水稻葉片質(zhì)膜的純化及質(zhì)膜蛋白質(zhì)雙向電泳分析

何 磊，聶燕芳，高元媛，曹 燕，李云鋒，王振中

(1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，教育部生物防治工程研究中心，廣東廣州 510642;2 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)圖書(shū)館，廣東廣州 510642）

細(xì)胞質(zhì)膜(Plasma membrane，PM)作為植物細(xì)胞與外界的屏障，在細(xì)胞壁的合成、離子轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程等方面起著重要的作用［1］.同時(shí)，植物細(xì)胞質(zhì)膜上存在著識(shí)別病原菌及感受環(huán)境刺激等的大多數(shù)受體及早期反應(yīng)蛋白［2－3］，因此植物質(zhì)膜蛋白質(zhì)的研究已受到了廣泛的關(guān)注［2－4］.但由于質(zhì)膜與其他細(xì)胞器有相近的組成，且膜結(jié)構(gòu)復(fù)雜，給質(zhì)膜蛋白質(zhì)的研究帶來(lái)了困難［5］.近年來(lái)，植物亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，為從整體水平深入研究質(zhì)膜蛋白質(zhì)提供了新的思路和技術(shù)平臺(tái).

開(kāi)展植物質(zhì)膜蛋白質(zhì)組研究的前提是必需獲得高純度的質(zhì)膜.由于研究目的和研究材料等的差異，在植物細(xì)胞質(zhì)膜的純化策略上需針對(duì)特定的植物材料及研究目的而進(jìn)行條件的摸索.目前常用的植物質(zhì)膜純化方法主要有離心法、兩相分配法、陽(yáng)離子硅膠法和親和純化法等［6］.在適合于水稻質(zhì)膜蛋白質(zhì)組研究的質(zhì)膜純化方法中，大多采用了兩相分配法，并在水稻懸浮細(xì)胞及根系的質(zhì)膜純化方面建立了良好的試驗(yàn)體系［7－10］.

以雙向電泳(Two－dimensional electrophoresis，2－DE)技術(shù)為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略具有分辨率高和重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，仍是植物質(zhì)膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最常采用的方法之一［11］.但由于質(zhì)膜蛋白質(zhì)具有疏水性強(qiáng)及豐度較低等特點(diǎn)，因此建立適合于雙向電泳的質(zhì)膜蛋白質(zhì)組分析方法是非常重要的.本研究對(duì)適合于水稻葉片質(zhì)膜純化的雙水相分配法的條件進(jìn)行了摸索，并分析了質(zhì)膜蛋白質(zhì)的雙向電泳，以期為進(jìn)一步的水稻葉片質(zhì)膜蛋白質(zhì)組研究奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

供試水稻為秈稻品系C101LAC和CO39，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理生理學(xué)研究室保存.水稻播種在盛有稻田土的塑料盆中，在24～26℃、每天14 h光照(約 250 μmol·m－2·s－1)的生長(zhǎng)室中生長(zhǎng).按常規(guī)方法管理，于第4片葉完全展開(kāi)時(shí)采樣，取第3和第4片葉.

Beckman超速離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司;IPGphor電泳單元、灌膠模具、垂直電泳單元、EPS 301電源購(gòu)自 Amersham Pharmacia Biotech公司.

1，3－二［三(羥甲基)甲氨基］丙烷(BTP)、2－嗎啉乙磺酸(MES)、聚乙二醇(PEG 3350)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP k 30)、聚氧乙烯醚(Brij 58)、蔗糖和尿素購(gòu)自Sigma公司;苯甲基磺酰氟(PMSF)、二硫蘇糖醇(DTT)和碘乙酰胺購(gòu)自Promega公司;硫脲、18 cm(pH 4～7)線(xiàn)性IPG預(yù)制膠條和IPG緩沖液(pH4～7)購(gòu)自Amersham Pharmacia Biotech公司;聚丙烯酰胺凝膠儲(chǔ)液、低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液購(gòu)自Bio－Rad公司;葡聚糖(Dextran T 500)購(gòu)自Pharmacosmos公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

