不同提取方法及因素對亞麻蛋白功能性質的影響

吳興雨，姚 玥，孫豐梅，2

（1.河北北方學院 食品科學系，河北 張家口 075000；2.河北省農產品食品質量安全分析檢測重點實驗室，河北 張家口 075000）

亞麻（Linum usitatissimumL.）是一種油料作物，在食品和飼料工業(yè)中扮演著重要作用[1-2]。亞麻在世界的栽培歷史可追溯到5 000年前，中國亦有600多年[3]。在河北省北部、西北各省、黑龍江和云南等地大量種植，年產量約50萬t[4]。亞麻籽經過溶劑浸提法或機械壓榨法制油后的產物稱為亞麻籽餅粕，亞麻籽餅粕中蛋白質含量在32%～49%之間[5]。

目前蛋白質的提取方法主要有堿溶酸沉法和酶法[6]。堿溶酸沉法工藝操作簡單，但是高濃度堿液會加深產品色澤，破壞產品風味，可能導致蛋白質營養(yǎng)價值損失，還會使賴氨酸和丙氨酸生產有毒化合物，降低賴氨酸的營養(yǎng)價值[7-9]。酶法反應條件較溫和，能夠更多保留蛋白質營養(yǎng)價值，而且能夠降低堿溶酸沉法提取蛋白質產生的不利影響[10]。于雷等[11]對堿溶酸沉法和超聲輔助雙酶法提取的米糠蛋白的功能性質進行研究，考察pH值對米糠蛋白溶解度、起泡性、起泡穩(wěn)定性、乳化性、乳化穩(wěn)定性等功能性質的影響，以及溫度對黏度的影響，結果表明，超聲輔助雙酶法提取的米糠蛋白的功能性質較堿法有所改善；張薇[12]將雙酶復合法和堿法提取的米糠蛋白功能性質進行比較，結果也表現(xiàn)為雙酶復合法提取的米糠蛋白的功能性質較堿溶酸沉法有所改善。因此，酶法提取的米糠蛋白質的功能性質較好。但是在亞麻蛋白方面，僅有單種提取方法研究功能性質的報道[13-14]。

本試驗對堿溶酸沉法和雙酶復合酶解法提取的亞麻蛋白的功能性質進行比較，同時，為了滿足亞麻蛋白在各類食品中的應用，考察pH值、溫度、亞麻蛋白含量及NaCl濃度四個因素對亞麻蛋白起泡性和起泡穩(wěn)定性、乳化性及乳化穩(wěn)定性、黏度的影響，為亞麻蛋白產品的研發(fā)及亞麻蛋白的貯藏提供理論研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

亞麻籽餅粕：康保光明糧油有限公司；堿性蛋白酶（50 U/mg）、α-淀粉酶（酶活性3 700 U/g）：北京奧博星生物技術有限公司；大豆油（食品級）：九三糧油工業(yè)集團有限公司；正己烷、氫氧化鈉（均為分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；鹽酸（分析純）：北京化工廠。

1.2 儀器與設備

HC-3018高速離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；HH-S數顯恒溫水浴鍋：金壇市醫(yī)療儀器廠；PHS-3C酸度計：上海佑科儀表有限公司；79-1磁力加熱攪拌器、HY-4A調速振蕩器：常州澳華儀器有限公司；JYL-C50T九陽料理機：九陽股份有限公司；NDJ-5S旋轉黏度計：上海力辰儀器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 脫膠、脫脂亞麻籽餅粕的制備

亞麻籽餅粕粉碎過篩（80目），稱取20 g亞麻籽餅粕粉加入400 mL水、在75 ℃的水浴鍋中水浴90 min，并不斷攪拌，洗膠3次，進行脫膠[15]。稱脫膠后的亞麻籽餅粕的質量，加入30倍的正己烷，置于通風櫥，不斷振蕩6 h后，靜置，回收正己烷，于通風櫥晾12 h即為脫膠、脫脂亞麻籽餅粕。

1.3.2 雙酶復合酶解法提取亞麻蛋白

經過前期試驗得到亞麻蛋白的最佳提取工藝，根據最佳工藝條件制備亞麻蛋白。取脫膠、脫脂亞麻籽餅粕，按料液比1∶15加入蒸餾水，添加2.5%的α-淀粉酶，在pH 6.0、60 ℃條件下酶解4 h，再添加1%的堿性蛋白酶，在pH 10.1、47.5 ℃條件下酶解3 h，100 ℃條件下滅酶，4 000 r/min離心15 min，取上清液殼聚糖沉淀蛋白質，4000 r/min離心15 min，蛋白質沉淀物冷凍干燥。

