烏梢蛇實(shí)時(shí)熒光定量PCR法的建立及與普通PCR鑒別方法的比較研究

楊寶，朱殿龍，馬寧，張燁，李忠華

(1.太原市食品藥品檢驗(yàn)所分子生物學(xué)檢測(cè)室，山西 太原 030006；2.大連市檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證技術(shù)服務(wù)中心中藥檢測(cè)室，遼寧 大連 116000；3.山西省食品藥品檢驗(yàn)所食品檢測(cè)室，山西 太原 030006)

烏梢蛇為游蛇科動(dòng)物烏梢蛇的干燥體。多于夏秋二季捕捉。剖開腹部或先剝皮留頭尾，除去內(nèi)臟，盤成圓盤狀，干燥[1]。烏梢蛇始載于《開寶本草》，原名“烏蛇”,別名劍脊烏梢蛇。其性味甘平，歸肝經(jīng)；有祛風(fēng)、通絡(luò)、止痙的作用[2]。

近年來，由于資源有限，價(jià)格昂貴，市售常見的蛇藥材均普遍地存在著偽品和混淆品現(xiàn)象，如非藥用價(jià)值的蛇冒充有藥用價(jià)值蛇類,或中藥材蛇類之間存在的混淆現(xiàn)象，特別是炮制后，除去了頭、鱗、骨，更易混雜，這給臨床用藥的安全及藥物的質(zhì)量和療效帶來潛在危險(xiǎn)[3]。此外，藥材在加工處理剖去內(nèi)臟后，要進(jìn)行干燥熏黑處理，皮上的花紋特征、顏色幾近消失，難以辨認(rèn)，而且其大小、形態(tài)特征與烏梢蛇也有所差異，這是造成其性狀鑒別困難的另一重要原因。近年來DNA 分子鑒別技術(shù)快速發(fā)展，位點(diǎn)特異性PCR、DNA 測(cè)序等技術(shù)開始用于動(dòng)物類藥材的鑒別，多種動(dòng)物藥材已建立分子鑒別方法[4-10]。《中國(guó)藥典》2015年版鑒別項(xiàng)下增加了烏梢蛇PCR鑒定，但由于藥典所載方法用時(shí)較長(zhǎng)，方法步驟較多，所需的檢驗(yàn)儀器設(shè)備也較多，因此無法滿足中藥真?zhèn)舞b別現(xiàn)場(chǎng)運(yùn)用的需要。本研究基于烏梢蛇CO1 片段的SNP位點(diǎn)序列特征，設(shè)計(jì)特異性引物、探針，通過PCR能快速準(zhǔn)確地鑒別烏梢蛇。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品 通過對(duì)市場(chǎng)流通的烏梢蛇藥材調(diào)查，發(fā)現(xiàn)市場(chǎng)上多以紅點(diǎn)錦蛇(Elapherufodorsata)、黑眉錦蛇(Elaphetaeniura)、玉斑錦蛇(Elapheman-darinu)、王錦蛇(Elaphecarinata)、灰鼠蛇(Ptyaskorros)、滑鼠蛇(Ptyasmucosus)、赤鏈蛇(Dinodonrufozonatum)、赤鏈華游蛇(Sinonatrixannularis)等來假冒烏梢蛇藥材進(jìn)行銷售，這與陳瑞生等[2，11-12]的論文結(jié)果是一致的。

本試驗(yàn)共采集烏梢蛇藥材及其易混偽品15個(gè)物種30份樣本，覆蓋市場(chǎng)上常見偽品，樣品分別采集于河北安國(guó)、安徽亳州，以及太原市藥店，廣州清遠(yuǎn)，大連、桂林市藥品檢驗(yàn)所。樣品經(jīng)大連市藥檢所朱殿龍副主任中藥師鑒定，憑證樣本保存于太原市食品藥品檢驗(yàn)所，樣品信息見表1。