1.2 水稻葉片質(zhì)膜的分離及純化

1.2.1 粗質(zhì)膜的制備 粗質(zhì)膜的制備參考Whiteman 等［8］和 Chen 等［9］方法，略作修改.將 20 g 水稻葉片液氮研磨至粉末，加入預(yù)冷的70 mL提取緩沖液(含250 mmol/L蔗糖，2 mmol/L EDTA，φ為10%甘油，5 g/L BSA，2 mmol/L DTT，1 mmol/L PMSF，15 mmol/L β － 巰基乙醇，6 g/L PVP k30，50 mmol/L BTP－MES，pH 7.8)，研磨至勻漿，用 260 μm 孔徑的濾網(wǎng)過(guò)濾，濾液于12100 r/min離心20 min，取上清液;將上清液于33000 r/min離心40 min，再將沉淀懸浮于6 mL相緩沖液(250 mmol/L蔗糖，3 mmol/L KCl，5 mmol/L KH2PO4，1 mmol/L DTT，pH 7.8)中，所獲樣品即為粗質(zhì)膜.以上操作均在4℃進(jìn)行.

1.2.2 質(zhì)膜的純化 質(zhì)膜的純化參考Hodges等［12］和Cheng等［13］方法，略作修改.將上述6 mL的粗質(zhì)膜溶液加入到26 g雙水相體系中(聚合物Dextran T 500/PEG 3350質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 6.1%、6.2%、6.3%、6.4%和6.5%，250 mmol/L蔗糖，3 mmol/L KCl，5 mmol/L KH2PO4，pH 7.8)混勻，于1100 r/min離心5 min使其分相，取上相，重復(fù)3次(每次所獲上相分別標(biāo)記為U1、U2、U3).U3組分用10倍體積的相緩沖液稀釋?zhuān)?9200 r/min離心1 h，取沉淀;將沉淀懸浮于4 mL質(zhì)膜保存液(250 mmol/L蔗糖，2 mmol/L KCl，1 mmol/L DTT，5 mmol/L BTP－MES，pH 7.8)，于39200 r/min離心1 h(2次)，再將沉淀懸浮于300 μL質(zhì)膜保存液，所獲樣品即為富含質(zhì)膜的組分.以上操作均在4℃進(jìn)行.

1.3 質(zhì)膜純度鑒定

1.3.1 質(zhì)膜標(biāo)志性酶H+－ATPase的活性測(cè)定 參照王寧等［14］方法.反應(yīng)體系為 0.5 mL BTP－MES 緩沖液［含30 mmol/L BTP－MES(pH 6.5)，5 mmol/L MgSO4，50 mmol/L KCl，0.2 g/L Brij 58，5 mmol/L Na2－ATP］.加入 5 μg 質(zhì)膜蛋白質(zhì)啟動(dòng)反應(yīng)，30 ℃ 保溫30 min，加入2.5 mL終止劑［含0.5 mmol/L PVP k30，86 mmol/L(NH2OH)2· H2SO4，5.3 mmol/L EDTA－Na2，φ(H2SO4)=0.2%，13 g/L(NH4)2MoO4］終止反應(yīng)，再迅速加入0.25 mL顯色液(50 mmol/L Na2CO3，6.47 mol/L NaOH) 反 應(yīng) 30 min，測(cè) 定D720nm;以加入煮沸30 min的質(zhì)膜蛋白質(zhì)作為空白對(duì)照.活性抑制率測(cè)定是在上述反應(yīng)體系中分別加入0.5 mmol/L Na3VO4、50 mmol/L KNO3、1 mmol/L NaN3和1 mmol/L Na2MoO4后，測(cè)定 D720nm，再分別計(jì)算不同抑制劑所抑制的H+－ATPase活性在總活性中所占的比例.以酶反應(yīng)液中有無(wú)去垢劑Brij 58時(shí)，質(zhì)膜H+－ATPase活性抑制率的變化來(lái)檢測(cè)質(zhì)膜的方向性.

