PRIME HLB固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蜂產(chǎn)品中10 種頭孢類藥物的殘留量

章 豪，吳銀良，張宜文，陳 國(guó)，江瀟瀟

（1.寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（寧波），浙江 寧波 315040；2.北京市計(jì)量檢測(cè)科學(xué)研究院，北京 100012）

頭孢類藥物屬于廣譜抗生素，臨診應(yīng)用的頭孢類藥物均為半合成物質(zhì)，殺菌力強(qiáng)，較青霉素類穩(wěn)定，目前已發(fā)展到第5代[1]。然而過(guò)量使用頭孢類藥物會(huì)對(duì)人體健康帶來(lái)潛在的危害，對(duì)兒童、老人，特別是胎兒的影響更大，嚴(yán)重者會(huì)導(dǎo)致胎兒病變、畸形、流產(chǎn)甚至死亡[2-3]。由于細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性和過(guò)敏反應(yīng)等原因，世界各國(guó)對(duì)部分動(dòng)物源性產(chǎn)品中頭孢類藥物殘留量均提出了限量要求，如美國(guó)食品藥品管理局規(guī)定牛奶中頭孢匹林最高殘留限量為20 μg/kg，牛肉未蒸煮可食組織中頭孢匹林最高殘留限量為100 μg/kg；歐盟規(guī)定牛奶中頭孢類藥物最高殘留限量為20～100 μg/kg；目前我國(guó)制定的頭孢類藥物的最高殘留限量為：頭孢氨芐在牛肌肉、肝、腎、脂肪和奶中的最高限量分別為200、200、1 000、200 μg/kg和100 μg/kg；頭孢喹肟在牛豬肌肉、肝、腎、脂肪和牛奶中的最高限量分別為50、100、200、50 μg/kg和20 μg/kg；頭孢噻呋在牛豬肌肉、肝、腎、脂肪、牛奶中的限量分別為1 000、2 000、6 000、2 000 μg/kg和100 μg/kg，其中頭孢噻呋的殘留量以其代謝產(chǎn)物去呋喃甲?；^孢噻呋檢測(cè)含量計(jì)算[4]。但目前頭孢類藥物在蜂蜜中暫無(wú)限量規(guī)定。

目前對(duì)包括頭孢類藥物在內(nèi)的β-內(nèi)酰胺類藥物殘留分析的方法主要有液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[5-9]、高效液相色譜法[10-15]、毛細(xì)管電泳法[16-17]和微生物法[18]，且主要集中在肉[19-20]和牛奶[21-23]，以及飼料[24-25]和雞蛋[26]樣品。然而，近年來(lái)，有關(guān)蜂產(chǎn)品中頭孢類藥物分析方法的研究鮮有報(bào)道。GB/T 22942—2008《蜂蜜中頭孢唑啉、頭孢匹林、頭孢氨芐、頭孢洛寧和頭孢喹肟殘留量的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》中方法以磷酸鹽緩沖溶液為提取液，采用Oasis HLB固相萃取小柱凈化，液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。該方法中頭孢唑啉的定量限為10 μg/kg，頭孢匹林、頭孢氨芐、頭孢洛寧、頭孢喹肟的定量限為2.0 μg/kg。20世紀(jì)90年代以后，絕大多數(shù)生物有機(jī)體中的β-內(nèi)酰胺類藥物殘留分析采用液相色譜進(jìn)行測(cè)定。然而使用液相色譜法測(cè)定時(shí)，未經(jīng)衍生化測(cè)定時(shí)，基體干擾較大，而經(jīng)衍生化測(cè)定后靈敏度有所提高，但只能作為一種篩選方法進(jìn)行使用，且對(duì)于分析多種頭孢類藥物有極大難度。而超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法是一種集多組分定性、定量和高效分離于一體的系統(tǒng)，對(duì)于分析蜂產(chǎn)品中頭孢類藥物，不僅能夠顯著提高方法的靈敏度和定性的準(zhǔn)確度，而且能夠降低前處理的成本和工作量[27]。高效液相色譜和UPLC-MS/MS方法，對(duì)于復(fù)雜基質(zhì)的前處理方法常采用固相萃取小柱進(jìn)行凈化和富集[5,21,23]。根據(jù)頭孢類藥物的相關(guān)報(bào)道[28-29]，考慮到藥物的理化特性，前處理中凈化一般選用Oasis HLB固相萃取小柱，且凈化過(guò)程往往需要活化等費(fèi)時(shí)費(fèi)力的步驟。近來(lái)，Oasis PRiME HLB固相萃取小柱簡(jiǎn)單快速的通過(guò)式凈化方案被用于快速有效地去除食品基質(zhì)中的各種主要干擾物，包括脂肪、磷脂以及色素等[30]。Oasis PRIME HLB固相萃取小柱省去傳統(tǒng)的活化、平衡步驟，樣品經(jīng)提取后直接上樣，這種樣品凈化方法簡(jiǎn)單、快速、有效，適合大批量日常分析檢測(cè)。但是，目前鮮見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道采用Oasis PRIME HLB固相萃取小柱用于蜂產(chǎn)品抗生素的樣品前處理。