1.1.2 儀器 香港力康Neofuge13R高速冷凍離心機(jī)；美國(guó)熱電ABI7500fast熒光定量PCR儀；BIO-RAD C1000 TOUCH梯度PCR儀、Power Pac Basic電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)，均購(gòu)自美國(guó)伯樂公司。

1.1.3 試劑 DNA Isolation Reagent for Meat and Meat Products試劑盒(Tkara9178)；引物、探針由上海生工生物公司合成；ABI TaqMan Fast Universal PCR Master Mix(2X)購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣本DNA提取方法比較 取供試品，用75%酒精棉球擦拭消毒，干燥，用球磨儀粉碎成細(xì)粉狀。

表1 樣本信息表

表2 所需儀器設(shè)備數(shù)量比較

用Eppendorf微量核酸分析儀測(cè)定 DNA的純度，將OD260/OD280在1.7～1.9之間，且濃度范圍在10～100 ng·μL-1的DNA溶液作為模板DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)與擴(kuò)增 引物設(shè)計(jì)：檢索NCBI的數(shù)據(jù)庫和采用測(cè)序后獲得烏梢蛇及鼠蛇科近源物種灰鼠蛇、滑鼠蛇等樣品相關(guān)序列數(shù)十條，首先用Snap gene軟件比對(duì)出保守序列，再經(jīng)過Oligov7.0.1和NCBI的 Primer-Blast，設(shè)計(jì)出能夠用于烏梢蛇真?zhèn)舞b別多個(gè)特異性位點(diǎn)的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)引物和探針，由上海生工生物公司合成，具體見表3～4。

表3 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)引物和探針

表4 樣本DNA提取過程比較

本試驗(yàn)反應(yīng)體系配制如下表5，藥典擴(kuò)增體系配制嚴(yán)格按照藥典方法配制。

表5 擴(kuò)增反應(yīng)體系

本試驗(yàn)方法擴(kuò)增反應(yīng)條件與《中國(guó)藥典》檢驗(yàn)方法比較如下表6。

1.2.3 特異性試驗(yàn) 以“1.2.1”項(xiàng)下Takara9178核酸提取試劑盒方法提取的烏梢蛇為標(biāo)準(zhǔn)品藥材(121591-201602)，以金環(huán)蛇、銀環(huán)蛇(4批)、赤鏈蛇(2批)、赤練華游蛇(2批)、蘄蛇(3批)、黑眉錦蛇(2批)、虎斑游蛇、玉斑錦蛇、滑鼠蛇、王錦蛇、草蛇、灰鼠蛇、紅點(diǎn)錦蛇、漁游蛇，共計(jì)3科12屬15個(gè)物種樣品DNA 為模板，按上述體系和反應(yīng)條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR條件擴(kuò)增，并設(shè)空白對(duì)照，驗(yàn)證引物和探針的特異性。

1.2.4 樣品覆蓋度試驗(yàn) 將一批新鮮烏梢蛇樣品(WSS007)，3批烏梢蛇中藥材未炮制樣品(WSS001-003)，3批烏梢蛇炮制品(WSS004-006)上述3種樣品按照“1.2.1”項(xiàng)下Takara9178核酸提取試劑盒方法提取樣品DNA，分別進(jìn)行“1.2.2”項(xiàng)下實(shí)時(shí)熒光PCR條件擴(kuò)增，進(jìn)行結(jié)果分析。

1.2.5 靈敏度 將100 ng的(WSS001)烏梢蛇DNA模板10倍遞減稀釋，稀釋至1×10-3ng每個(gè)梯度做5個(gè)平行試驗(yàn)，分別進(jìn)行“1.2.2”項(xiàng)下實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增和現(xiàn)行藥典方法擴(kuò)增電泳，進(jìn)行結(jié)果分析，測(cè)試該方法的靈敏度。

