解淀粉芽孢桿菌GSBa-1凝乳酶對(duì)切達(dá)干酪成熟過程中蛋白水解及生物活性的影響

趙 笑，蔡 淼，楊智杰，羅天淇，陳 超，曹永強(qiáng)，楊貞耐,,

（1.北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京工商大學(xué)，北京 100048；2.東君乳業(yè)（禹城）有限公司，山東 德州 253000）

凝乳酶是干酪制作過程中促使牛乳凝固的關(guān)鍵蛋白酶。隨著乳制品行業(yè)干酪產(chǎn)量的日益增長，凝乳酶的需求量不斷增加，但是傳統(tǒng)動(dòng)物來源的凝乳酶價(jià)格昂貴，且由于宗教或飲食原因，其應(yīng)用受到一定程度限制。獲得天然高效的新型凝乳酶成為干酪產(chǎn)業(yè)新的挑戰(zhàn)[1-2]。微生物凝乳酶具有來源廣、易于獲得、成本低等優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)前凝乳酶研發(fā)的熱點(diǎn)[3]。

與動(dòng)物來源的凝乳酶相比，微生物凝乳酶通常具有相對(duì)較高的蛋白水解活性，并對(duì)不同酪蛋白組分表現(xiàn)出不同的水解特異性[4]。干酪成熟過程中伴隨著蛋白水解作用導(dǎo)致小肽和游離氨基酸的不斷積累，可產(chǎn)生香氣化合物和生物活性因子，對(duì)干酪的風(fēng)味、功能和質(zhì)地都有影響[5]。通過調(diào)控蛋白水解，可以改善干酪的感官和品質(zhì)特性，加快干酪的成熟。干酪成熟過程中的蛋白水解分為初級(jí)蛋白水解和次級(jí)蛋白水解；初級(jí)蛋白水解是由干酪中殘留的凝乳酶或者其中存在的其他蛋白酶引起的酪蛋白（αs1-、αs2-、β-和κ-酪蛋白）的降解，對(duì)干酪品質(zhì)起著重要作用[6]。干酪初級(jí)和次級(jí)蛋白水解的程度因凝乳酶和發(fā)酵劑的熱失活程度而有很大的不同[7]。不同來源微生物凝乳酶的蛋白水解特性不同，導(dǎo)致干酪成熟過程中蛋白水解程度的差異，對(duì)干酪品質(zhì)產(chǎn)生不同的影響[8-9]。Ahmed等[10]研究表明產(chǎn)自嗜熱脂肪芽孢桿菌的凝乳酶具有良好的熱穩(wěn)定性和pH值穩(wěn)定性，使用這種酶生產(chǎn)的軟質(zhì)干酪與用商業(yè)混凝劑生產(chǎn)的同類產(chǎn)品具有相似的理化性質(zhì)和風(fēng)味特征，但是前者感官質(zhì)量較低。此外，使用解淀粉芽孢桿菌和芽孢桿菌spp. P45凝乳酶制作的干酪均表現(xiàn)出較高的蛋白質(zhì)水解并形成小分子肽，使干酪偏軟[3]。

酪蛋白酶解可釋放特定序列的肽并具有不同的生物活性，包括抗氧化、降血糖、抗菌、抗炎和免疫調(diào)節(jié)等活性[11]。近年來微生物凝乳酶在切達(dá)干酪中的應(yīng)用側(cè)重于研究干酪成熟過程中的蛋白水解對(duì)風(fēng)味及感官特性的影響，而對(duì)于成熟期干酪因蛋白降解導(dǎo)致的干酪生物活性變化的研究不多。本實(shí)驗(yàn)室此前從制作江米酒的酒曲中篩選到1 株產(chǎn)凝乳酶的菌株，命名為解淀粉芽孢桿菌GSBa-1[12]，該菌株產(chǎn)的凝乳酶具有高效凝乳活性且具有一定的蛋白水解能力，該凝乳酶應(yīng)用于馬蘇里拉干酪可促進(jìn)成熟過程中風(fēng)味物質(zhì)的形成[13]。本研究探討GSBa-1凝乳酶對(duì)切達(dá)干酪成熟過程中蛋白水解的作用及其與干酪生物活性之間的關(guān)系，通過控制微生物凝乳酶的蛋白水解改善切達(dá)干酪的生物活性，旨在進(jìn)一步了解微生物凝乳酶對(duì)干酪成熟特性和生物活性的影響及其作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生牛乳（pH 6.68，蛋白3.42%，脂肪4.50%），購自北京市半截河奶牛場；商業(yè)發(fā)酵劑R701、商業(yè)凝乳酶CHY-MAX Powder Extra NB 丹麥科漢森股份有限公司；干酪制作中所需氯化鈉和氯化鈣均為食品級(jí)；微生物凝乳酶為本實(shí)驗(yàn)室解淀粉芽孢桿菌GSBa-1發(fā)酵分離純化得到[14]；考馬斯亮藍(lán)色R250 美國Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

