小鼠精原干細(xì)胞分離培養(yǎng)條件的優(yōu)化

張秀娟，李 莉，衛(wèi)恒習(xí)，白銀山，師如意，張守全

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510642）

在哺乳動(dòng)物睪丸內(nèi)，精子發(fā)生是一個(gè)受高度調(diào)控和持續(xù)的過程:精原干細(xì)胞(Spermatogonial stem cells，SSCs)一方面進(jìn)行自我更新維持干細(xì)胞數(shù)量，另一方面又不斷執(zhí)行分化生成各級(jí)生精細(xì)胞直至最后生成精子［1-2］.SSCs定居在曲精細(xì)管上皮的基膜處，是哺乳動(dòng)物精子發(fā)生的最原始細(xì)胞，也是動(dòng)物體內(nèi)唯一能將遺傳信息傳遞的干細(xì)胞［3］.精原干細(xì)胞體外培養(yǎng)體系的建立，在SSCs生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、畜牧業(yè)生產(chǎn)及制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，然而SSCs在成年哺乳動(dòng)物睪丸中的數(shù)量非常低，據(jù)報(bào)道1只成年公鼠睪丸內(nèi)只有約2×104～3×104個(gè)被稱為 Asingle(As)的精原細(xì)胞［4-5］，因此建立SSCs的體外培養(yǎng)體系是開展其各方面研究的重中之重.研究表明，不但在不同物種間SSCs體外培養(yǎng)特性存在共性和差異，即使相同物種而遺傳背景不同SSCs體外培養(yǎng)也有差異，如同一培養(yǎng)條件對(duì)不同品系來源SSCs體外增殖的影響有很大差異［6］，建立的培養(yǎng)體系能支持 ICR或 C57BL/6×DBA/2 F1(BDF1)遺傳背景的小鼠SSCs的體外增殖，但不支持C57BL/6和129/Sv遺傳背景的小鼠SSCs.甚至小鼠不同品系 SSCs培養(yǎng)對(duì)生長因子的需求都不同［7］，DBA/2小鼠的 SSCs在體外培養(yǎng)時(shí)，僅添加膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)就能維持其長期增殖，而其他品系小鼠SSCs在體外的長期自我復(fù)制還需要其他生長因子.這些體外培養(yǎng)研究提示著遺傳背景是影響SSCs增殖的重要因素之一，最新研究表明小鼠的遺傳背景也會(huì)參與調(diào)控體內(nèi)SSCs的自我更新［8］，將不同供體小鼠的SSCs移植到經(jīng)白消安處理的受體曲精細(xì)管內(nèi)，發(fā)現(xiàn)其中DBA/2遺傳背景與C57BL/6遺傳背景相比，其SSCs在受體睪丸內(nèi)增殖較快且數(shù)量較多.因MTT法可同時(shí)反映細(xì)胞數(shù)量和活力，近年來被廣泛地應(yīng)用在細(xì)胞增殖的檢測(cè)中［9-10］.昆明小鼠因遺傳多樣性、繁殖性能快等優(yōu)點(diǎn)，目前是生命科學(xué)研究領(lǐng)域的重要模式動(dòng)物之一，尤其在生殖與發(fā)育生物學(xué)方面，然而昆明小鼠SSCs增殖的體外培養(yǎng)體系對(duì)生長因子的需求還不完全清晰，因此本研究分離培養(yǎng)了昆明小鼠SSCs，采用MTT法檢測(cè)其不同生長因子及其添加濃度對(duì)SSCs體外增殖的影響，從而建立一種簡單有效的增殖SSCs培養(yǎng)體系.

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象與主要試劑

5～7 d的雄性昆明小鼠，購于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心.Ⅳ型膠原酶、DNA酶Ⅰ和0.25%胰酶 －EDTA為Sigma公司產(chǎn)品，DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(FCS)等為Gibco公司產(chǎn)品，Percoll液為Pharmacia公司產(chǎn)品，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)為Amresco公司產(chǎn)品;重組小鼠堿性成纖維生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和重組大鼠 GDNF(rrGDNF)為R＆D公司產(chǎn)品，鼠白血病抑制因子(murine leukemia inhibitory factor，LIF)為Chemicon公司產(chǎn)品.

1.2 SSCs的分離與純化

兩步酶消化法［11］獲得曲精細(xì)管細(xì)胞懸液.先用1 g/LⅣ型膠原酶和20 μg/mL DNAseⅠ聯(lián)合消化，600 r/min離心5 min，收集曲精細(xì)管，再用0.25%胰酶-EDTA 和20 μg/mL DNAaseⅠ消化.用4 g/L臺(tái)盼蘭拒染法檢測(cè)細(xì)胞活率≥90%.