1.3.3 堿溶酸沉制備亞麻蛋白

脫膠、脫脂亞麻籽餅粕，按料水比1∶15加入蒸餾水，在pH 9.5、60 ℃條件下提取1.5 h，4 000 r/min離心10 min，取上清液調節(jié)pH值至4.4，靜置1.5 h，4 000 r/min離心15 min，水洗蛋白質沉淀，冷凍干燥即可[14，16]。

1.3.4 亞麻蛋白等電點的確定

取等體積的9份雙酶復合酶解法制備的亞麻蛋白上清液，調pH值范圍為3.6～5.2，靜置30 min后4 000 r/min離心20 min，吸取0.5 mL上清液，測定其蛋白質含量，吸光度值越小，上清液中的蛋白質含量越少，即沉淀中的蛋白質就越多，吸光度值最小值對應的pH值為亞麻蛋白的等電點[16]。

1.3.5 不同條件對亞麻蛋白功能性質的影響

分別測定不同pH值（2、3、4、5、6、7、8、9、10、11）、溫度（20 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃）、亞麻蛋白含量（1%、1.6%、2.2%、2.8%、3.4%）、NaCl濃度（0.25 mol/L、0.5 mol/L、1.0 mol/L、1.5 mol/L、2.0 mol/L）對亞麻蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性、起泡性和起泡穩(wěn)定性的影響。

分別測定不同pH值（2、4、6、8、10、12）、溫度（20 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃）、亞麻蛋白含量（1%、1.6%、2.2%、2.8%、3.4%）、NaCl濃度（0.25 mol/L、0.5 mol/L、1.0 mol/L、1.5 mol/L、2.0 mol/L）對亞麻蛋白黏度的影響。

1.3.6 測定方法

乳化性：取25 mL 1%的亞麻蛋白溶液與等量大豆油混合，以2 000 r/min的速度均質10 min。將乳濁液以4 000 r/min離心10 min，轉入100 mL量筒，記錄總體積和乳化層體積，計算乳化活性，其計算公式如下[14]：

乳化穩(wěn)定性：取25 mL 1%的亞麻蛋白溶液與等量大豆油混合，以2 000 r/min的速度均質10 min。在85 ℃水浴中加熱15 min破乳，然后冷卻至室溫，2 000 r/min離心5 min后，轉移至量筒內，讀取乳化層高度，計算乳化穩(wěn)定性，其計算公式如下[14]：

起泡性：配制1%的亞麻蛋白溶液，以7 000 r/min的速度均質4 min，迅速轉入量筒，記錄泡沫總體積，計算起泡性，其計算公式如下[14]：

起泡穩(wěn)定性：將均質形成的泡沫靜置10 min、30 min、60 min、90 min、120 min后，分別讀取剩余泡沫的體積，以10 min時的起泡穩(wěn)定性為例，計算起泡穩(wěn)定性，其計算公式如下[14]：

黏度：配制1%的亞麻蛋白溶液，立即采用NDJ-5S旋轉式黏度計，調整轉速為60 r/min，選擇2號轉子，測定亞麻蛋白的黏度[14]。

1.3.8 數據處理

采用SPSS 20.0軟件進行數據分析，分別對雙酶復合酶解法和堿溶酸沉法提取亞麻蛋白在不同條件下的結果進行顯著分析，再對同一條件下，雙酶復合法提取亞麻蛋白和堿溶酸沉法提取的亞麻蛋白的結果進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 亞麻蛋白等電點的測定

亞麻蛋白等電點的測定結果見圖1。

圖1 亞麻蛋白等電點的測定結果Fig.1 Determination results of isoelectric point of flax protein

由圖1可知，吸光度值隨著pH值的增大，呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，當pH=4.4時，吸光度值最低，亞麻蛋白沉淀量最大，所以亞麻蛋白的等電點為4.4。施樹[14]采用堿溶酸沉法制備亞麻蛋白，測定其等電點為4.4，與本研究測定的雙酶復合酶解法制備亞麻蛋白的結果相一致。

2.2 不同影響因素對亞麻蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響

2.2.1 pH值對亞麻蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響

圖2 pH值對亞麻蛋白乳化性（a）及乳化穩(wěn)定性（b）的影響Fig.2 Effect of pH on emulsifying property (a) and emulsifying stability(b) of flax protein

