正交試驗(yàn)法優(yōu)選宣郁通經(jīng)湯顆粒的提取工藝

劉群，劉偉，姜大勇

(1.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 濟(jì)南 250101；2.漱玉平民大藥房連鎖股份有限公司,山東 濟(jì)南 250100)

宣郁通經(jīng)湯組方為白芍五錢(酒炒)，當(dāng)歸五錢(酒洗)，丹皮五錢，山梔子三錢(炒)，白芥子二錢(炒研)，柴胡一錢，香附一錢(酒炒)，川郁金一錢(醋炒)，黃芩一錢(酒炒)，生甘草一錢，水煎服，已經(jīng)入選了國(guó)家中醫(yī)藥管理局公布的第一批100種古代經(jīng)典名方目錄。原方收載于《傅青主女科》(清·傅山)“婦人有經(jīng)前腹疼數(shù)日，而后經(jīng)水行者，其經(jīng)來(lái)多是紫黑塊，人以為寒極而然也，誰(shuí)知是熱極而火不化乎！…治法似宜大泄肝中之火，然泄肝之火，而不解肝之郁，則熱之標(biāo)可去，而熱之本未除也，其何能益！方用宣郁通經(jīng)湯”[1]。方中柴胡味苦、辛性微寒，歸肝膽經(jīng)，疏肝解郁；香附辛平香竄，疏肝理氣，調(diào)經(jīng)止痛，祛痰除濕，乃氣病之總司，女科之主帥；白芍味苦酸甘，養(yǎng)血調(diào)經(jīng)平肝止痛；當(dāng)歸甘溫質(zhì)潤(rùn)，為補(bǔ)血要藥，補(bǔ)血活血，調(diào)經(jīng)止痛；丹皮清熱涼血，活血散瘀；郁金味辛苦性寒，歸肝膽心經(jīng)，涼血活血，行氣止痛，解郁清心；梔子性味苦寒，瀉火除煩，清熱利濕，涼血止痛；黃芩苦寒，清熱燥濕，涼血除熱；白芥子辛溫，利氣散結(jié)，無(wú)痰不消，甘草清熱祛痰，緩急止痛，調(diào)和藥性；諸藥配合使用，有疏肝郁、補(bǔ)肝血、清肝熱、逐肝瘀之功，使氣行血暢、濕祛痰消，故對(duì)婦科臨床諸多因肝郁氣滯、血瘀痰凝、濕熱蘊(yùn)結(jié)而引起的病癥有獨(dú)特的治療作用[2]。

據(jù)邱隆等[3-4]多位現(xiàn)代學(xué)者考證，清代度量衡中的1兩約合現(xiàn)在的37.3 g，處方中飲片劑量取整數(shù)37 g，宣郁通經(jīng)湯處方中飲片折合現(xiàn)代劑量約92.5 g，量較大，不方便攜帶、服用，不易貯存，只能現(xiàn)煎現(xiàn)服；因顆粒劑栽藥量大，故成顆粒劑便于保證藥效和方便患者服用。宣郁通經(jīng)湯顆粒至今未見(jiàn)有關(guān)制劑及提取方面報(bào)道，本試驗(yàn)以出膏率和芍藥苷含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 BSA822-CW電子精密天平(德國(guó)賽多利斯)；LC-15C高效液相色譜儀(島津)；SL-15AD紫外檢測(cè)器；PDA-PD-15C自動(dòng)進(jìn)樣器；CO-2000柱溫箱(河北慧采科技開(kāi)發(fā)有限公司)；ES-E型電子分析天平(上海升徽電子有限公司)；KQ2200B超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；KDM可調(diào)控溫電熱套(山東郯城華魯電熱儀器有限公司)。

1.2 試藥 芍藥苷對(duì)照品(20 mg，批號(hào)：110736-201936，純度為98.1%)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；白芍(1908080362)、當(dāng)歸(1904120245)、牡丹皮(1905230212)、山梔子(1908140123)、白芥子(1909150110)、柴胡(1910260651)、香附(1908242523)、川郁金(1911050328)、黃芩(1912240861)、生甘草(1908210567)均符合《中國(guó)藥典》2015年版(一部)中各藥材項(xiàng)目規(guī)定，購(gòu)自亳州市滬譙藥業(yè)有限公司；乙腈(色譜純)、磷酸(分析純)購(gòu)自格里斯(天津)醫(yī)藥化學(xué)技術(shù)有限公司；水為自制重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 水提正交試驗(yàn) 分別按宣郁通經(jīng)湯顆粒處方稱取白芍(酒炒)148 g、當(dāng)歸(酒洗)148 g、丹皮148 g、山梔子(炒)88.8 g、白芥子(炒研)59.2 g、柴胡29.6 g、香附(酒炒)29.6 g、川郁金(醋炒)29.6 g、黃芩(酒炒)29.6 g、生甘草29.6 g，共9份，每份計(jì)740 g，參考相關(guān)文獻(xiàn)[5-6]，按表1進(jìn)行正交試驗(yàn)，以提取液中芍藥苷含量和出膏率為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，因素水平表見(jiàn)表1。