本研究采用Oasis PRIME HLB固相萃取小柱，對(duì)儀器條件和樣品前處理方法進(jìn)行優(yōu)化，選擇了目前各國(guó)規(guī)定的最大殘留限量要求的10 種頭孢類藥物及其代謝產(chǎn)物，建立了基于UPLC-MS/MS儀測(cè)定3 類主要蜂產(chǎn)品（蜂蜜、蜂王漿和蜂王漿凍干粉）中頭孢類藥物殘留的分析方法。該方法具有精密度和準(zhǔn)確度高、檢測(cè)周期短的優(yōu)點(diǎn)，為蜂產(chǎn)品中頭孢類藥物的風(fēng)險(xiǎn)識(shí)別、確證與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供了有效的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜂產(chǎn)品：蜂蜜、蜂王漿和蜂王漿凍干粉 市購(gòu)。

頭孢類藥物標(biāo)準(zhǔn)品（頭孢匹林、頭孢哌酮、頭孢唑啉、頭孢乙腈、頭孢拉定、頭孢氨芐、頭孢洛寧、頭孢喹肟、去乙?；^孢匹林、頭孢噻肟）（純度均大于95%） 德國(guó)Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；甲酸（色譜純） 美國(guó)Tedia公司；乙腈、甲醇（均為色譜純） 德國(guó)Merck公司；Oasis PRIME HLB固相萃取小柱（500 mg/6 mL） 美國(guó)Waters公司；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

UPLC XevoTMTQ-S micro超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI）及MassLynxV4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)） 美國(guó)Waters公司；低溫高速離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；Vortex Genie 3旋渦振蕩器 德國(guó)IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

稱取蜂蜜樣品約5.00 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中；稱取蜂王漿樣品約2.50 g（精確至0.01 g）；稱取蜂王漿凍干粉樣品約1.00 g（精確至0.01 g）。分別加入10%甲酸溶液20 mL，渦旋振蕩1 min；蜂蜜樣品直接移取溶液，蜂王漿、蜂王漿凍干粉樣品9 500 r/min離心5 min，移取上清液至Oasis PRIME HLB固相萃取小柱，待液面到達(dá)柱床表面時(shí)用3 mL水淋洗，3 mL乙腈洗脫，收集全部流出液，流出液在40 ℃氮?dú)獯蹈?；? mL 0.1%甲酸溶液-甲醇（95∶5，V/V）溶液溶解，渦旋振蕩，過(guò)0.22 μm濾膜，然后UPLC-MS/MS進(jìn)行分析。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Acquity UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：A相為0.1%甲酸溶液，B相為甲醇；流速0.30 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

1.3.3 質(zhì)譜條件

多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)模式（multiple reaction monitoring，MRM）；ESI源正離子模式電離；脫溶劑氣流速：1 000 L/h；錐孔氣流速：50 L/h；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑氣溫度：500 ℃；毛細(xì)管電壓：2.0 kV；射頻電壓：0.5 V；萃取錐孔電壓：25 V。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)以平均值表示，采用Excel 2013軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，由工作站直接生成MRM色譜圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件優(yōu)化

2.1.1 色譜條件

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program of liquid chromatography

