不同試驗條件下豬肉中氣單胞菌生長預測模型的建立和驗證

董慶利，高 翠，丁 甜，余華星

(1 上海理工大學食品科學與工程研究所，上海 200093;2 韓國國立江原大學食品科學與生物技術學科，韓國春川 200701)

氣單胞菌Aeromonas spp.屬于革蘭陰性兼性厭氧短桿菌，在近幾年的研究中被證實是一種人畜共患病的病原菌，有關該菌為胃腸炎和敗血癥的一種重要致病菌的報道日益增多［1－3］，同時該菌也是冷卻豬肉中的優(yōu)勢腐敗菌之一［4］.冷卻肉是指在衛(wèi)生標準條件下，按照國家屠宰規(guī)范對畜禽進行屠宰后24 h內(nèi)將肉冷卻，使得肉的中心溫度降至0～4℃，并在隨后的排酸、分割、剔骨、包裝、運輸以及銷售過程中，肉溫始終保持在0～4℃［5］.冷卻豬肉的優(yōu)勢腐敗菌有假單胞菌Pseudomonas spp.、氣單胞菌、腸桿菌屬Enterobacteriaceae等［6］.在國內(nèi)外對冷卻豬肉中微生物進行的相關研究中多是針對大腸埃希菌Escherichia coli、假單胞菌等病原菌，而針對氣單胞菌的相關研究較少.在對氣單胞菌的研究過程中發(fā)現(xiàn)除溫度外，pH和初始接種量對氣單胞菌的生長也有顯著影響，所以設計試驗研究這3種環(huán)境因子對冷卻豬肉中氣單胞菌生長的影響，以便更好地監(jiān)測其生長，降低病原菌污染食品的風險.本研究將氣單胞菌直接接種到豬肉中，在不同的環(huán)境下進行培養(yǎng)，觀測環(huán)境對其生長的影響規(guī)律，用一級和二級微生物模型對數(shù)據(jù)進行擬合，并通過數(shù)學檢驗和隨機條件模擬，使得到的模型更接近于冷卻豬肉中氣單胞菌實際的生長規(guī)律.

1 材料與方法

1.1 試驗設計

應用 Design－Expert v.7.1.6 軟件(美國 Stat－Ease公司)，參照預試驗結果，對響應曲面的水平值進行中心組合設計(Central Composite Design，CCD)，如表1所示.

表1 中心組合設計的因素和水平1)Tab.1 Factors and levels from central composite design

1.2 材料

五豐上食優(yōu)質(zhì)精腿肉購于上海卜蜂蓮花超市，迅速置于0～4℃冰箱中冷藏備用.

1.3 菌種的選用及活化

氣單胞菌(No.23564)來源于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，于氣單胞菌液體培養(yǎng)基(蛋白胨5 g，酵母提取物3 g，胰蛋白胨10 g，L－鹽酸鳥苷酸 5 g，甘露醇 1 g，肌醇 10 g，Na2S2O3·5H2O 0.4 g，枸櫞酸鐵胺0.5 g，溴甲酚紫0.02 g，瓊脂3 g，溶于1000 mL蒸餾水)中，27℃下活化3次，進而挑取良好的單菌落制得初始菌懸液.培養(yǎng)基的配制參照文獻［7］.

1.4 樣品接種和貯藏

按試驗設計中的20組處理，用5 mol·L－1的HCl和5 mol·L－1的 NaOH 將生理鹽水(8.3 mg·L－1的NaCl溶液)調(diào)到所需pH，121℃滅菌15 min，配制無菌水.稱取25 g肉塊，懸浮于80℃無菌水中10 s進行消毒.將1.3中制得的初始菌懸液用無菌生理鹽水進行梯度稀釋，并根據(jù)預實驗中比濁法標準曲線方程調(diào)整至設計中所需初始接種量，然后將滅菌后肉塊懸浮于其中15 s進行接種.在無菌袋中注入20 mL相應pH的無菌水，將接種后肉塊封裝于上述無菌袋中，按試驗設計分別置于相應溫度下恒溫培養(yǎng).