2 結(jié)果與分析

2.1 本研究檢測(cè)方法與現(xiàn)行藥典檢測(cè)方法比較 如表2所示，《中國(guó)藥典》規(guī)定電泳產(chǎn)物分析應(yīng)單獨(dú)設(shè)立擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)，避免有毒有害物質(zhì)傳播和試驗(yàn)過程交叉污染，需要電泳設(shè)備及凝膠成像設(shè)備，因此，現(xiàn)行藥典方法無法應(yīng)用于快檢車。本研究檢測(cè)方法所需儀器設(shè)備較少，采用便攜式儀器更能夠節(jié)省使用空間，整個(gè)檢測(cè)過程全部為閉管操作無須電泳檢測(cè)直接得出結(jié)果，該方法可靈活應(yīng)用于快檢車內(nèi)。

如表4和表6，本研究檢測(cè)方法得出結(jié)果僅需要40 min～1 h左右，現(xiàn)行藥典檢測(cè)方法檢測(cè)時(shí)間大約需要3.5～4 h左右，本研究檢測(cè)方法比中國(guó)藥典檢測(cè)方法快2.5～3 h，能夠達(dá)到快速檢驗(yàn)的目的。

2.2 特異性試驗(yàn) 如圖1所示，除中檢院烏梢蛇對(duì)照藥材CT值小于35，在35個(gè)循環(huán)內(nèi)產(chǎn)生明顯的對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線以外，其余非烏梢蛇類樣品CT值均大于35，蘄蛇、滑鼠蛇、銀環(huán)蛇、赤鏈蛇在35至40個(gè)循環(huán)有不同程度的擴(kuò)增曲線，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，本試驗(yàn)判定陽性結(jié)果應(yīng)定為CT值小于35。

2.3 樣品覆蓋度試驗(yàn) 如圖2所示，將市場(chǎng)上采集的7批樣品分別提取DNA，每組樣品做兩個(gè)平行，分別進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，7批烏梢蛇樣品CT值小于35，在35個(gè)循環(huán)內(nèi)可產(chǎn)生對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線，烏梢蛇鮮制品比干制品小4個(gè)左右CT，干制品比炮制后干制品小4個(gè)CT左右。

2.4 靈敏度試驗(yàn) 如圖3所示，當(dāng)烏梢蛇DNA 反應(yīng)每管含量為100 ng 時(shí)，平均CT=14.27；含量為10 ng 時(shí)，平均CT =17.77； 當(dāng)含量為1 ng，平均CT=21.37；當(dāng)含量為1×10-1ng時(shí)，平均CT=24.85； 當(dāng)含量為1×10-2ng時(shí)，平均CT=28.37； 當(dāng)含量為1×10-3ng時(shí)，平均CT=32.19，CT值均小于35，本方法靈敏度高達(dá)1×10-3ng，濃度梯度間各濃度的平均CT差為3.56，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD均小于3.5%，擴(kuò)增結(jié)果具有良好的重復(fù)性。以稀釋度對(duì)CT值作圖，其線性關(guān)系如圖4所示，線性相關(guān)系數(shù)R2=1，線性方程為Y=-3.557lgX+14.231，線性范圍為 1×10-3～100 ng即(0.001%～100%)，該方法有良好的線性相關(guān)性。

如圖5所示藥典方法靈敏度僅能達(dá)到1×10-2ng/反應(yīng)，并且在該濃度下電泳結(jié)果通過肉眼已很難判讀，本研究檢測(cè)方法的靈敏度1×10-3ng/反應(yīng)，靈敏度比現(xiàn)行藥典檢測(cè)方法高10倍。

圖1 烏梢蛇特異性擴(kuò)增圖譜

圖2 烏梢蛇樣品覆蓋度擴(kuò)增圖譜

圖3 實(shí)時(shí)熒光PCR靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

圖4 實(shí)時(shí)熒光PCR靈敏度標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖5 擴(kuò)增電泳方法靈敏度試驗(yàn)