RHEOLASER MASTER微流變儀 法國Formulaction公司；Kjeltec 8400凱氏定氮儀 丹麥Foss分析儀器公司；Mini-Protean PowerPac Basic蛋白電泳系統(tǒng)、全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；Ultra-TurraxT25勻漿器 德國IKA公司；CR21GIII冷凍離心機(jī)日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 微流變測(cè)定

微流變儀是基于擴(kuò)散波光譜學(xué)方法對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)量。乳液樣品集中介質(zhì)中的動(dòng)態(tài)光散射和粒子的布朗運(yùn)動(dòng)依賴于其黏彈性的結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)加入不同凝乳酶的牛乳樣品以及添加鈣離子和未添加鈣離子的樣品進(jìn)行6 h的微流變學(xué)檢測(cè)，溫度設(shè)定為35 ℃，檢測(cè)過程中每6 min進(jìn)行一次數(shù)據(jù)采集，即測(cè)定彈性因子和黏性因子。該儀器通過測(cè)定粒子的布朗運(yùn)動(dòng)作為粒子均方位移與時(shí)間的關(guān)系，從而獲得樣品的彈性指數(shù)和黏性指數(shù)。

1.3.2 干酪制作

參考Zhang Li等[15]的方法，從當(dāng)?shù)啬膛鲑徺I的生牛乳用于制作切達(dá)干酪。采用相同批次的生牛乳（36 L），制作3 組干酪，每組3 個(gè)平行樣品（4 L生乳/樣品）。干酪A、干酪B和干酪C分別由商用凝乳酶、商業(yè)凝乳酶70%＋GSBa-1凝乳酶30%、GSBa-1凝乳酶制成。制作過程如下：將發(fā)酵劑（體積分?jǐn)?shù)1.5%）添加到經(jīng)過巴氏殺菌（65 ℃、30 min）牛乳中，攪拌均勻，33 ℃發(fā)酵30 min，然后加入氯化鈣（0.005 g/100 mL）和凝乳酶（1 500 SU/L），待45 min凝固（33 ℃）。將凝乳切成2 cm3大小的立方體，靜置10 min后，升溫至39 ℃，直到pH值降至6.1～6.2，此時(shí)完全排除乳清。乳清排出后，將凝塊切碎攪拌至pH值為5.4～5.5，研磨，加入食鹽量為2.7%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），裝入磨具，壓模過夜，壓好的干酪進(jìn)行真空包裝。干酪在4 ℃成熟12 周。干酪成熟過程中分別取0（第1天）、1、2、3、4、8、12 周樣品測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3.3 干酪理化指標(biāo)測(cè)定

干酪得率計(jì)算如式（1）所示：

參考文獻(xiàn)[16]凱氏定氮法測(cè)定干酪蛋白質(zhì)含量；根據(jù)GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測(cè)定》的方法測(cè)定干酪脂肪含量；根據(jù)GB 5009.44—2016《食品中氯化物的測(cè)定》的方法測(cè)定干酪鹽含量；根據(jù)GB 5009.3—2016《食品中水分的測(cè)定》的方法測(cè)定干酪水分含量。

pH值測(cè)定：取干酪樣品10 g，磨碎后加入事先于50 ℃溫浴的蒸餾水12 mL，用Ultra-Turrax勻漿器處理1 min，將樣品充分勻漿，放置在50 ℃水浴中保溫處理30 min，而后于6 000×g、20 ℃離心15 min，倒掉脂肪層，取下層溶液測(cè)定pH值。