1.5 微生物計數(shù)

適時取上述肉樣，用滅菌剪刀將肉樣剪碎置于裝有205 mL滅菌生理鹽水的三角瓶中，然后將無菌袋中的液體和殘留菌沖至三角瓶中，充分搖勻，按10倍稀釋法稀釋到所需稀釋度，參照文獻［8］用平板計數(shù)法進行氣單胞菌計數(shù).直至細菌生長達到穩(wěn)定期.其中培養(yǎng)基參照Mccoy等［9］設計的氣單胞菌鑒別培養(yǎng)基.

1.6 生長曲線的擬合和生長參數(shù)的觀測

應用Origin 8.0軟件(美國OriginLab公司)，用修正的Gompertz模型［10］對冷卻豬肉中氣單胞菌的生長曲線進行擬合，計算氣單胞菌生長的最大比生長速率(U/h－1)和遲滯期(LPD/h).具體如下:

1.7 二級生長預測方程(RSM)的建立

應用Design－Expert v.7.1.6軟件建立變量的不同水平與生長參數(shù)之間的多元回歸方程，應用方差分析及F檢驗多元回歸方程及其系數(shù)的顯著性.統(tǒng)計分析得到多元回歸模型如下:

式中，y為LPD或U的響應值，b0(系統(tǒng)中心點)和bj、bjj、bji為不同的常量系數(shù)，xj和 xi為因素溫度(θ)、pH和初始接菌量(N0)(其中 i≠j)，e為模型誤差［12］.

1.8 預測方程的驗證和檢驗

得到多元回歸方程后，在所設試驗條件范圍內(nèi)［溫度20～30℃，pH6.0～7.0，N0為3 lg N～5 lg N，其中N為菌數(shù)/(cfu·g－1)］，設定10組隨機數(shù)據(jù)，按上述方法采用Origin 8.0軟件擬合生長曲線，計算生長參數(shù)U和LPD.

用所建的二級預測方程對用來建模的20組數(shù)據(jù)和用來驗證的10組數(shù)據(jù)分別處理預測生長參數(shù)U和 LPD，用均方誤差(Mean square error，MSE)、偏差因子(Bias factor，BF)和準確因子(Accuracy factor，AF)［13－14］作為衡量模型的標準.公式如下:

式中，Vo為用修正的Gompertz模型擬合生長模型的參數(shù)U或LPD的觀測值;Vp為用建立的RSM方程得出的對U或LPD的預測值，n為測定重復數(shù)［12］.

2 結果與分析

2.1 生長曲線的擬合與生長參數(shù)的觀測

用修正的Gompertz模型擬合豬肉中氣單胞菌的生長曲線，計算生長曲線的參數(shù)U和LPD.結果(表2)表明，修正的Gompertz模型可以較好地模擬不同試驗條件下冷卻豬肉中氣單胞菌的生長情況(R2＞0.96).

2.2 RSM生長預測方程的建立和驗證

本研究中氣單胞菌的生長曲線參數(shù)U和LPD都采用了常用對數(shù)的變化，以達到均一化目的［12］，然后用逐步回歸方法(引入水平為0.05，去除水平為0.10)建立生長曲線參數(shù)U和LPD對因素θ、pH和N0的響應曲面模型如下:

方程(6)說明自變量能夠解釋因變量81.0%的變化，擬合效果較好，對所得RSM模型進行方差分析，模型和各系數(shù)顯著(P＜0.05)，失擬檢驗不顯著(P＞0.05).方程(7)自變量能夠解釋因變量72.2%的變化，因自變量N0的概率P＞0.05，所以只有自變量θ和pH進入最后模型中.建立的RSM模型能較好地模擬因素θ、pH和N0對冷卻豬肉中氣單胞菌的生長曲線參數(shù)U和LPD的影響.初始接菌量(N0)對氣單胞菌的生長率(U)影響顯著.

應用建立的RSM生長預測方程對建模的20組處理和驗證的10組處理分別進行生長參數(shù)U和LPD的觀測和預測(表2和表3).

表2 由Gompertz模型所得出的氣單胞菌在不同試驗條件下的生長參數(shù)1)Tab.2 Growth parameters of Aeromonas spp.obtained from Gompertz model under different experimental conditions

表3 不同試驗條件下用于驗證的氣單胞菌的生長觀測和預測結果1)Tab.3 Observed and predicted U and LPD of Aeromonas spp.by RSM for validation under different combined conditions

2.3 預測方程的數(shù)學檢驗

用來對結果進行驗證的組合的預測值與觀測值的比較如圖1和圖2所示.說明所建預測模型可靠性能夠接受，可以較好地模擬在本試驗條件下冷卻豬肉中氣單胞菌的生長情況.