由圖2可知，隨著pH值的增加，兩種方法提取的亞麻蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。于雷等[11]在測定pH值對米糠蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性時，表現(xiàn)出相同的趨勢。在等電點附近兩種方法制備的亞麻蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性最差，分析原因可能是在等電點附近，蛋白質所帶電荷為零，且等電點附近蛋白質的溶解度也是最低的，吸附在油-水界面的蛋白質較少，所以乳化能力表現(xiàn)較差[14]。在同一pH值條件下，雙酶復合酶解法提取的亞麻蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性均顯著優(yōu)于堿溶酸沉法（P＜0.05）。

2.2.2 溫度對亞麻蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響

圖3 溫度對亞麻蛋白乳化性（a）及乳化穩(wěn)定性（b）的影響Fig.3 Effect of temperature on emulsifying (a) and emulsifying stability(b) of flax protein

由圖3可知，兩種提取方法制備的亞麻蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性隨著溫度升高均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。雙酶復合酶解法提取的亞麻蛋白的乳化性優(yōu)于堿溶酸沉法，而乳化穩(wěn)定性僅在40 ℃時表現(xiàn)為雙酶復合酶解法提取的亞麻蛋白顯著優(yōu)于堿溶酸沉法（P＜0.05）。在40 ℃時，雙酶復合酶解法提取的亞麻蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性均優(yōu)于堿溶酸沉法（P＜0.05）。

2.2.3 亞麻蛋白含量對亞麻蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響

由圖4可知，兩種方法提取的亞麻蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性均隨著亞麻蛋白含量的增加，呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。在蛋白質吸附油-水界面，蛋白質的推動力增大，能夠吸附更多的蛋白質，所以形成乳狀液油滴粒徑減小，反而數目增多，油-水界面的面積增大，吸附更多的油，因而乳化性增大[17]。在同一亞麻蛋白含量下，雙酶復合酶解法提取的亞麻蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性均優(yōu)于堿溶酸沉法，且當亞麻蛋白含量為2.8%時，差異均顯著（P＜0.05）。

圖4 亞麻蛋白含量對亞麻蛋白乳化性（a）及乳化穩(wěn)定性（b）的影響Fig.4 Effect of flax protein content on emulsifying (a) and emulsifying stability (b) of flax protein

2.2.4 NaCl濃度對亞麻蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響

圖5 NaCl濃度對亞麻蛋白乳化性（a）及乳化穩(wěn)定性（b）的影響Fig.5 Effect of NaCl concentration on emulsifying (a) and emulsifying stability (b) of flax protein

由圖5可知，亞麻蛋白的乳化性及乳化穩(wěn)定性均隨著NaCl濃度的增大，呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。最適NaCl濃度為1.5 mol/L，低濃度的NaCl溶液能夠加速蛋白質溶解，提高油-水體系中蛋白質的質量，增加油-水界面的面積，過高濃度的NaCl溶液會使蛋白質乳化液膠體的水化層變薄，降低蛋白質與水的作用，蛋白質與蛋白質分子間的疏水作用加強，吸附油-水界面的能力減弱，油滴的粒徑變大，導致界面面積減小，乳化性則出現(xiàn)下降的趨勢[18]。在同一NaCl濃度下，雙酶復合酶解法提取的亞麻蛋白的乳化性及乳化穩(wěn)定均優(yōu)于堿溶酸沉法，且當NaCl濃度為0.5 mol/L，差異均顯著（P＜0.05）。

2.3 不同影響因素對亞麻蛋白起泡性及起泡穩(wěn)定性的影響

2.3.1 pH值對亞麻蛋白起泡性及起泡穩(wěn)定性的影響

pH值對亞麻蛋白起泡性及起泡穩(wěn)定性的影響見圖6。由圖6可知。在等電點附近，兩種方法制備的亞麻蛋白的起泡性和起泡穩(wěn)定性較差?？赡茉蚴堑入婞c附近蛋白質的溶解度最低，形成泡沫的蛋白質減少，僅少量蛋白質被溶解參與泡沫的形成，所以亞麻蛋白的起泡性較差。并且等電點附近，蛋白質分子間的相互作用，蛋白質膜在氣液界面上變厚變硬，所以起泡穩(wěn)定性變差[19]。在同一pH值下，雙酶復合酶解法提取的亞麻蛋白的起泡性和起泡穩(wěn)定性均顯著優(yōu)于堿溶酸沉法（P＜0.05）。

