在4 ℃降溫平衡過程中0.2g/L咖啡因與精子共孵育時間對豬顆粒凍精質(zhì)量的影響

郭雅欣 ，張學(xué)煒 ，鄭 梓 ，李 寧 ，陳 亮 ，穆淑琴 ，李千軍 ，崔茂盛 *

（1.天津農(nóng)學(xué)院，天津 300380；2.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300384；3. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100094）

1 引言

隨著豬場集約化、規(guī)模化發(fā)展，豬冷凍精液在長期保存、長途運(yùn)輸和跨區(qū)域品種改良以及區(qū)域或全國范圍內(nèi)種豬聯(lián)合育種等方面具有獨(dú)特的技術(shù)優(yōu)勢和重要的現(xiàn)實(shí)意義。尤其在目前非洲豬瘟防控壓力下，通過豬精液質(zhì)量監(jiān)控和冷凍精液無菌化操作，利用凍精輸精可大大降低由于種公豬引進(jìn)而帶來的疾病傳播風(fēng)險(xiǎn)，有力促進(jìn)種豬種質(zhì)資源的交流[1]。

目前豬精液冷凍形式主要有顆粒法和細(xì)管法兩種，這兩種方法各有優(yōu)勢。細(xì)管法冷凍效果較好，在保存和運(yùn)輸中可有效避免凍精之間的交叉感染，且已在國內(nèi)外部分種豬場開展生產(chǎn)應(yīng)用，取得了較好的應(yīng)用效果[2]，但細(xì)管法需要昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)的人才培訓(xùn)，限制了豬場內(nèi)凍精生產(chǎn)和應(yīng)用。顆粒法制作凍精不需要高昂的設(shè)備與系統(tǒng)的人員培訓(xùn)，相對來說更易應(yīng)用推廣，但顆粒凍精的質(zhì)量相對較低[3]。為提高豬精子冷凍效果，前人已在優(yōu)化豬精子冷凍液成分，如酸堿緩沖體系、能量物質(zhì)、保護(hù)劑等方面做了大量研究與探討。在稀釋液中添加紅景天和糖褐藻膠等物質(zhì)，可提升精子活率、線粒體完整率和頂體完整率[4]，在精液冷凍保存中加入丹參酮IIA、靈芝多糖、蘆丁[5]、褪黑素[6]、L-半胱氨酸[7]等物質(zhì)可減少精子氧化損傷，提升凍精質(zhì)量等?？Х纫蚴菑目煽蓸?、茶葉、咖啡豆等植物中提煉出來的一種生物堿，具有刺激精子活動、提高精子活力和解凍后頂體完整率等作用[8]。前人雖然在豬精液細(xì)管冷凍過程中添加不同濃度咖啡因[9]，以及顆粒凍精解凍液中添加咖啡因[10]等試驗(yàn)進(jìn)行了多方面研究，探討了咖啡因?qū)鋬鼍淤|(zhì)量的影響。谷合勇等人研究指出冷凍液中0.2 mg/mL的咖啡因添加量，可顯著提高豬細(xì)管凍精解凍后精子活力、質(zhì)膜完整率與頂體完整率等[11]。但在豬顆粒凍精制作過程中，咖啡因與精液共孵育時間長短對凍精質(zhì)量有何影響，尚未見相關(guān)報(bào)道。在團(tuán)隊(duì)前期工作基礎(chǔ)上，探討0.2 g/L咖啡因與精液共孵育2 h、1 h和0.5 h對豬顆粒凍精質(zhì)量的影響，以期進(jìn)一步提高豬精液顆粒冷凍效果。

2 材料與方法

2.1 豬精液采集

使用手握法采集某豬場大白公豬精液，收集中段精子密度較高的部分。選擇顏色乳白、無惡臭、密度在1.5億個/mL以上、精子活率在85%以上、精子畸形率低于5%的原精，用等溫BTS液按1∶1對原精稀釋后，置于37 ℃保溫瓶中0.5 h內(nèi)帶回到實(shí)驗(yàn)室。