1.3.2 質(zhì)膜的電鏡觀察 參考Roland等［15］方法，并稍作修改.將粗質(zhì)膜與純化的質(zhì)膜溶液于12100 r/min離心1.5 h后，取沉淀;將沉淀分別于 φ為2.5%戊二醛中固定8 h、0.1 g/L四氧化鋨中固定2 h、酒精脫水、用環(huán)氧丙烷和Epon 812完全滲透，再分別于45℃聚合24 h、60℃聚合24 h，用超薄切片機(jī)切片，鎳網(wǎng)收集，再進(jìn)行檸檬酸鉛－醋酸鈾雙染色，用FEI型透射電鏡(荷蘭Tecnai 12)進(jìn)行觀察.

1.4 電泳樣品制備

參考Cheng等［13］方法，略作修改.將質(zhì)膜樣品用4 mL 洗滌液［含 10 mmol/L Tris－HCl(pH 7.8)，5 mmol/L KCl］于33000 r/min離心1 h(2次).將沉淀用增溶緩沖液(含7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，φ為0.5%IPG Buffer(pH 4 ～7)，20 mmol/L DTT，40 g/L CHAPS，10 g/L ASB－14)溶解，于 9680 r/min 離心5 min，取上清液.

1.5 SDS-PAGE

取質(zhì)膜蛋白質(zhì)樣品(20 μg)進(jìn)行電泳，分離膠質(zhì)量濃度為120 g/L，濃縮膠質(zhì)量濃度為50 g/L.采用膠體考染法對(duì)凝膠進(jìn)行染色［16］，用 UMAX 2100XL光密度掃描儀對(duì)凝膠進(jìn)行掃描，并用Quantity One 4.6.3一維分析軟件(Bio－Rad)對(duì) SDS－PAGE 圖譜進(jìn)行分析.

1.6 雙向電泳

取質(zhì)膜蛋白質(zhì)樣品(200 μg)于350 μL增溶緩沖液中水化16 h后，進(jìn)行第一向固相梯度等電聚焦電泳(Isoelectric focusing，IEF)，IEF聚焦參數(shù)為:300 V慢速升壓0.5 h;500 V慢速升壓0.5 h;1000 V慢速升壓0.5 h;5000 V快速升壓1.5 h;8000 V快速升壓聚焦60000 Vh，水化和聚焦溫度為20℃.等電聚焦結(jié)束后取出膠條，在平衡液Ⅰ［含50 mmol/L Tris－HCl(pH 8.8)，6 mol/L 尿素，φ =30% 甘油，20 g/L SDS，20 g/L DTT］中振蕩平衡15 min，再于平衡液Ⅱ［含 50 mmol/L Tris－HCl(pH 8.8)，6 mol/L 尿素，φ=30%甘油，20 g/L SDS，25 g/L碘乙酰胺］中平衡15 min.第二向SDS－PAGE質(zhì)量濃度為120 g/L，電泳參數(shù)為16 mA.采用質(zhì)譜兼容的銀染法對(duì)凝膠染色［18］，用UMAX 2100XL光密度掃描儀掃描凝膠，并用 PDQuest 8.0 圖像分析軟件(Bio－Rad)對(duì) 2－DE圖譜進(jìn)行分析.試驗(yàn)以3次分別提取的質(zhì)膜蛋白質(zhì)樣品作為重復(fù).

1.7 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

蛋白質(zhì)含量測(cè)定按照 Bradford等［19］方法，以BSA為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì).

2 結(jié)果與分析

2.1 雙水相體系中不同聚合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)質(zhì)膜純化效果的影響

采用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PEG 3350/Dextran T 500雙水相分配體系對(duì)水稻葉片質(zhì)膜進(jìn)行了純化.結(jié)果表明:雙水相分配體系中聚合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)不同，細(xì)胞質(zhì)膜在上相中的分配情況有明顯差異.圖1的結(jié)果表明，隨聚合物濃度升高，上相中的質(zhì)膜蛋白質(zhì)產(chǎn)率明顯下降.圖2的結(jié)果表明，聚合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)不同，不同內(nèi)膜標(biāo)志酶H+－ATPase對(duì)特異性抑制劑的敏感性存在明顯的差異.H+－ATPase對(duì)釩酸鹽敏感性先升后降，在 PEG 3350/Dextran T 500質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.3%時(shí)H+－ATPase相對(duì)活性最高(93.5%)，而各種內(nèi)膜(V型和F型)的H+－ATPase相對(duì)活性分別為9.4%和7.6%，非特異性磷酸酶相對(duì)活性為5.6%.綜合比較質(zhì)膜產(chǎn)率和純度，選用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.3%的PEG 3350/Dextran T 500聚合物組成的雙水相體系可以獲得高純度的質(zhì)膜及較高的蛋白質(zhì)產(chǎn)率，適合于水稻葉片細(xì)胞質(zhì)膜的純化.