圖6 pH值對亞麻蛋白起泡性（a）及起泡穩(wěn)定性（b）的影響Fig.6 Effect of pH on foaming property (a) and foaming stability (b) of flax protein

2.3.2 溫度對亞麻蛋白起泡性及起泡穩(wěn)定性的影響

溫度對亞麻蛋白起泡性及起泡穩(wěn)定性的影響見圖7。由圖7可知，隨著溫度的升高，兩種方法提取的亞麻蛋白的起泡性和起泡穩(wěn)定性均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，最適溫度均為60 ℃。僅在40 ℃、60 ℃、100 ℃時，雙酶復合酶解法提取的亞麻蛋白的起泡性顯著優(yōu)于堿溶酸沉法（P＜0.05）；同一溫度下，雙酶復合酶解法提取的亞麻蛋白的起泡穩(wěn)定性均顯著優(yōu)于堿溶酸沉法（P＜0.05）。

圖7 溫度對亞麻蛋白起泡性（a）及起泡穩(wěn)定性（b）的影響Fig.7 Effect of temperature on foaming property (a) and foaming stability (b) of flax protein

2.3.3 亞麻蛋白含量對亞麻蛋白起泡性及起泡穩(wěn)定性的影響

圖8 亞麻蛋白含量對亞麻蛋白起泡性（a）及起泡穩(wěn)定性（b）的影響Fig.8 Effect of flax protein contents on foaming property (a) and foaming stability (b) of flax protein

亞麻蛋白含量對亞麻蛋白起泡性及起泡穩(wěn)定性的影響見圖8。由圖8可知，隨著亞麻蛋白含量的增加，亞麻蛋白的起泡性及起泡穩(wěn)定性逐漸增大。在同一亞麻蛋白含量下，雙酶復合酶解法提取的亞麻蛋白的起泡性及起泡穩(wěn)定性均優(yōu)于堿溶酸沉法，且當亞麻蛋白含量為2.8%時，差異均顯著（P＜0.05）。

2.3.4 NaCl濃度對亞麻蛋白起泡性及起泡穩(wěn)定性的影響

NaCl濃度對亞麻蛋白起泡性及起泡穩(wěn)定性的影響見圖9。由圖9可知，起泡性和起泡穩(wěn)定性隨著NaCI濃度增加出現(xiàn)先上升后下降趨勢，雖然趨勢相同，但是起泡性變化趨勢較起泡穩(wěn)定性趨勢更陡峭?？赡茉蚴?，隨著NaCI濃度的增加，亞麻蛋白的溶解度增加，所以提高了亞麻蛋白的起泡性。當NaCI濃度在0.25～1.00 mol/L范圍內對亞麻蛋白的起泡性及起泡穩(wěn)定性有促進作用[20]，當NaCl濃度＞0.5 mol/L之后，有抑制作用；當NaCl濃度在1.00 mol/L時，兩種方法制備的亞麻蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性最佳。在同一NaCl濃度下，雙酶復合酶解法提取的亞麻蛋白的起泡性及起泡穩(wěn)定性均優(yōu)于堿溶酸沉法，且當NaCl濃度為0.25 mol/L、0.5 mol/L時，差異均顯著（P＜0.05）。

圖9 NaCl濃度對亞麻蛋白起泡穩(wěn)定性的影響Fig.9 Effect of NaCl concentration on stability of flax protein foam

2.4 不同影響因素對亞麻蛋白黏度的影響

2.4.1 pH值對亞麻蛋白黏度的影響

黏度是指溶液流動的快慢程度，其不僅可以使食品中各組分更加穩(wěn)定，還可以為改善產品的口感。影響流體或半流體黏度的主要因素有蛋白質分子的表面直徑、溫度等。pH值對亞麻蛋白黏度的影響見圖10。

圖10 pH值對亞麻蛋白黏度的影響Fig.10 Effect of pH value on flax protein viscosity

由圖10可知，亞麻蛋白的黏度在等電點附近，黏度較差，主要是因為在等電點附近，蛋白質的溶解度降低，蛋白質之間和蛋白質與溶劑之間的作用力減弱，使得阻力下降，以致亞麻蛋白黏度下將[21]。在同一pH值時，雙酶復合酶解法提取的亞麻蛋白的黏度優(yōu)于堿溶酸沉法，且當pH為2、4、6時，雙酶復合酶解法提取的亞麻蛋白的黏度顯著優(yōu)于堿溶酸沉法（P＜0.05）。