2.2 主要試劑設(shè)備

主要試劑：半胱氨酸、葡萄糖、青霉素、鏈霉素、碳酸氫鈉、EDTA等；主要儀器設(shè)備：17 ℃恒溫箱、4 ℃冰箱、離心機(jī)、電熱恒溫水槽、電子天平等。

2.2.1 冷凍稀釋液配制

冷凍Ⅰ液配制：檸檬酸1.25 g，葡萄糖1.18 g，Tris 2.428 g，乳糖20 g，半胱氨酸0.02 g，加蒸餾水至100 mL，調(diào)pH至6.21。加入體積百分比為20%的新鮮雞蛋卵黃，最后加入青霉素0.6 g/L和鏈霉素1 g/L經(jīng)磁力攪拌器充分?jǐn)嚢杈鶆?；冷凍Ⅱ液配制：在I液基礎(chǔ)上加入體積百分比為9%的甘油。

2.2.2 精液的稀釋與平衡

將帶回的精液在室溫下靜置0.5 h，平均分裝于50 mL 康寧（Corning）離心管中，以2 000 r/min離心6 min，棄上清液后按1∶1等溫緩慢加入冷凍稀釋Ⅰ液并輕輕搖勻，然后在17 ℃恒溫箱中平衡1 h，轉(zhuǎn)入4 ℃冰箱中繼續(xù)平衡2 h。分別在4 ℃平衡的0、1和1.5 h組離心管內(nèi)添加0.2 g/L的咖啡因。4 ℃平衡結(jié)束后在等溫條件下按2∶1體積比與冷凍Ⅱ液混合均勻，再平衡15 min開始滴凍。

2.2.3 豬精液顆粒凍精制作

實(shí)驗(yàn)利用長和寬稍大于氟板、深度約7 cm的泡沫箱作為冷凍槽。實(shí)驗(yàn)前在泡沫箱內(nèi)倒入1/3體積的液氮，將氟板沉入液氮內(nèi)充分浸泡后放在特制的冷凍架上，并調(diào)整冷凍架與液氮面的距離，使氟板溫度在- 120～- 110 ℃之間，蓋上泡沫盒蓋平衡2 min后開始滴凍。滴凍時用預(yù)冷的根據(jù)氟板量身定制的多重排槍（已授權(quán)實(shí)用新型專利，2013年），可一次性完成30粒滴凍，每批滴凍顆粒90粒，總滴凍時間控制在30 s以內(nèi)。滴凍后迅速蓋上槽蓋平衡6 min，然后將氟板快速沉入冷凍槽內(nèi)的液氮中，再蓋上蓋子平衡5 min以上，隨機(jī)取出3粒凍精進(jìn)行解凍、質(zhì)量檢查。

2.2.4 顆粒凍精解凍

實(shí)驗(yàn)采用濕解法，解凍液為含有0.1%半胱氨酸和0.05%肌醇的BTS液，解凍溫度為45 ℃。解凍時隨機(jī)取出1粒凍精在空中晃動3～5 s，然后快速放入含有0.5 mL的已充分預(yù)熱的解凍液的圓底玻璃試管中，在45 ℃水浴鍋內(nèi)快速搖動試管，待凍精顆粒溶解致2/3時迅速將試管離開水浴鍋，借助余熱使凍精顆粒完全融化。解凍結(jié)束后在室溫下平衡5 min，開始凍精質(zhì)量檢測檢。檢測指標(biāo)為精子活率、活力、質(zhì)膜完整性和頂體完整性及室溫下精子存活時間等指標(biāo)。

2.2.5 凍精質(zhì)量評價(jià)方法

1）精子活率

伊紅-苯胺黑聯(lián)合染色法判斷精子活性，死精子質(zhì)膜通透性增大，染料進(jìn)入膜內(nèi)染色，呈紅色；而該染料透不過活精子膜，因此活精子不著色。實(shí)驗(yàn)中，在體式顯微鏡100倍視野下計(jì)數(shù)200個精子，計(jì)算未著色（活精子）占200個精子的百分率，即為活率。