圖1 聚合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)水稻葉片質(zhì)膜蛋白質(zhì)產(chǎn)率的影響Fig.1 Effect of polymer concentration on the productivity of rice PM proteins isolated by two aqueous phase partitioning

圖2 聚合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)水稻葉片質(zhì)膜H+－ATPase相對(duì)活性的影響Fig.2 Effect of polymer concentration on relative activities of H+－ATPase in rice leaves PM isolated by two aqueous phase partitioning

2.2 質(zhì)膜純度鑒定

2.2.1 粗質(zhì)膜經(jīng)3次雙水相體系分配后的各組分標(biāo)志酶活性的測(cè)定 采用w為6.3%的PEG 3350/Dextran T 500雙水相體系對(duì)水稻葉片來(lái)源的粗質(zhì)膜進(jìn)行了純化.粗質(zhì)膜及3次分配所獲上相(U1、U2和U3)的質(zhì)膜標(biāo)志酶(H+－ATPase)對(duì)特異性抑制劑的敏感性測(cè)定結(jié)果如表1.表1的結(jié)果表明，粗質(zhì)膜經(jīng)3次分配后，H+－ATPase對(duì)釩酸鹽的敏感性從45.2%升高到93.5%，表明隨分配次數(shù)的增加，質(zhì)膜的純度越高;V型(液泡膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、高爾基體膜等)H+－ATPase對(duì)KNO3的敏感性從65.3%下降至9.4%;F型(線(xiàn)粒體和葉綠體)H+－ATPase對(duì)NaN3的敏感性從73.6%下降至7.6%;非特異性磷酸酶(溶酶體)對(duì)Na2MoO4的敏感性從40.8%下降至5.6%，說(shuō)明質(zhì)膜組分的雜質(zhì)(其他內(nèi)膜組分)隨分配次數(shù)的增加而減少.上述結(jié)果表明，w為6.3%的 PEG 3350/Dextran T 500雙水相體系對(duì)粗質(zhì)膜進(jìn)行3次分配后，可以有效減少V型和F型等其他內(nèi)膜雜質(zhì)，獲得高純度的質(zhì)膜.

表1 粗質(zhì)膜和質(zhì)膜囊泡H+-ATPase的相對(duì)活性1)Tab.1 Relative activities of H+-ATPase on crude PM and PM vesicles isolated by two aqueous phase partitioning from rice leaves %

2.2.2 質(zhì)膜電鏡觀察 由于檸檬酸鉛－醋酸鈾雙染色能使所有的質(zhì)膜囊泡淺著色，因此可通過(guò)質(zhì)膜組分的復(fù)雜程度來(lái)判斷質(zhì)膜的純度［13］.采用檸檬酸鉛－醋酸鈾雙染色，對(duì)水稻葉片粗質(zhì)膜和純化后的質(zhì)膜進(jìn)行了電鏡觀察.結(jié)果(圖3)表明，粗質(zhì)膜組分比較復(fù)雜，而純化后的質(zhì)膜比較均一;表明粗質(zhì)膜經(jīng)過(guò)雙水相體系的3次分配后獲得了高純度的質(zhì)膜.