本實(shí)驗(yàn)考察了水-乙腈和水-甲醇2 種流動(dòng)相體系的響應(yīng)情況，發(fā)現(xiàn)當(dāng)采用水-乙腈進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，各頭孢類藥物之間存在相互離子抑制情況，其中頭孢哌酮、頭孢乙腈等頭孢類藥物的響應(yīng)較差，可能是在乙腈作為流動(dòng)相的體系中，易離子化的頭孢類藥物抑制了不易離子化的頭孢類藥物進(jìn)行離子化，從而導(dǎo)致有的藥物未完全離子化；而采用水-甲醇體系為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，相互抑制的情況未發(fā)生，10 種藥物的響應(yīng)均較好，所有的頭孢類藥物均獲得了較好的離子化，從而均獲得了較好的靈敏度，因此確定水-甲醇體系為流動(dòng)相。梯度洗脫條件如表1所示。

2.1.2 質(zhì)譜條件

本實(shí)驗(yàn)采用體積分?jǐn)?shù)5%的甲醇溶液分別配制2.0 mg/L的10 種頭孢類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用UPLC-MS/MS儀自帶的Intellistart軟件分別獲得10 種頭孢類藥物的母離子、子離子、錐孔電壓和碰撞能量，如表2所示。對(duì)頭孢類藥物采用ESI正負(fù)離子模式掃描，發(fā)現(xiàn)較負(fù)離子模式在正離子模式下10 種藥物的響應(yīng)更高，靈敏度更好，所以采用正離子模式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。這與現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定頭孢類藥物殘留的分析方法大多采用ESI源正離子模式電離一致[5-9]。

表2 10 種頭孢類藥物的母離子、子離子、錐孔電壓和碰撞能量Table 2 Parent ions, daughter ions, cone voltages and collision energies for 10 cephalosporins

2.2 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)使用體積分?jǐn)?shù)10%甲酸溶液和乙腈-水（80∶20，V/V）2 種溶劑對(duì)蜂蜜在加標(biāo)量20 μg/kg水平下進(jìn)行提取上樣，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用乙腈-水（80∶20，V/V）上樣時(shí)，所有頭孢類藥物的回收率為75.9%～87.5%；而采用10%甲酸溶液上樣時(shí)，所有頭孢類藥物的回收率均不低于82.5%（82.5%～95.5%），因此確定以10%甲酸的溶液進(jìn)行溶解上樣。在10%甲酸溶液作為頭孢類藥物提取溶劑的條件下，蜂蜜樣品回收率較高，但蜂王漿和蜂王漿凍干粉樣品的回收率較低，這是由于頭孢類物質(zhì)在水中的溶解度較高，與蜂蜜樣品相比，蜂王漿和蜂王漿凍干粉樣品中含水量較少，從而導(dǎo)致提取目標(biāo)化合物不完全，回收率較低。以蜂王漿為例補(bǔ)充了相關(guān)的實(shí)驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)當(dāng)蜂王漿樣品為5 g的情況下需要的水的體積為50 mL左右，這將給下一步過(guò)柱和方法的實(shí)際操作帶來(lái)一定的困難，因此將蜂王漿的稱樣量定為2.5 g；同理，將蜂王漿凍干粉稱樣量定為1.0 g。發(fā)現(xiàn)在減少蜂王漿和蜂王漿凍干粉樣品的稱樣量后，回收率可以達(dá)到與蜂蜜樣品相近的結(jié)果。

2.3 固相萃取小柱的選擇

根據(jù)頭孢類藥物的相關(guān)報(bào)道[28-29]，考慮到藥物的理化特性，前處理中凈化一般選用Oasis HLB固相萃取小柱，且凈化過(guò)程往往需要活化等費(fèi)時(shí)費(fèi)力的步驟。本實(shí)驗(yàn)對(duì)Oasis PRIME HLB和Oasis HLB兩款固相萃取小柱進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，在無(wú)需活化等復(fù)雜的步驟下，樣品采用Oasis PRIME HLB固相萃取小柱凈化后，無(wú)論是在回收率還是基質(zhì)干擾方面，均優(yōu)于采用Oasis HLB固相萃取小柱凈化的結(jié)果。這可能是因?yàn)閷?duì)于蜂產(chǎn)品特別是蜂王漿和蜂王漿凍干粉中的磷脂和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，相比較Oasis HLB固相萃取小柱，Oasis PRIME HLB固相萃取小柱可以更好地吸附這些雜質(zhì)，不僅無(wú)需活化等費(fèi)時(shí)費(fèi)力的前處理步驟，在顯著縮短凈化時(shí)間的同時(shí)還能延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命[30-31]。因此本實(shí)驗(yàn)采用Oasis PRIME HLB固相萃取小柱作為凈化小柱。