圖1 應用RSM預測方程對U預測值與觀測值的圖形比較Fig.1 Graphical comparisons between observed and predicted U of Aeromonas spp.by RSM for validation

圖2 應用RSM預測方程對LPD預測值與觀測值的圖形比較Fig.2 Graphical comparisons between observed and predicted LPD of Aeromonas spp.by RSM for validation

用于建模試驗組合的RSM預測方程的數(shù)學固有檢驗和用于驗證試驗組合的RSM預測方程的數(shù)學擴展檢驗如表4所示.MSE的值越小，說明模型表達試驗數(shù)據(jù)越充分.用于建模試驗組合的U和LPD的 MSE 分別為 2.0 ×10－4和 64.0 ×10－4，而用于驗證的分別為0.1 ×10－4和36.0 ×10－4，表示預測值和觀測值相似，均方誤差較小，表明所得模型可以很好地擬合試驗數(shù)據(jù).

偏差因子(BF)是衡量模型的一個非常重要的參數(shù)，Ross［11］認為，對于微生物生長模型的驗證，如果BF值在0.90～1.05的范圍之內(nèi)，認為該模型能夠很好地預測微生物生長速度和生長狀況;如果BF值在0.7～0.9或者1.06～1.15范圍之內(nèi)，則該模型是可以被接受的;如果BF值大于1.15或者小于0.7，則說明該模型是失敗的.這一判斷方法也成功用于單增李斯特菌Listeria monocytogenes生長模型的判定［15］.由表4可知，本試驗所得用于建模試驗組合的U和LPD的BF值分別為0.9807和0.9917，用于驗證的分別為0.9898和0.9885，說明建立的模型可以較好地表達微生物的生長狀況.當AF=1的時候，說明模型有很高的精確性，數(shù)值越大，或者越小，說明該模型的準確性越低［16］.如表4所示，用于建模試驗組合的U的AF值都屬于可以接受的結果.本試驗建立的預測方程適合預測不同試驗條件下冷卻豬肉中氣單胞菌的生長參數(shù).

表4 RSM預測方程的數(shù)學固有檢驗和擴展檢驗Tab.4 Internal and external mathematical validation by RSM for model validation

3 討論與結論

本研究僅對豬肉中優(yōu)勢腐敗菌之一的氣單胞菌開展研究，冷卻豬肉中氣單胞菌生長情況復雜，影響模型建立的因素很多，冷卻豬肉中的氣單胞菌菌齡并不完全一樣，會對模型的參數(shù)產(chǎn)生影響.有研究表明，早期的環(huán)境和所處的生長階段都會對細胞轉(zhuǎn)入新環(huán)境后適應和再次生長所用的時間產(chǎn)生影響［16］.另外，冷卻豬肉中存在的其他微生物也會對氣單胞菌的生長有協(xié)同或拮抗作用，已有專門對試驗條件下混合菌種的研究［17］，也可用單一的預測模型進行模擬.同時，實際食品環(huán)境的復雜性遠遠高于試驗條件組合，一般認為試驗條件下的預測會出現(xiàn)Fail－Safe情況，試驗條件下得到的生長預測模型在用于生產(chǎn)實踐前，要經(jīng)過實際食品的驗證才能真正推廣使用.

試驗除了將溫度作為對微生物生長的主要影響因素加以研究外，還將pH和初始接菌量作為顯著影響因素引進了預測方程，從所建的生長預測模型來看，溫度、pH都對冷卻豬肉中氣單胞菌的生長有顯著影響，而初始接種量只對氣單胞菌生長的最大比生長速率U有影響，對遲滯期LPD的影響則可以忽略.本研究建立的生長預測模型經(jīng)數(shù)學檢驗預測誤差較低，擬合性較好，而且因為試驗是基于真正食品環(huán)境，比用培養(yǎng)基培養(yǎng)得出的結果更適合用于生產(chǎn)實踐.

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