微生物指標(biāo)的測(cè)定：取各成熟階段的干酪樣品5 g加入到45 mL滅菌的生理鹽水（40 ℃）中，勻漿處理2 min將樣品充分勻漿，然后逐級(jí)稀釋至10－5。挑取適當(dāng)稀釋度涂布于事先倒好的M17瓊脂平板上，培養(yǎng)2～3 d后對(duì)乳酸乳球菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.4 蛋白水解特性分析

1.3.4.1 蛋白水解活力測(cè)定

參照張富新[17]的福林-酚法。采用三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）將酶失活并沉淀非水解蛋白。1 個(gè)單位的蛋白水解活力定義為：40 ℃條件下，1 min內(nèi)催化酪蛋白水解產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需酶量。

1.3.4.2 pH 4.6可溶性氮和12% TCA可溶性氮含量測(cè)定

根據(jù)Kuchroo等[18]的方法，并略有改動(dòng)。準(zhǔn)確稱取干酪樣品20 g，磨碎后加入40 mL 50 ℃的無菌蒸餾水，充分勻漿，然后將溶液pH值調(diào)至4.6，置于40 ℃水浴中保溫1 h。并于6 000×g、20 ℃條件下離心15 min，過濾除去上層脂肪，并將濾液定容至100 mL。取10 mL濾液消化后，凱氏定氮測(cè)定樣品中的氮含量[19]。

量取1 0 m L 上述p H 4.6 可溶性氮溶液，加入10 mL 12%的TCA，充分混勻后于室溫條件下放置1 h，在6 000×g、20 ℃條件下離心15 min。取10 mL消化，凱氏定氮測(cè)定樣品中的氮含量。

1.3.4.3 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

SDS-PAGE分析參照Laemmli[20]的方法。濃縮膠4.5%，分離凝膠12.5%，0.01 g/100 mL考馬斯亮藍(lán)色R250染色，脫色處理后，采用全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)觀察。

1.3.5 干酪生物活性測(cè)定

1.3.5.1 金屬離子螯合能力

參照Wang Xu等[21]的方法并略有改動(dòng)。分別在不同成熟階段的樣品肽溶液（按1.3.4.2節(jié)方法得到的pH 4.6可溶性蛋白溶液，經(jīng)過0.22 μm濾膜）中加入相同體積的氯化鈣或氯化鋅（0.25 mol/L）。然后將溶液在45 ℃、80 r/min水浴搖床中孵育1 h，充分反應(yīng)。最后，將肽螯合物加入9 倍體積的乙醇，6 000 r/min、4 ℃離心沉淀15 min，上清液用于進(jìn)一步測(cè)定螯合能力。

乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）顯色滴定法測(cè)定鈣離子螯合能力。分別測(cè)定多肽和鈣混合溶液中鈣總含量以及除去鈣離子螯合物后剩余上清液中的鈣含量。在反應(yīng)混合物中加入指示劑鉻黑T后，調(diào)整至pH 10.5，再用EDTA-Na2溶液（25 mmol/L，pH 10.5）對(duì)溶液進(jìn)行滴定，直至溶液的顏色由紫紅色變?yōu)樗{(lán)色，根據(jù)EDTA消耗量，計(jì)算螯合比。鈣離子螯合能力計(jì)算如式（2）所示：

式中：M0為混合液中鈣總含量；M1為上清液中鈣含量。

鋅離子螯合能力測(cè)定方法與鈣離子螯合相同，其不同之處為使用氯化鋅與多肽螯合，螯合能力指示劑使用二甲酚橙，調(diào)整至pH 5.5～6.5，再用0.025 mol/L EDTA溶液（pH 6.0）對(duì)溶液進(jìn)行滴定，直至溶液的顏色由紫紅色變?yōu)槌赛S色。

1.3.5.2 降血糖作用

對(duì)α-淀粉酶抑制作用測(cè)定：參考Eleazu等[22]的方法進(jìn)行。25 μL樣品多肽溶液與25 μL 0.5 mg/mLα-淀粉酶（溶于20 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.9））溶液混合，25 ℃反應(yīng)10 min，然后加入25 μL含0.5%淀粉的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，25 ℃反應(yīng)10 min，加入50 mL 96 mmol/L二硝基水楊酸顯色劑終止反應(yīng)，反應(yīng)混合物在沸水浴中煮沸10 min，室溫冷卻，測(cè)定在540 nm波長處的吸光度，空白用蒸餾水代替多肽溶液，α-淀粉酶抑制率計(jì)算如式（3）所示：