2）精子活力

在體式顯微鏡100倍視野下計(jì)數(shù)精液中直線前進(jìn)運(yùn)動精子數(shù)占總精子數(shù)的百分比，即為活力。

3）質(zhì)膜完整性

采用低滲腫脹實(shí)驗(yàn)（HOST）法進(jìn)行精子質(zhì)膜完整性的檢測。質(zhì)膜完整的精子尾巴因?yàn)榈蜐B腫脹而呈現(xiàn)出較大彎曲，而質(zhì)膜破裂的精子，不會出現(xiàn)低滲腫脹現(xiàn)象，其尾巴不彎曲或稍微彎曲。

4）頂體完整性

對精子頂體完整性采用金霉素（CTC）熒光染色法進(jìn)行檢測。在實(shí)驗(yàn)中，精子經(jīng)過CTC熒光染色后精子整個頭部呈現(xiàn)均一熒光，為頂體完整的精子；整個精子頭部無熒光或非常弱的熒光，為頂體不完整的精子。

2.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

精液在4 ℃冰箱中平衡2 h的過程中，分別設(shè)計(jì)在開始平衡的0 h、1 h和1.5 h三個時間點(diǎn)向冷凍稀釋液中添加0.2 g/L咖啡因，則咖啡因與精液共孵育時間分別為2 h、1 h和0.5 h，實(shí)驗(yàn)中設(shè)定無咖啡因添加組為對照組。通過檢測冷凍前后精子活率、活力、質(zhì)膜完整性和頂體完整性以及解凍后精子體外存活時間等指標(biāo)。探討在4 ℃平衡過程中咖啡因與精液不同共孵育時間對冷凍前后精子質(zhì)量的影響。

2.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel進(jìn)行初步整理，再利用SPSS 20.0對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析、利用LSD法進(jìn)行多重比較。數(shù)據(jù)均使用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)”的形式進(jìn)行表示。P＜0.05表示差異顯著，反之則表示差異不顯著。

3 結(jié)果與分析

3.1 咖啡因不同平衡時間對冷凍前精子質(zhì)量的影響

由表1可知，咖啡因與精液不同共孵育時間組活率和活力都呈現(xiàn)出升高趨勢，但相較對照組差異不顯著；但在頂體完整率和質(zhì)膜完整率上，對照組分別為 (83.03 ±0.20與 84.32 ±0.21)，顯著高于共孵育2 h、1 h和0.5 h組，后3組之間差異均不顯著。精子質(zhì)膜完整性、頂體完整性和活率等染色圖片分別如圖1、圖2和圖3所示。

3.2 咖啡因不同平衡時間對冷凍解凍后精子質(zhì)量的影響

由表2可看出，精液和咖啡因共孵育組顆粒凍精，解凍后精子活率和活力均顯著高于對照組，其中共孵育1 h組顯著高于其他3組（P＜0.05），共孵育2 h組和0.5 h組間差異不顯著（P＞0.05）；在頂體完整率和質(zhì)膜完整率上，共孵育2 h組顯著低于對照組和共孵育0.5 h、1 h組（P＜ 0.05），但后 3組精子頂體完整率和質(zhì)膜完整率差異均不顯著；對解凍后精子體外存活時間而言，咖啡因與精子共孵育2 h組精子存活時間顯著低于對照組、共孵育1 h和0.5 h組（P＜0.05），雖然共孵育1 h組精子存活時間最長，但相對于共孵育0.5 h組和對照組差異不顯著（P＞0.05）。