2.4.2 溫度對亞麻蛋白黏度的影響

溫度對亞麻蛋白黏度的影響見圖11。

圖11 溫度對亞麻蛋白黏度的影響Fig.11 Effect of temperature on flax protein viscosity

由圖11可知，隨著溫度的升高，亞麻蛋白黏度出現(xiàn)下降趨勢，分析原因可能是高溫可增加蛋白質間能量，產生的作用力難以控制逐漸變強的分子運動，間距增大導致吸引力減小，所以黏度出現(xiàn)下降趨勢[20]。在20 ℃黏度最佳，且在同一溫度下，雙酶復合酶解法提取的亞麻蛋白的黏度優(yōu)于堿溶酸沉法，但差異性不顯著（P＞0.05）。

2.4.3 亞麻蛋白含量對亞麻蛋白黏度的影響

蛋白質分子是影響蛋白質黏度的主要因素，這與蛋白質分子固有特性、蛋白質與溶劑間的作用還有蛋白質間的作用有關，它們決定了黏度的大小。亞麻蛋白含量對亞麻蛋白黏度的影響見圖12。

圖12 亞麻蛋白含量對亞麻蛋白黏度的影響Fig.12 Effect of flax protein contents on flax protein viscosity

由圖12可知，兩種方法提取的亞麻蛋白的黏度隨著亞麻蛋白含量的增加出現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當亞麻蛋白含量為2.2%時，亞麻蛋白的黏度最大。當亞麻蛋白含量在1.0%～2.2%時，黏度出現(xiàn)上升的趨勢，隨著亞麻蛋白含量的增加，蛋白質與溶劑和蛋白質與蛋白質間的作用增加，黏度也隨著增大。當亞麻蛋白含量＞2.2%之后，大量蛋白質不利于蛋白質的充分展開所以抑制蛋白質摩擦力，從而黏度下降[20]。在同一亞麻蛋白含量下，雙酶復合酶解法提取的亞麻蛋白的黏度優(yōu)于堿溶酸沉法，但差異不顯著（P＞0.05）。

2.4.4 NaCl濃度對亞麻蛋白黏度的影響

NaCl濃度對亞麻蛋白黏度的影響見圖13。

圖13 NaCl濃度對亞麻蛋白黏度的影響Fig.13 Effect of NaCl concentration on flax protein viscosity

當NaCl濃度在0.25～1.00 mol/L之間，亞麻蛋白黏度隨NaCl濃度的增加出現(xiàn)上升趨勢。原因可能是低濃度的NaCl溶液加速蛋白質的溶解，增加蛋白質之間、蛋白質與溶劑之間連結的網絡，使阻力變大，黏度增大；當NaCl濃度＞1.00 mol/L之后，蛋白質與蛋白質的結合物質發(fā)生沉淀，溶液中的蛋白質分子減少，所以黏度下降[20-21]；當NaCl濃度為1.00 mol/L時，兩種方法提取的亞麻蛋白的黏度最高。在同一NaCl濃度下，雙酶復合酶解法提取的亞麻蛋白的黏度優(yōu)于堿溶酸沉法，且在NaCl濃度為1.00 mol/L時，具有顯著性差異（P＜0.05）。

3 結論

本研究利用雙酶復合酶解法提取的亞麻蛋白的乳化性、乳化穩(wěn)定性、起泡性、起泡穩(wěn)定性和黏度較堿溶酸沉法更優(yōu)，且不同因素對亞麻蛋白功能性質具有一定的影響。雙酶復合酶解法提取的亞麻蛋白的等電點為4.4，當pH值11、溫度60 ℃、亞麻蛋白含量3.4%和NaCl濃度1.5 mol/L時，亞麻蛋白乳化性最佳；當pH值11、溫度40 ℃、亞麻蛋白含量3.4%和NaCl濃度1.5 mol/L，亞麻蛋白乳化穩(wěn)定性最佳；當pH值11、溫度60 ℃、亞麻蛋白含量2.8%和NaCl濃度1.0 mol/L時，亞麻蛋白起泡性最佳；當pH值8、溫度60 ℃、亞麻蛋白含量3.4%和NaCl濃度1.0 mol/L時，亞麻蛋白起泡穩(wěn)定性最佳；當pH值2、溫度20 ℃、亞麻蛋白含量2.2%和NaCl濃度1.0 mol/L時，亞麻蛋白黏度最佳。