對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用測(cè)定：5 μLα-葡萄糖苷酶溶液（1.0 U/mL）、20 μL樣品多肽溶液與165 μL 0.1 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 6.8）混合，在96 孔板中37 ℃放置10 min，然后加入底物10 μL（含0.95 mmol/L對(duì)硝基苯-葡萄糖苷的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液，pH 6.9），繼續(xù)37 ℃放置10 min，加入100 μL 1 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測(cè)定405 nm波長處的吸光度。并與4 個(gè)對(duì)照組比較（A：緩沖液＋酶＋底物＋Na2CO3；B：緩沖液＋Na2CO3；C：緩沖液＋酶＋樣品＋底物＋Na2CO3；D：緩沖液＋酶＋樣品＋Na2CO3）。α-葡萄糖苷酶抑制率計(jì)算如式（4）所示：

式中：A、B、C、D分別表示A、B、C、D組的吸光度。

1.3.5.3 抗氧化能力測(cè)定

DPPH自由基清除能力測(cè)定參考Zhang Fang等[23]方法并有所改動(dòng)。取0.5 mL干酪樣品肽溶液，與1 mL 0.2 mmol/L 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）-甲醇溶液混合均勻，室溫下避光反應(yīng)1 h，離心取上清液，于517 nm波長處測(cè)定吸光度。空白組以等體積甲醇代替DPPH溶液，對(duì)照組以等體積無菌水代替。DPPH自由基清除率計(jì)算如式（5）所示：

式中：A為空白組的吸光度；A0為對(duì)照組的吸光度；A1為樣品組的吸光度。

2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽離子自由基清除能力測(cè)定采用ABTS測(cè)定試劑盒，ABTS陽離子自由基吸光度測(cè)定波長為734 nm或405 nm。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 解淀粉芽孢桿菌GSBa-1凝乳酶作用下凝乳過程的流變學(xué)特性

圖1 牛乳在不同凝乳酶作用下凝乳過程的流變學(xué)特性Fig. 1 Rheological behavior during milk coagulation by different milk-clotting enzymes

前期研究表明GSBa-1凝乳酶為中性蛋白酶[13]，為探究該凝乳酶作用下的凝乳特性及蛋白水解變化，使其更好地應(yīng)用于干酪生產(chǎn)，選擇商業(yè)凝乳酶和商業(yè)芽孢桿菌中性蛋白酶對(duì)比GSBa-1凝乳酶在牛乳凝固過程中的流變學(xué)特性。如圖1A、B所示，加入GSBa-1凝乳酶的牛乳在整個(gè)凝乳過程中的黏彈性變化與商業(yè)凝乳酶更為接近，黏性顯著高于中性蛋白酶形成的凝乳。由圖1C可知，氯化鈣的加入使GSBa-1凝乳酶和商業(yè)凝乳酶的凝乳位點(diǎn)向前移動(dòng)，加快凝乳，縮短凝乳時(shí)間，提高凝乳后的彈性和黏性。加入中性蛋白酶的牛乳快速凝乳后凝乳結(jié)構(gòu)又迅速瓦解，整個(gè)過程中的黏性都很低（圖1D），且氯化鈣的加入使其彈性也迅速降低，表明該酶由于強(qiáng)烈的蛋白水解作用，不適用于干酪加工。而GSBa-1凝乳酶與商業(yè)芽孢桿菌中性蛋白酶不同，前者表現(xiàn)出更好的凝乳特性和較低的蛋白水解特性，可用作凝乳酶代替或者部分代替商業(yè)凝乳酶用于切達(dá)干酪的制作。

2.2 切達(dá)干酪的理化指標(biāo)分析

2.2.1 干酪基本理化指標(biāo)

表1 切達(dá)干酪的主要組成指標(biāo)比較Table 1 Comparison of main components of Cheddar cheeses

由表1可知，不同實(shí)驗(yàn)組成品切達(dá)干酪的干酪得率、總蛋白含量、脂肪含量以及氯化鈉含量之間無顯著差異（P＞0.05）。說明GSBa-1凝乳酶對(duì)切達(dá)干酪的主要組成成分沒有明顯影響。

