽濃度為0.5%的條件下孵育4 h后，菌株B2、B6、B8的活菌存活率仍＞65%，分別為（67.59±8.82）%、（68.33±16.07）%、（88.56±0.33）%，表明菌株B2、B6、B8的膽鹽耐受能力相對(duì)較好。

為進(jìn)一步探究耐膽鹽能力較好的菌株B2、B6、B8的耐膽鹽性能，將膽鹽濃度增加至1.0%、1.5%，再次進(jìn)行了耐膽鹽實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖4。由圖4可知，菌株B2 在膽鹽濃度為1.0%和1.5%的條件下孵育4 h后，仍表現(xiàn)出50%以上的存活率，而菌株B6、B8仍具有65%以上的存活率。其中，在膽鹽濃度為1.0%、1.5%的條件下孵育4 h后，菌株B6和B8的存活率分別為（67.22±7.51）%、（72.22±4.81）%和（82.91±1.91）%、（81.74±1.52）%。因此，菌株B8表現(xiàn)出最強(qiáng)的膽鹽耐受能力。

圖4 菌株B2、B6及B8在膽鹽濃度為1.0%、1.5%條件下的活菌存活率Fig.4 Survival rates of the strain B2,B6 and B8 with bile salt concentration of 1.0% and 1.5%

綜合以上結(jié)果，菌株B1、B2、B4和B9的耐酸能力為菌株B1＞B9＞B4＞B2，菌株B2、B6和B8的耐膽鹽能力為B8＞B6＞B2。考慮到菌株B2呈現(xiàn)出相對(duì)較好的耐酸及耐膽鹽能力，而菌株B8的耐酸能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他菌株（圖1），因此，選取菌株B1、B2、B6、B9這4株菌株作為后續(xù)益生特性研究的出發(fā)菌株。

2.4 益生特性研究

2.4.1 產(chǎn)酶能力分析

產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶的益生菌，以一定的活性進(jìn)入到腸道，無疑可以起到幫助動(dòng)物消化的作用，因此，以篩選出來的耐酸耐膽鹽能力較好的4株菌株作為出發(fā)菌株，測(cè)定了其產(chǎn)酶能力，結(jié)果見表2。由表2可知，4株菌株均具有產(chǎn)淀粉酶的能力，但是均不能產(chǎn)生蛋白酶。4株菌株的產(chǎn)淀粉酶能力為菌株B6＞B2＞B9＞B1。

表2 4株菌分別在淀粉及干酪素培養(yǎng)基上產(chǎn)生酶解圈直徑大小比較Table 2 Comparison of diameters of enzymatic hydrolysis bands of four strains produced on starch and casein medium

2.4.2 DPPH自由基清除能力分析

DPPH自由基是一種很穩(wěn)定的自由基，測(cè)定益生菌對(duì)DPPH自由基的清除率，可以反映益生菌的抗氧化能力[9]。以篩選出來的4株菌株作為出發(fā)菌株，測(cè)定其DPPH自由基的清除率，結(jié)果見圖5。由圖5可知，4株菌株均具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力，除菌株B2外，菌株B1、B6、B9的DPPH自由基清除率均＞80%。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，現(xiàn)有的乳酸菌DPPH自由基清除率最大值在50%左右[9-11]，姚杰玢等[7]對(duì)8株乳酸菌進(jìn)行DPPH自由基清除特性研究，發(fā)現(xiàn)乳酸菌R36的DPPH自由基清除率達(dá)（51.09±0.11）%；黃玉軍等[9]對(duì)分離自江蘇如皋長(zhǎng)壽村人群腸道的6株乳酸菌進(jìn)行DPPH自由基清除特性研究，發(fā)現(xiàn)乳酸菌E2的DPPH自由基清除率達(dá)（58.63±0.01）%，均低于本研究中菌株B1、B6、B9的清除率。所以菌株B1、B6、B9在DPPH自由基清除能力方面具有很高的應(yīng)用與研究?jī)r(jià)值。

圖5 4株菌株對(duì)DPPH自由基清除率的比較Fig.5 Comparison of scavenging rates of DPPH free radicals by four strains

2.4.3 產(chǎn)酸能力分析

產(chǎn)酸能力是菌株活力的重要體現(xiàn)[31]，以篩選出來的4株菌株作為出發(fā)菌株，測(cè)定其24 h內(nèi)的總酸（以乳酸計(jì)）產(chǎn)量，結(jié)果見表3。由表3可知，在4株菌株中，菌株B1、B6、B9在發(fā)酵過程中均可產(chǎn)酸，且24 h內(nèi)菌株B6的產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，達(dá)13 143.2 mg/L，菌株B2不產(chǎn)酸。其中植物乳桿菌B9的總酸（以乳酸計(jì)）產(chǎn)量高于宮路路等[32]篩選出的乳酸產(chǎn)量為4 752.51 mg/L的植物乳桿菌。

表3 4株菌株的產(chǎn)酸量Table 3 Acid production of four strains

綜合4株菌株的產(chǎn)酶、DPPH自由基清除率及產(chǎn)酸能力，認(rèn)為副干酪乳桿菌B6在這3個(gè)方面均優(yōu)于其他3株菌株，所以副干酪乳桿菌B6是該研究范圍內(nèi)在益生特性研究方面確定的最佳益生菌株。

3 結(jié)論

本研究從13 份農(nóng)用益生菌劑、土法發(fā)酵制備的酵素液及表層菌膜樣品中分離篩選出9株益生菌，并對(duì)其耐酸、耐膽鹽能力進(jìn)行了比較分析。菌株B1對(duì)酸性環(huán)境的耐受能力最強(qiáng)，在pH為1.0、1.5條件下孵育4 h后的存活率分別為（93.69±2.25）%、（95.57±3.07）%，是目前報(bào)道的最高水平；菌株B8對(duì)膽鹽環(huán)境的耐受能力最強(qiáng)，在膽鹽濃度為1.0%、1.5%的條件下孵育4 h后的存活率分別為（82.91±1.91）%、（81.74±1.52）%。通過耐酸、耐膽鹽能力的綜合分析篩選出了菌株B1、B2、B6、B9四株優(yōu)良菌株進(jìn)行進(jìn)一步的益生特性研究，主要包括：產(chǎn)酶能力、DPPH自由基清除能力及產(chǎn)酸能力。結(jié)果顯示，副干酪乳桿菌B6在產(chǎn)酶、DPPH自由基清除及產(chǎn)酸三個(gè)方面均優(yōu)于其他三株菌株，是確定的最佳益生菌株。副干酪乳桿菌B6具有較好的耐酸耐膽鹽能力和優(yōu)良的益生特性，有良好的應(yīng)用和研究?jī)r(jià)值，可作為優(yōu)良菌株進(jìn)行下一步的研究與開發(fā)。