圖3 水稻葉片粗質(zhì)膜和純化質(zhì)膜經(jīng)檸檬酸鉛和醋酸鈾雙染色后的電鏡圖譜Fig.3 Electron micrographs of rice leaves crude PM and purified PM from rice leaves with uranyl actate－lead citrate staining

2.3 雙水相分配法對(duì)質(zhì)膜蛋白質(zhì)產(chǎn)率的影響

采用w為6.3%的PEG 3350/Dextran T 500雙水相體系對(duì)水稻葉片質(zhì)膜進(jìn)行純化后，對(duì)粗質(zhì)膜及雙水相體系3次分配所獲得的上相(U1、U2和U3)的質(zhì)膜蛋白質(zhì)產(chǎn)率進(jìn)行了測(cè)定.結(jié)果表明，100 mg粗質(zhì)膜蛋白質(zhì)經(jīng)3次分配，U1、U2和U3組分的蛋白質(zhì)產(chǎn)率分別為11.37、6.46和2.73 mg;即粗質(zhì)膜經(jīng)過(guò)3次雙水相分配后的蛋白質(zhì)產(chǎn)率為2.73%.

2.4 水稻葉片質(zhì)膜的定向

對(duì)酶反應(yīng)體系中有無(wú)去污劑(Brij 58)時(shí)質(zhì)膜H+－ATPase的活性變化進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明在有非離子型去垢劑Brij 58(ρ=0.2 g/L)條件下，H+－ATPase的活力比無(wú)Brij 58條件下的提高了60%，表明經(jīng)雙水相分配法提取的水稻葉片細(xì)胞質(zhì)膜微囊封閉性較好，主要為正向型質(zhì)膜微囊.

2.5 水稻葉片質(zhì)膜蛋白質(zhì)的SDS-PAGE

將水稻葉片粗質(zhì)膜及純化后的質(zhì)膜進(jìn)行SDSPAGE，考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果如圖4.用Quantity One 4.6.3軟件對(duì)其進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)粗質(zhì)膜有21個(gè)蛋白質(zhì)條帶，純化后的質(zhì)膜則有23個(gè)蛋白質(zhì)條帶，相對(duì)分子質(zhì)量主要分布于12000～80000之間.該結(jié)果表明，與粗質(zhì)膜相比，純化質(zhì)膜中的一些特定蛋白質(zhì)條帶消失或者豐度減少，可能與粗質(zhì)膜中的雜蛋白得到了去除有關(guān);同時(shí)，由于減少了雜蛋白，粗質(zhì)膜和純化質(zhì)膜在同等上樣量的條件下，使質(zhì)膜中其他蛋白質(zhì)的豐度得到了有效增加(或新出現(xiàn))，使蛋白質(zhì)條帶的分布更為均勻，有利于基于SDS－PAGE/質(zhì)譜技術(shù)為基礎(chǔ)的質(zhì)膜蛋白質(zhì)組分析.

圖4 水稻葉片粗質(zhì)膜和純化質(zhì)膜的SDS－PAGE圖譜Fig.4 SDS－PAGE image of crude and purified PM proteins isolated from rice leaves

2.6 水稻葉片純化質(zhì)膜蛋白質(zhì)的雙向電泳

為了進(jìn)一步檢測(cè)所純化的水稻葉片質(zhì)膜是否合適于雙向電泳，本試驗(yàn)采用對(duì)疏水性蛋白質(zhì)具有高溶解性的增溶緩沖液對(duì)質(zhì)膜蛋白質(zhì)進(jìn)行了溶解.經(jīng)2－DE、質(zhì)譜兼容的銀染法染色、圖像掃描，獲得了水稻第4葉片質(zhì)膜蛋白質(zhì)的2－DE圖譜(圖5).PDQuest 8.0軟件分析結(jié)果表明，2－DE圖譜中共有(579±17)個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，且具有良好的重復(fù)性;同時(shí)2－DE圖譜背景清晰，蛋白質(zhì)點(diǎn)分布均勻，沒(méi)有明顯的縱向拖尾和水平橫紋現(xiàn)象.

圖5 水稻葉片質(zhì)膜蛋白質(zhì)的雙向電泳圖譜Fig.5 Representative 2－DE patterns of PM proteins from rice leaves