2.2.2 切達(dá)干酪成熟過程中的pH值、水分及微生物變化

干酪的pH值取決于發(fā)酵劑乳酸乳球菌的生長繁殖、乳清排出時(shí)的酸堿度以及含鹽量[24]。由圖2A可知，整個(gè)干酪成熟過程中，3 組干酪的pH值呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，pH值大小為干酪A＞干酪B＞干酪C。 由于干酪制作過程中乳清排出時(shí)的pH值保持一致，干酪初始氯化鈉含量沒有明顯差異，因此，干酪C pH值顯著降低表明GSBa-1凝乳酶的蛋白水解作用可以使發(fā)酵劑的代謝活動(dòng)增強(qiáng)，產(chǎn)酸能力增加。由圖2B可知，干酪A和干酪B的水分含量有所升高，干酪C水分含量則明顯升高，且顯著高于干酪A和干酪B（P＜0.05），可能由于干酪C中GSBa-1凝乳酶的蛋白水解作用，使得干酪蛋白結(jié)構(gòu)部分破壞，部分結(jié)合水轉(zhuǎn)化為自由水，同時(shí)也影響了干酪的保水能力[25]。切達(dá)干酪成熟過程中，乳酸乳球菌的生存環(huán)境發(fā)生變化，部分菌發(fā)生自溶，使得3 組干酪的乳酸乳球菌數(shù)均逐漸下降，如圖2C所示，干酪C中的乳酸乳球菌數(shù)由9.77（lg（CFU/g））顯著下降至5.08（lg（CFU/g）），干酪成熟4 周后，干酪C的微生物乳酸乳球菌數(shù)迅速下降，顯著低于干酪A，干酪B乳酸乳球菌含量則介于干酪A和干酪C之間。干酪C較高的水分及pH值的迅速降低使乳酸乳球菌的自溶率增加，乳酸菌含有胞外及包內(nèi)多種蛋白酶，乳酸乳球菌的死亡，有助于胞內(nèi)酶的釋放[26]。

圖2 切達(dá)干酪成熟過程中p值（A）、水分含量（B）和活菌數(shù)（C）變化Fig. 2 Changes in pH (A), moisture (B) and viable bacterial count (C) of Cheddar cheeses during ripening

2.3 切達(dá)干酪成熟過程中的蛋白水解作用

2.3.1 GSBa-1凝乳酶對(duì)切達(dá)干酪成熟過程中蛋白水解活性的影響

圖3 切達(dá)干酪成熟過程中蛋白水解活力的變化Fig. 3 Changes in proteolytic activity of Cheddar cheeses during ripening

如圖3所示，干酪成熟過程中，干酪A和干酪C的蛋白水解活力趨勢(shì)相接近，在1 周之內(nèi)先分別上升至4.20 U/g和3.33 U/g，超過1 周之后緩慢下降并趨于平穩(wěn)。干酪C的蛋白水解活力則是在干酪成熟2 周之內(nèi)先上升至8.02 U/g，后到成熟第12周逐漸下降至2.59 U/g。干酪C的蛋白水解活力始終顯著高于干酪A和干酪B。

為進(jìn)一步探究GSBa-1凝乳酶作用下干酪蛋白的水解變化，將3 組干酪不同成熟期的蛋白應(yīng)用于SDS-PAGE，結(jié)果如圖4所示。干酪A 0～12 周成熟過程中蛋白條帶變化清晰，副κ-酪蛋白由商業(yè)凝乳酶切斷κ-酪蛋白的Phe105～Met106之間的肽鍵而產(chǎn)生，其蛋白條帶在10～15 kDa之間，存在于整個(gè)成熟過程，且未發(fā)生任何變化。α-酪蛋白條帶逐漸變窄，主要生成了位于下方的兩條清晰可見的蛋白條帶，而β-酪蛋白的變化不明顯。干酪B中蛋白條帶的變化與蛋白A接近。干酪C則在成熟過程中產(chǎn)生了很多模糊的蛋白條帶，尤其在成熟后的第12周，在小于10 kDa的蛋白下方，生成了一些小分子質(zhì)量的蛋白，表明干酪C成熟過程中在GSBa-1凝乳酶的作用下，更多的蛋白位點(diǎn)被切斷，酪蛋白被水解為小肽和氨基酸，使得干酪C和其他兩組干酪蛋白條帶有顯著差別。

圖4 切達(dá)干酪成熟過程中的SDS-PAG圖譜Fig. 4 SDS-PAGE patterns of Cheddar cheeses during ripening