差速貼壁法，將細(xì)胞懸液接種至2 g/L明膠包被的培養(yǎng)瓶，首次差速貼壁時(shí)間為6～8 h，轉(zhuǎn)移到新的2 g/L明膠包被的培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)差貼8～10 h，第3次轉(zhuǎn)移后培養(yǎng)過夜，即獲得純化的SSCs.

Percoll不連續(xù)密度梯度法，按9 g/L無菌生理鹽水∶Percoll原液體積比為1∶9比例配成φ為90%的Percoll母液，梯度設(shè)置見表1.

表1 Percoll不連續(xù)密度梯度的組成Tab.1 Composition of Percoll discontinuous density gradients

1.3 小鼠支持細(xì)胞(MSC)飼養(yǎng)層的準(zhǔn)備

繼續(xù)培養(yǎng)首次差速貼壁后的體細(xì)胞，體外傳代培養(yǎng)至穩(wěn)定，形態(tài)學(xué)觀察約大于95%的細(xì)胞屬支持細(xì)胞，取穩(wěn)定培養(yǎng)的F3～F6，經(jīng)10 μg/mL的絲裂霉素C處理制作飼養(yǎng)層.

1.4 SSCs的純化率鑒定

因SSCs具有堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，AP)活性［7］，而分化的和體細(xì)胞不具有此特性，制作細(xì)胞涂片，做AP活性染色鑒定，每次涂片選取n個(gè)(n≥3)視野，計(jì)算染色細(xì)胞數(shù)目占總細(xì)胞數(shù)目的比率，每種純化方法，重復(fù)3次.

1.5 MTT法檢測(cè)生長因子對(duì)SSCs體外培養(yǎng)增殖的效果

SSCs培養(yǎng)液是 DMEM液，并添加 55 μmol/L 2－巰基乙醇，2 mmol/L L－谷氨酰胺，30 μg/mL丙酮酸鈉，必需氨基酸(φ為1%)，非必需氨基酸(φ為1%)，維生素溶液(φ 為 1%)，φ 為 5%FCS，20 ng/mL bFGF因子，20 ng/mL GDNF因子，103U/mL LIF因子，φ為1%的雙抗.

將純化的SSCs調(diào)整細(xì)胞密度至2×105mL－1，接種至MSC飼養(yǎng)層上，每孔接種200 μL;每個(gè)處理組設(shè)置4個(gè)重復(fù)(分組情況見表2)，對(duì)照組無生長因子添加，分別與體外培養(yǎng)3、5和7 d的同一時(shí)間點(diǎn)，顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況.

1.6 統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)采用EXCEL和SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)分析.

表2 LIF、GDNF、bFGF 3種生長因子不同組合濃度的分組Tab.2 Groups of LIF，GDNF，bFGF factors in different combination concentrations

2 結(jié)果與分析

2.1 5日齡小鼠和7日齡小鼠SSCs的分離效果分析

小鼠出生后睪丸組織細(xì)胞增殖很快，發(fā)現(xiàn)5日齡和7日齡其睪丸組織消化效果有很大差異(表3)，7日齡小鼠在細(xì)胞總數(shù)、多細(xì)胞團(tuán)率以及多次共貼壁率方面都顯著高于5日齡的(P＜0.05)，且7日齡小鼠睪丸細(xì)胞活力較高，但從獲得更多的SSCs來看，2個(gè)日齡無顯著差異(P＞0.05).

表3 兩步酶消化法對(duì)兩組鼠齡睪丸組織分離效果分析1)Tab.3 Isolation result analysis of two groups of pup mouse testes by two-step enzymatic digestion method

2.2 兩種SSCs純化方法效果的比較

從圖1可明顯看出，多次差速貼壁法在純化后細(xì)胞占純化前細(xì)胞總量的回收細(xì)胞比率(20.10%vs.13.94%)和AP 陽性率(85.06%vs.81.82%)都高于Percoll不連續(xù)密度梯度法，盡管兩者無統(tǒng)計(jì)意義上的顯著差異(P＞0.05)，但多次差速貼壁法因操作相對(duì)簡便而被選擇應(yīng)用在后續(xù)的研究中.

圖1 兩種SSCs純化方法的結(jié)果比較Fig.1 Results comparison of two purification methods

2.3 LIF因子對(duì)SSCs的增殖作用

MTT法檢測(cè)結(jié)果表明，LIF的添加組在培養(yǎng)的3和5 d時(shí)，無明顯促進(jìn)，而在培養(yǎng)的7 d后，與對(duì)照組相比有顯著的促增殖作用(P＜0.05，圖2).

2.4 GDNF、bFGF和LIF三因子組合對(duì)SSCs增殖的影響

MTT法檢測(cè)結(jié)果(圖3)及細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果(圖4)表明，GDNF、bFGF和103U/mL LIF 3種因子不同質(zhì)量濃度組與對(duì)照組相比，在培養(yǎng)的3、5和7 d的增殖效應(yīng)都顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，尤其是20 ng/mL bFGF、20 ng/mL GDNF 和 103U/mL LIF組，在培養(yǎng)的7 d后，促增殖效應(yīng)顯著高于其他質(zhì)量濃度添加組(P＜0.05).