3 結(jié)論與討論

近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，各種分子標(biāo)記技術(shù)紛紛被應(yīng)用于烏梢蛇的鑒別中?！吨袊?guó)藥典》2015年版中收錄了烏梢蛇分子生物學(xué)鑒別方法。陳康等[13]通過對(duì)經(jīng)典PCR 技術(shù)方法條件進(jìn)行優(yōu)化，將PCR技術(shù)與熒光檢測(cè)技術(shù)結(jié)合應(yīng)用到蛇類藥材真?zhèn)舞b別。李梓僮等[14]結(jié)合現(xiàn)代 DNA 指紋圖譜技術(shù)，對(duì)《中國(guó)藥典》2015年版烏梢蛇 DNA 檢測(cè)方法進(jìn)行了優(yōu)化和改良，開發(fā)了烏梢蛇 PCR 檢測(cè)試劑盒。但這幾種檢測(cè)方法均為普通PCR法，僅具有引物單重特異性，而市場(chǎng)上中藥材種類繁多，物種基因存在多樣性，檢測(cè)過程易出現(xiàn)假陽性的結(jié)果，且這些方法靈敏度相對(duì)較低，對(duì)于深加工及中成藥類等DNA含量較低的樣品，可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)。孫清萍等[15]通過環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)開發(fā)出一套快速篩查烏梢蛇正品的方法。該方法雖然快速，特異性強(qiáng)，但不能參與多重檢測(cè)反應(yīng)，若產(chǎn)生引物二聚體，易產(chǎn)生假陽性結(jié)果。

本研究針對(duì)蘄蛇、滑鼠蛇、銀環(huán)蛇、赤鏈蛇在35至40個(gè)循環(huán)有不同程度的擴(kuò)增曲線，這種擴(kuò)增結(jié)果可能是由于中藥材本身存在痕量物質(zhì)的污染或者擴(kuò)增程序在35個(gè)循環(huán)后存在交叉反應(yīng)導(dǎo)致的，因此為了降低待測(cè)物種的假陽性率，本研究在市售易摻偽3科12屬15個(gè)物種樣品特異性試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將CT值35作為目標(biāo)物種陽性判定分界點(diǎn)，特異引物和探針對(duì)目標(biāo)物種和非目標(biāo)物種在35以上無交叉反應(yīng)，痕量物質(zhì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果無影響。覆蓋度試驗(yàn)結(jié)果顯示烏梢蛇鮮制品CT值<烏梢蛇未炮制干制品<炮制后烏梢蛇干制品，說明烏梢蛇樣品在經(jīng)過干制和炮制后，樣品DNA均會(huì)有不同程度的降解，DNA提取難度也相應(yīng)地增加，但本研究的方法仍能夠檢出目標(biāo)基因。從引物、探針的靈敏度試驗(yàn)可以看出，該方法在1×10-3ng DNA含量時(shí)仍能有良好的重復(fù)性，因此以該方法分析烏梢蛇DNA的檢出限為1×10-3ng/反應(yīng)，而如圖4所示《中國(guó)藥典》檢測(cè)方法檢出限為1×10-2ng/反應(yīng)，所以本方法有更高的靈敏度。

通過引物和探針與模板的特異性雜交來鑒別模板的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法特異性更高；并且采用完全閉管檢測(cè)，無須PCR后處理，避免了交叉污染和假陽性；整個(gè)試驗(yàn)所需儀器設(shè)備較少，從提取到獲得結(jié)果僅需40 min到1 h，而藥典方法需要3.5～4 h，需要的檢驗(yàn)檢測(cè)設(shè)備也較多。綜上，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，由于采用儀器檢測(cè)器檢測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)的熒光，放大了反應(yīng)信號(hào)，由儀器判讀試驗(yàn)結(jié)果，靈敏度較高，因此能夠應(yīng)用于烏梢蛇及其飲片現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)中。