3 討論

PEG/Dextran雙水相分配法是目前純化植物細(xì)胞質(zhì)膜最常用的方法之一，其原理主要是根據(jù)不同的膜微囊在兩相中的分配系數(shù)不同而達(dá)到分離的目的，其中質(zhì)膜傾向于分配PEG上相部分，而其他內(nèi)膜傾向于分配Dextran下相部分［20］.研究表明，由于所分析植物樣品的來(lái)源和研究目的不同，其細(xì)胞質(zhì)膜的特性也不同;因此在利用雙水相分配法制備細(xì)胞質(zhì)膜時(shí)，需針對(duì)特定的植物材料而進(jìn)行條件優(yōu)化.其中，聚合物濃度和鹽濃度是最主要的影響因素，一般由高濃度的聚合物和較低鹽濃度組成的雙水相體系可以獲得較好的植物細(xì)胞質(zhì)膜的純化效果［21－23］.本研究在低鹽濃度(3 mmol/L KCL)下結(jié)合離心法，對(duì)不同濃度的PEG 3350/Dextran T 500雙水相體系分離純化水稻葉片質(zhì)膜的效果進(jìn)行了探索，結(jié)果表明:聚合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.3%的雙水相體系具有最好的純化效果;相對(duì)于傳統(tǒng)的蔗糖密度梯度離心方法(質(zhì)膜純度一般為60% ～70%)，該方法所獲的質(zhì)膜純度更高(達(dá)90%以上).

由于細(xì)胞質(zhì)膜與其他內(nèi)膜系統(tǒng)(如液泡膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和高爾基體膜等)在結(jié)構(gòu)和功能上都聯(lián)系緊密，加上其密度相近，且容易發(fā)生粘連，因此純化的細(xì)胞質(zhì)膜很容易受到這些內(nèi)膜的污染.一般細(xì)胞質(zhì)膜的純度評(píng)價(jià)可以從形態(tài)學(xué)觀察、特異性酶的活性測(cè)定和特異抗體檢測(cè)等方面進(jìn)行，且一般采用2種或以上的方法同時(shí)檢測(cè)［24－25］.H+－ATPase 是細(xì)胞質(zhì)膜及其他內(nèi)膜系統(tǒng)的特異性標(biāo)志酶，可分為P型、V型和F 型三大類(lèi)［6］.根據(jù)各細(xì)胞器 H+－ATPase 的活性測(cè)定結(jié)果就可以計(jì)算出提取的細(xì)胞器相對(duì)于勻漿液的富集度和其他細(xì)胞器的污染程度.本試驗(yàn)結(jié)果表明:純化質(zhì)膜的H+－ATPase對(duì)Na3VO4敏感性很高，而對(duì)KNO3、NaN3和Na2MoO4的敏感性很低，說(shuō)明該組分中的內(nèi)膜污染少.同時(shí)，本試驗(yàn)還結(jié)合檸檬酸鉛－醋酸鈾雙染色法，對(duì)質(zhì)膜進(jìn)行了電鏡觀察，結(jié)果表明:純化后的質(zhì)膜微囊大小較均勻，邊緣完整清晰，表明質(zhì)膜獲得了較好的純化.

一般認(rèn)為質(zhì)膜囊泡以2種類(lèi)型存在，即正向型和外向型;正向型是指質(zhì)膜微囊的朝外側(cè)是原質(zhì)膜的胞質(zhì)外側(cè)，外向型是指質(zhì)膜微囊的內(nèi)側(cè)、外側(cè)分別是原質(zhì)膜的外側(cè)和內(nèi)側(cè).而酶分子在膜上的定向可受其分離方法或介質(zhì)的影響，因此確定酶在質(zhì)膜上的方向性是必需的［26］.通常采用在有無(wú)去垢劑條件下，根據(jù)H+－ATPase活性變化來(lái)分析質(zhì)膜的封閉性和方向性.本試驗(yàn)結(jié)果表明，在有Brij 58存在時(shí)，比無(wú)Brij 58條件下的H+－ATPase活力提高了60%，這說(shuō)明分離純化的質(zhì)膜囊泡的封閉性較好，基本上為正向封閉囊泡.