4 討論

在精液冷凍前，0.2 g/L的咖啡因與精液共孵育并沒有顯著提高精子的活率和活力。這可能與原精質(zhì)量本身較好相關(guān)，在實(shí)驗(yàn)中，原精活率和活力檢測結(jié)果分別在0.85和0.9以上。實(shí)際上，研究結(jié)果顯示0.2 g/L咖啡因不同共孵育時間，均有提高精子活率和活力的趨勢，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異。在檢測精子質(zhì)膜完整性和頂體完整性時發(fā)現(xiàn)，對照組的質(zhì)膜完整率和頂體完整率，顯著高于平衡2 h、1 h和0.5 h組，后3組之間差異均不顯著。研究推測，這可能和咖啡因添加組精子活率和活力升高有關(guān)。據(jù)研究表明，咖啡因具有刺激精子神經(jīng)中樞的作用，在增加精子的運(yùn)動劇烈程度的同時[12]，精子內(nèi)線粒體活性也進(jìn)一步活化，產(chǎn)生更多的ATP給精子提供能量[13]，而較強(qiáng)且持續(xù)的能量代謝導(dǎo)致精子產(chǎn)生過量的活性氧[14]，對精子細(xì)胞器和質(zhì)膜造成傷害，另外較高咖啡因物質(zhì)的攝入，還會增加精子膜的通透性，從而在提高質(zhì)膜內(nèi)外物質(zhì)交換的同時，可能會降低質(zhì)膜的完整率和頂體完整性。然而此次研究結(jié)果又表明，平衡2 h、1 h和0.5 h組精子質(zhì)膜完整性和頂體完整性之間差異并不顯著，此研究結(jié)果與2 h、1 h和0.5 h 這3組之間精子活率和活力差異不顯著的結(jié)果一致。

表1 咖啡因不同平衡時間對冷凍前豬精子質(zhì)量的影響 %

表2 顆粒凍精解凍后精子質(zhì)量檢測 %

豬顆粒凍精解凍后的精子質(zhì)量檢測結(jié)果表明，0.2 mg/mL咖啡因共孵育的3組中精子活率和活力均顯著高于對照組，該結(jié)果與金穗華[15]、黃全成[16]、Pariz[13]等人的研究結(jié)果一致；同時此次實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，在4 ℃條件下0.2 mg/mL咖啡因與精液共孵育1 h組精子活率和活力顯著高于共孵育2 h和0.5 h組（P＜0.05）。有研究表明，雖然咖啡因能夠提高冷凍后精子活率和質(zhì)膜完整性[17]，但長時間的咖啡因刺激，不僅會導(dǎo)致解凍后精子活率、活力的降低，而且還會因活性氧的產(chǎn)生對精子質(zhì)膜造成傷害[14]。從此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在實(shí)驗(yàn)條件下0.2 mg/mL咖啡因與精液共孵育時間為1 h，對凍后精子活率和活力最有利。在精子質(zhì)膜完整率和頂體完整率方面，咖啡因平衡2 h組均顯著低于對照組和平衡1 h、0.5 h組（P＜0.05），而后3組之間精子質(zhì)膜完整率和頂體完整率差異均不顯著。該結(jié)果進(jìn)一步表明，較長時間的咖啡因與精液共孵育，會對解凍后精子質(zhì)量產(chǎn)生不利影響。同時，實(shí)驗(yàn)中咖啡因與精液共孵育1 h和0.5 h兩組中的精子質(zhì)膜完整率和頂體完整率均與對照組之間差異不顯著。此結(jié)果說明，0.2 mg/mL咖啡因與精液0.5 h～1 h的共孵育，不會對解凍后精子質(zhì)膜完整性和頂體完整性造成不利影響。解凍后精子體外存活時間也顯示，咖啡因平衡2 h組凍后精子存活時間僅有3 d，其顯著低于對照組、平衡1 h和平衡0.5 h組（P＜0.05），后3組凍后精子存活時間都在6 d以上，其中平衡1 h組凍后精子存活時間達(dá)到7 d以上。此結(jié)果與咖啡因平衡2 h組中精子在冷凍之前超活化時間長[18]、消耗能量多[12]以及精子中產(chǎn)生的活性氧多[14]等，都有緊密聯(lián)系。

5 結(jié)論

豬精子在4 ℃平衡過程中，相對于咖啡因與精液共孵育2 h和0.5 h而言，共孵育時間為1 h對解凍后精子質(zhì)量最有利，該組中解凍后精子活率和活力顯著高于對照組和平衡2 h和0.5 h組，而且該組中凍后精子體外存活時間長達(dá)7 d以上。