圖2 LIF因子添加對(duì)原代小鼠SSCs增殖的影響Fig.2 Effects of LIF factor on primary SSCs proliferation

圖3 MTT法檢測(cè)GDNF、bFGF和LIF組合對(duì)原代小鼠SSCs增殖的影響Fig.3 Effect of three factors of GDNF，bFGF and LIF on primary SSCs proliferation by MTT method

圖4 GDNF、bFGF和LIF組合添加培養(yǎng)原代SSCs的形態(tài)學(xué)觀察Fig.4 Morphology observation of primary SSCs at day 5 in vitro culture with three factors of GDNF，bFGF and LIF

3 討論

小鼠的年齡會(huì)影響睪丸中SSCs的活性，一般采用幼年的動(dòng)物為研究對(duì)象.新生鼠睪丸中SSCs純度高且無分化型精原細(xì)胞，但是細(xì)胞數(shù)量相對(duì)來說很少［5，12］.幼齡小鼠因富含 SSCs［7，13］和較高的細(xì)胞活性［14］而成為理想的試驗(yàn)材料，7日齡的小鼠睪丸細(xì)胞總數(shù)約是5日齡的3～4倍，SSCs的總數(shù)只是略多，卻無統(tǒng)計(jì)意義上的顯著差異，小鼠出生后的幾天內(nèi)，生殖母細(xì)胞繼續(xù)增殖發(fā)育成SSCs，SSCs緩慢增殖維持著干細(xì)胞的數(shù)量和功能.

不連續(xù)密度梯度法和差速貼壁法都是簡單有效的方法，資料報(bào)道，Percoll密度梯度法和BSA梯度法可獲得較為純化的小鼠 SSCs，其純度大約從68.76% ～90%不等［15-16］，本試驗(yàn)Percoll密度梯度法純化5～7 d的昆明小鼠SSCs，在35% ～45%處獲得SSCs，其純度達(dá)到平均81.82%.利用睪丸內(nèi)支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞在體外能較快貼壁生長的特點(diǎn)，多次差速貼壁后獲得平均為85.06%的純化率.同時(shí)，研究表明少量體細(xì)胞作為SSCs生長的微環(huán)境可支持體外短期生長和特性維持［17］.利用多次差速貼壁方法成功獲得遺傳背景分別為DBA/2和ICR的小鼠SSCs體外至少6個(gè)月的長期穩(wěn)定增殖［18-19］.

GDNF促進(jìn)體外培養(yǎng)的SSCs自我更新，主要通過Ras信號(hào)通路最終上調(diào) C-fos的表達(dá)［20］和 Src信號(hào)通路最終上調(diào)N-Myc的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)［21］.GDNF和bFGF 2種因子同時(shí)添加對(duì)多種遺傳背景的小鼠SSCs體外培養(yǎng)增殖具有協(xié)同效應(yīng)［7，22-23］，本試驗(yàn)結(jié)果證明該效果.昆明小鼠SSCs的體外培養(yǎng)bFGF單獨(dú)添加，較對(duì)照組顯著促進(jìn)了SSCs的增殖，形成小克隆簇(結(jié)果未顯示)，同時(shí)bFGF因子是PGCs體外培養(yǎng)的一關(guān)鍵生長因子，兩者是有連續(xù)的，有相似之處.研究表明bFGF通過自分泌方式能夠促使GDNF和GFRα1的生成，從而降低了神經(jīng)細(xì)胞的凋亡［24］，這或許提示著bFGF在SSCs體外自我更新和增殖當(dāng)中，能夠通過這種方式或通過某些信號(hào)通路從而和GDNF有協(xié)同作用.

LIF因子對(duì)SSCs的作用方式和途徑目前尚未完全清楚，盡管LIF因子對(duì)小鼠SSCs的克隆形成和體外增殖無顯著作用［23］，但諸多已建立的小鼠SSCs體外培養(yǎng)體系，培養(yǎng)基含LIF因子或使用分泌LIF因子的 MEF 飼養(yǎng)層等［6，18，22］.目前的研究主要集中在細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、體外培養(yǎng)或移植后克隆形成數(shù)量來評(píng)價(jià)LIF因子的作用，本試驗(yàn)通過MTT法，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的7 d，單因子添加LIF組比對(duì)照組SSCs活細(xì)胞數(shù)量顯著增多，并且LIF因子和GDNF、bFGF具有組合效應(yīng)，對(duì)SSCs的增殖具有促進(jìn)作用，但通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察無明顯區(qū)別，這可能是MTT法對(duì)活細(xì)胞數(shù)量檢測(cè)的客觀精確性，LIF因子對(duì)SSCs體外培養(yǎng)的作用有待進(jìn)一步的揭示.

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