2.3.2 pH 4.6可溶性氮及12% TCA可溶性氮的變化

切達(dá)干酪成熟過程中pH 4.6可溶性氮（圖5A）及12% TCA可溶性氮（圖5B）的變化，分別以占總氮質(zhì)量百分比表示。pH 4.6可溶性氮可作為蛋白質(zhì)水解程度的指標(biāo)，3 組干酪中的pH 4.6可溶性氮在成熟過程中均顯著增加后趨于平緩，干酪A、干酪B和干酪C在第12周的pH 4.6可溶性氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為9.32%、11.28%和13.32%。該結(jié)果表明解淀粉芽孢桿菌GSBa-1凝乳酶對(duì)切達(dá)干酪的蛋白水解程度顯著高于商業(yè)凝乳酶。與本研究結(jié)果相似，An Zhigang等[8]報(bào)道，使用解淀粉芽孢桿菌凝乳酶生產(chǎn)的切達(dá)干酪的pH 4.6可溶性氮含量比使用小牛凝乳酶生產(chǎn)的干酪高。Soodam等[27]的研究表明，隨著Rhizomucor mieheii凝乳酶濃度的增加，脫脂切達(dá)干酪中的pH 4.6可溶性氮含量也顯著增加。12% TCA可溶性氮代表小分子肽（2～20 個(gè)殘基）和游離氨基酸的含量，主要由發(fā)酵劑和非發(fā)酵劑乳酸菌蛋白酶和肽酶產(chǎn)生[28]。3 組干酪中12% TCA可溶性氮在12 周成熟過程中均呈上升趨勢(shì)，干酪A由1.91%上升至4.06%，干酪B由2.66%上升至4.95%，干酪C由3.22%上升至8.31%，且在整個(gè)成熟過程中存在顯著差異（P＜0.05）。該結(jié)果表明解淀粉芽孢桿菌GSBa-1凝乳酶的對(duì)干酪的蛋白水解作用增強(qiáng)了乳酸菌的代謝活動(dòng)，使乳酸菌蛋白酶和肽酶活性增加，進(jìn)而產(chǎn)生更多的小分子肽和游離氨基酸。

圖5 切達(dá)干酪成熟過程中p 4.6可溶性氮（A）和12%TCA可溶性氮（B）含量變化Fig. 5 Changes in pH 4.6 soluble nitrogen (A) and 12% TCA (B)soluble nitrogen contents of Cheddar cheeses during ripening

2.4 切達(dá)干酪成熟過程中生物活性的變化

圖6 切達(dá)干酪成熟過程中鈣離子螯合能力（A）和鋅離子螯合能力（B）變化Fig. 6 Changes in calcium ion-clelating ability (A) and zinc ion-chelating ability (B) of Cheddar cheeses during ripening

如圖6所示，干酪成熟過程中金屬離子螯合能力隨成熟時(shí)間的延長緩慢增加，干酪C的鈣離子、鋅離子螯合能力在4～12 周的成熟過程中均高于干酪A和干酪B，且干酪B的螯合能力介于干酪A和干酪C之間。尤其在干酪成熟的第12周，干酪C和干酪B的鈣離子螯合能力高達(dá)57.76%和53.11%，而干酪A的鈣離子螯合能力僅為49.88%。相比于干酪的鈣離子螯合能力，其鋅離子螯合能力則較低，干酪C和干酪B的鋅離子螯合能力最高為17.70%和15.19%，而干酪A的鋅離子螯合能力僅為9.71%。據(jù)報(bào)道，肽的鋅離子螯合能力與肽氨基酸殘基種類相關(guān)，組氨酸殘基越多，肽的鋅離子螯合率越大[29]，酪蛋白磷酸肽是磷酸化的酪蛋白水解物，體外細(xì)胞模型和大鼠模型實(shí)驗(yàn)表明，酪蛋白磷酸肽可以提高腸道鈣的吸收，增加鈣在骨骼中的結(jié)合，且鈣的結(jié)合性能與磷酸絲氨酸磷酸基有關(guān)，去磷酸化的肽段無法與鈣結(jié)合[30]。干酪C中產(chǎn)生了更多的具有鈣結(jié)合位點(diǎn)的磷酸化肽段，因此，顯示出了較高的鈣結(jié)合能力。