雙向電泳(2－DE)技術(shù)是經(jīng)典蛋白質(zhì)組學(xué)的核心技術(shù)，相比其他方法，具有較高的分辨率和良好的重復(fù)性;但由于質(zhì)膜蛋白質(zhì)疏水性較強(qiáng)，傳統(tǒng)的尿素－去垢劑混合物對(duì)于質(zhì)膜蛋白質(zhì)的溶解效果不理想，因此基于2－DE技術(shù)為基礎(chǔ)的質(zhì)膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究面臨較大的困難.隨著新的非離子去污劑和兩性去污劑的使用，目前這一問(wèn)題也已逐步得到了解決［26－27］.研究表明，新的非離子去污劑和兩性去污劑能較好地溶解質(zhì)膜蛋白質(zhì)［28］.Santoni等［29］利用兩性離子去垢劑ASB－14對(duì)模式植物擬南芥的質(zhì)膜蛋白進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)ASB－14能夠使更多疏水性的膜蛋白溶解，并能在2－DE圖譜上清晰顯示.Twine等［30］采用ASB－14和CHAPS對(duì)土拉弗菌Francisella tularensis的質(zhì)膜蛋白質(zhì)進(jìn)行了有效的分離.本試驗(yàn)采用了兩性離子去垢劑(ASB－14和CHAPS)對(duì)水稻葉片的質(zhì)膜蛋白質(zhì)進(jìn)行溶解，在2－DE膠上獲得了較多的質(zhì)膜蛋白質(zhì)點(diǎn)［共有(579±17)個(gè)］，且在2個(gè)水稻品系中均有良好的重復(fù)性.

亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的分離和純化是對(duì)全細(xì)胞蛋白質(zhì)分離方法的補(bǔ)充，這種策略的優(yōu)點(diǎn)在于減少了全細(xì)胞的復(fù)雜性，而保留了細(xì)胞生物學(xué)的功能結(jié)構(gòu).目前在蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)尚待完善的情況下，其研究的初始樣本越簡(jiǎn)單，研究結(jié)果則越細(xì)致.本試驗(yàn)采用雙水相分配法對(duì)水稻葉片質(zhì)膜進(jìn)行了純化，一方面降低了樣品的復(fù)雜度(減少了其他內(nèi)膜蛋白質(zhì)的污染)，使分析簡(jiǎn)單化;另一方面可以富集相應(yīng)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的低豐度蛋白質(zhì)，對(duì)于水稻質(zhì)膜蛋白質(zhì)組的研究將奠定良好的基礎(chǔ).

［1］MARMAGNE A，ROUET M A，F(xiàn)ERRO M，et al.Identification of new intrinsic proteins in Arabidopsis plasma membrane proteome［J］.Mol Cell Proteomics，2004，3:675－691.

［2］ALEXANDERSSON E，SAALBACH G，LARSSON C，et al.Arabidopsis plasma membrane proteomics identifies components of transport，signal transduction and membrane trafficking［J］.Plant Cell Physiology，2004，45:1543－1556.

［3］HüCKELHOVEN R.Transport and secretion in plantmicrobe interactions［J］.Current Opinion in Plant Biology，2007，10:573－579.

［4］HOEFLE C，HüCKELHOVEN R.Enemy at the gates:traffic at the plant cell［J］.Cellular Microbiology，2008，10(12):2400－2407.

［5］SPRENGER R R，SPEIJER D，BACK J W，et al.Comparative proteomics of human endothelial cell caveolae and rafts using two－dimensional gel electrophoresis and mass pectrometry［J］.Electrophoresis，2004，25(1):156－172.

［6］張玲，劉錄群，黃有國(guó).胡楊質(zhì)膜的純化及其H+－ATPase活性的研究［J］.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2000，27(6):637－640.

［7］齊耀程，王寧，程彥偉，等.水稻根尖質(zhì)膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法的建立［J］.中國(guó)水稻科學(xué)，2008，22(2):11－17.

［8］WHITEMAN S A，NüHSE T S，ASHFORD D A，et al.A proteomic and phosphproteomic analysis of Oryza sativa plasma membrane and vacuolar membrane［J］.The Plant Journal，2008，56:146－156.

［9］CHEN Fang，YUAN Yue－xing，LI Qun，et al.Proteomic analysis of rice plasma membrane reveals proteins involved in early defense response to bacterial blight［J］.Proteomics，2007，7:1529－1539.

［10］MALAKSHAH S N，REZAEI N H，HEIDARI M，et al.Proteomics reveals new salt responsive proteins associated with rice plasma membrane［J］.Biosci Biotechnol Biochem，2007，71(9):2144－2154.