2.4 線性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 10 種頭孢類藥物在不同基質(zhì)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)Table 3 Standard curve equations with correlation coefficients in different matrices for 10 cephalosporins

采用蜂產(chǎn)品空白基質(zhì)液配制1、5、20、50、200、500、1 000 μg/L的系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（其中頭孢乙腈、頭孢哌酮和頭孢唑啉為5、20、50、200、500、1 000 μg/L）進(jìn)行UPLC-MS/MS分析，以峰面積對(duì)相應(yīng)質(zhì)量濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)（r2），如表3所示。10 種頭孢類藥物在相應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r2均大于0.999。

2.5 回收率、精密度與檢出限測(cè)定結(jié)果

圖1 10 種頭孢混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 μg/L）的MRM色譜圖Fig. 1 MRM chromatograms of mixed standard solution (1 μg/L)

表4 10 種頭孢類藥物在蜂蜜中的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 4 Recoveries and relative standard deviations of 10 cephalosporins in honey

頭孢類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM色譜圖見(jiàn)圖1。在蜂產(chǎn)品中選取最為主要的蜂蜜、蜂王漿和蜂王漿凍干粉3 類基質(zhì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，從每一類基質(zhì)中選取代表樣品進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。樣品前處理同1.3.1節(jié)，其中，蜂蜜中頭孢哌酮、頭孢乙腈和頭孢唑啉3 種頭孢類藥物的添加量為4、20、200 μg/kg，其余7 種頭孢類藥物的添加量為1、20、200 μg/kg；蜂王漿中頭孢哌酮、頭孢乙腈和頭孢唑啉3 種藥物的添加量為8、40、200 μg/kg，其余7 種頭孢類藥物的添加量為2、20、200 μg/kg；蜂王漿凍干粉中頭孢哌酮、頭孢乙腈和頭孢唑啉3 種藥物的添加量為20、50、200 μg/kg，其余7 種頭孢類藥物的添加量為5、50、200 μg/kg，每批次同添加水平做5 個(gè)平行樣品，重復(fù)測(cè)定3 次，結(jié)果見(jiàn)表4～6。

表5 10 種頭孢類藥物在蜂王漿中的回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 5 Recoveries and relative standard deviations of 10 cephalosporins in royal jelly

表6 10 種頭孢類藥物在蜂王漿凍干粉中的回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 6 Recoveries and relative standard deviations of 10 cephalosporins in lyophilized royal jelly powder

由表4～6可知，10 種頭孢類藥物的加標(biāo)回收率為80.0%～95.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%～4.8%。上述結(jié)果表明，該方法對(duì)測(cè)定蜂蜜、蜂王漿和蜂王漿凍干粉中10 種頭孢類藥物的殘留均具有較好的準(zhǔn)確度和精密度。按3 倍信噪比（RSN=3）計(jì)算，10 種頭孢類藥物的檢出限為0.1～1 μg/kg；按10 倍信噪比（RSN=10）計(jì)算，10 種頭孢類藥物的定量限為0.3～3 μg/kg。GB 31650—2019《食品中獸藥最大殘留限量》規(guī)定頭孢喹肟、頭孢氨芐在動(dòng)物性食品中的最大殘留限量為20～1 000 μg/kg，而本方法檢出限為0.1～1 μg/kg，能滿足該類藥物在蜂產(chǎn)品中含量分析的需要。

3 結(jié) 論

建立了同時(shí)分析蜂產(chǎn)品中10 種頭孢類藥物的UPLCMS/MS方法，樣品經(jīng)10%甲酸溶液提取后離心，上清液經(jīng)Oasis PRIME HLB固相萃取柱凈化，氮吹后復(fù)溶進(jìn)樣分析。10 種頭孢類藥物的添加回收率為80.0%～95.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%～4.8%；檢出限為0.1～1 μg/kg，定量限為0.3～3 μg/kg。方法具有精密度和準(zhǔn)確度高、檢測(cè)周期短的優(yōu)點(diǎn)，能滿足蜂產(chǎn)品中10 種頭孢類藥物含量分析的需要。