圖7 切達(dá)干酪成熟過程中α-葡萄糖苷酶抑制率（A）和α-淀粉酶抑制率（B）的變化Fig. 7 Changes in α-glucosidase (A) and α-amylase (B) inhibition activity during ripening of Cheddar cheeses

抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性可降低碳水化合物水解，從而減少糖被人體腸道吸收的可能性[31]。隨著干酪成熟時(shí)間的延長，α-葡萄糖苷酶抑制率逐漸上升至60%以上（圖7A），但3 組干酪之間在整個(gè)成熟過程中差異不明顯。隨著成熟時(shí)間的延長，α-淀粉酶抑制率呈下降趨勢(shì)（圖7B），但相比于干酪A，干酪B和干酪C的α-淀粉酶抑制率下降速率減慢，在成熟期12 周時(shí)的α-淀粉酶抑制率分別為40.64%、46.50%和46.04%，但不同組干酪間沒有顯著差異（P＞0.05）。據(jù)報(bào)道，上述兩種酶活性的抑制作用歸因于蛋白酶水解產(chǎn)生的生物活性肽，特別是小分子活性肽[32]。由此表明，降血糖作用可能主要與發(fā)酵劑乳酸菌水解酪蛋白產(chǎn)生的小分子肽有關(guān)，GSBa-1凝乳酶會(huì)不影響干酪的降血糖活性。

圖8 切達(dá)干酪成熟過程中DPP自由基清除率（A）和ABTS陽離子自由基清除率（B）的變化Fig. 8 Changes in DPPH radical (A) and ABTS cation radical (B)scavenging capacity of Cheddar cheeses during ripening

在成熟過程中，干酪對(duì)于DPPH自由基的清除能力（圖8A）先增加再降低然后趨于平緩，說明部分抗氧化肽可在干酪成熟過程中被進(jìn)一步水解。而對(duì)于ABTS陽離子自由基的清除能力（圖8B）則一直上升至成熟的第12周，且干酪對(duì)于ABTS陽離子自由基的清除能力更為明顯。對(duì)于兩種自由基的清除率，干酪C顯著高于干酪A和干酪B，尤其是在干酪成熟的第4～8周，DPPH自由基清除率最高為16.49%，ABTS陽離子自由基清除率最高為78.38%。Gupta等[33]研究了不同成熟期切達(dá)干酪抗氧化活性變化，干酪成熟第4個(gè)月時(shí)，ABTS陽離子自由基和DPPH自由基清除能力達(dá)到最大，表明其抗氧化活性與成熟期有關(guān)。Timón等[34]研究了不同來源凝乳酶（植物、動(dòng)物、微生物）制作的硬質(zhì)干酪中小分子肽的抗氧化活性和金屬離子螯合能力，發(fā)現(xiàn)使用微生物凝乳酶制作的干酪半最大效應(yīng)濃度（EC50）值最低，表明其抗氧化能力和金屬離子螯合能力顯著高于使用動(dòng)物凝乳酶和植物凝乳酶制作的干酪，這與本實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)論相似。肽的功能與其結(jié)構(gòu)相關(guān)，且小于3 kDa的肽段比3～5 kDa的肽段具有更高的生物活性[35]。不同凝乳酶的使用，導(dǎo)致干酪成熟過程中蛋白水解的變化，釋放出不同結(jié)構(gòu)的肽段，因此，不同組干酪的功能性有明顯差異。

3 結(jié) 論

與商業(yè)凝乳酶制作的切達(dá)干酪相比，解淀粉芽孢桿菌GSBa-1凝乳酶制作的切達(dá)干酪在成熟過程中的pH值和微生物含量顯著較低，水分含量顯著較高。由于GSBa-1凝乳酶具有相對(duì)較高的蛋白水解活力，使得其制作的切達(dá)干酪pH 4.6可溶性氮和12% TCA可溶性氮含量顯著較高，在成熟過程中生成了較多的小分子肽。體外生物活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GSBa-1凝乳酶可以提高切達(dá)干酪成熟過程中的鈣離子、鋅離子螯合能力和抗氧化能力，但對(duì)干酪降血糖作用的影響不大。因此，在滿足切達(dá)干酪其他性質(zhì)的同時(shí)，為了提高切達(dá)干酪的生物活性，可使用解淀粉芽孢桿菌GSBa-1凝乳酶替代或者部分替代商業(yè)凝乳酶制作切達(dá)干酪。