［11］KOMASTU S.Plasma membrane proteome in Arabidopsis and rice［J］.Proteomics，2008，8:4137－4145.

［12］HODGES T K，MILLS D.Isolation of the plasma membrane［J］.Methods in Enzymology，1986，118:41－54.

［13］CHENG Yan－wei，QI Yao－cheng，ZHU Qian，et al.New changes in the plasma－membrane－associated proteome of rice roots under salt stress［J］.Proteomics，2009，9:3100－3114.

［14］王寧，齊耀成，徐朗萊，等.水稻根質(zhì)膜蛋白質(zhì)雙向電泳水化液的優(yōu)化［J］.西北植物學(xué)報(bào)，2007，27(12):2371－2378.

［15］ROLAND J C，LEMBI C A，MORRE D J.Phosophotungtic acid－chromic acid as a selective electron－dense stain for plasma membranes of plant cells［J］.Stain Technol，1972，47:195－200.

［16］NEUHOFF V，STAMM R，EIBL H.Clear background and highly sensitive protein staining with coomassie blue dyes in polyacrylamide gels:A systematic analysis［J］.E－lectrophoresis，1985，6(9):427－448.

［17］YAN J X，WAIT R，BERKELMAN T，et al.A modified silver staining protocol for visualization of proteins compatible with matrix－assisted laser desorption/ionization and electrospray ionization mass spectrometry［J］.Electrophoresis，2000，21(17):3666－3672.

［18］BRADFORD M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein－dye binding［J］.Analytical Biochemistry，1976，72:248－254.

［19］WIDELL S，LARSSON C.Separation of presumptive plasma membranes from mitochondria by partition in an aqueous polymer two－phase system ［J］.Plant Physiology，1981，51:368－374.

［20］LARSSON C，WIDELL S，KJELLBOM P.Preparation of high－purity plasma membranes［J］.Methods in Enzymology，1987，148:558－568.

［21］王細(xì)娥，張麗軍，謝錦云，等.蛋白質(zhì)組研究中細(xì)胞質(zhì)膜的純化和純度鑒定研究進(jìn)展［J］.生命科學(xué)研究，2006，10(2):15－20.

［22］胡章立，荊家海.兩相法分離玉米幼苗葉片生長(zhǎng)部位質(zhì)膜［J］. 西北植物學(xué)報(bào)，1998，18(1):83－89.

［23］TANAKA N，F(xiàn)UJITA M，HANDA H，et al.Proteomics of the rice cell:Systematic identification of the protein populations in subcellular compartments［J］.Mol Genet Genomics，2004，271:566－576.

［24］VERONIQUE S，JOELLE V，DELPHINE P，et al.A proteomic study reveals novel insights into the diversity of aquaporin forms expressed in the plasma membrane of plant roots［J］.Biochem J，2003，373:289－296.

［25］邱全勝，蘇雪峰.小麥根質(zhì)膜H+－ATPase的部分純化［J］. 植物學(xué)報(bào)，1999，41(6):629－632.

［26］BRAUN R J，KINKL N，BEER M.Two－dimensional electrophoresis of membrane proteins［J］.Anal Bioanal Chem，2007，389:1033－1045.

［27］LUCHE S，SANTONI V，RABILLOUD T.Evaluation of nonionic and zwitterionic detergents as membrane protein solubilizers in two dimensional electrophoresis［J］.Proteomics，2003，3:249－253.

［28］MARMAGNE A，SALVI D，ROLLAND N，et al.Purification and fractionation of membranes for proteomic analyses［J］.Methods Mol Biol，2006，323:403－420.

［29］SANTONI V，KIEFFER S，DESCLAUX D，et al.Membrane proteomics:Use of additive main effects with multiplicative interaction model to classify plasma membrane proteins according to their solubility and electrophoretic properties［J］.Electrophoresis，2000，21(16):3329－3344.

［30］TWINE S M，MYKYTCZUK N C S，PETIT M，et al.Francisella tularensis proteome:Low levels of ASB－14 facilitate the visualization of membrane proteins in total protein extracts［J］.Proteome Res，2005，4(5):1848－1854.