表1 因素水平表

2.2 出膏率測(cè)定 分別精密量取各試驗(yàn)提取液80 mL，置已恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105 ℃干燥至恒重，稱重，計(jì)算。

2.3 芍藥苷含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)用性試驗(yàn) 以十八烷基鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-0.05%磷酸溶液-三乙胺(14∶86∶0.02)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm[7]；論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

2.3.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取芍藥苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含50 μg的溶液，即得。

2.3.3 供試品溶液制備

2.3.3.1 供試品溶液1 精密量取提取液4 mL，置10 mL量瓶中，用70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3.2 供試品溶液2 取本品細(xì)粉3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加70%甲醇100 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，離心，取上清液濾過(guò)，即得。

2.3.4 陰性供試品溶液 取不含白芍的宣郁通經(jīng)湯顆粒，同“2.3.3.2”項(xiàng)下方法，制得陰性供試品溶液。

2.3.5 線性與范圍 精密稱取芍藥苷對(duì)照品12.46 mg，置100 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，分別精密量取2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，作為線性溶液。精密量取各線性溶液10 μL，分別注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，以芍藥苷濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=14 271X+248.83，R2=0.999 7；結(jié)果芍藥苷在24.45～85.56 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.6 精密度 取芍藥苷對(duì)照品溶液(56.74 μg·mL-1)連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果峰面積RSD為1.37%，儀器精密度良好。

2.3.7 重復(fù)性 取同一批宣郁通經(jīng)湯顆粒按“2.3.3.2”項(xiàng)下制備6份樣品，測(cè)定芍藥苷含量，結(jié)果RSD為0.94%，方法重復(fù)性良好。

2.3.8 穩(wěn)定性 取同一份宣郁通經(jīng)湯顆粒供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣，記錄峰面積，RSD為0.96%，供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.9 加樣回收率試驗(yàn) 稱取同一批宣郁通經(jīng)湯顆粒(1.81 mg·g-1)6份，每份約1.5 g，精密稱定，照“2.3.3.2”項(xiàng)下方法處理，分別加入綠原酸對(duì)照品溶液(1.317 1 mg·mL-1)2 mL，混勻后測(cè)定，計(jì)算綠原酸回收率，平均回收率為99.52%，RSD為0.42%，回收率良好(見(jiàn)表2)。

2.4 水提工藝確定 正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4～5。結(jié)果以提取液芍藥苷含量和出干膏率為指標(biāo)進(jìn)行提取評(píng)價(jià)，從正交試驗(yàn)直觀與方差分析可知，影響宣郁通經(jīng)湯提取效果的因素均為A>B>C>D，因素A3明顯優(yōu)于A2與A1，故選A3；B3>B2>B1，C3與C2差別較小，D1、D2與D3無(wú)差別，故優(yōu)選B3C2D1；綜合生產(chǎn)成本和操作的可行性等因素，優(yōu)選提取工藝為A3B3C2D1，即宣郁通經(jīng)湯最佳工藝為飲片加8倍量水浸泡30 min，提取3次，每次60 min。

表2 回收率計(jì)算結(jié)果

表3 因素水平表

表4 出干膏率方差分析

表5 芍藥苷含量方差分析

2.5 工藝驗(yàn)證 稱取宣郁通經(jīng)湯顆粒處方中藥材各3份，每份740 g，分別按優(yōu)選工藝(加8倍量水浸泡30 min，提取3次，每次60 min)提取，制成顆粒劑，測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表

結(jié)果表明，以優(yōu)選的提取工藝驗(yàn)證3批，該工藝的出膏率和宣郁通經(jīng)湯顆粒中芍藥苷含量穩(wěn)定。

3 討論

3.1 根據(jù)古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑簡(jiǎn)化注冊(cè)審批管理規(guī)定，古代經(jīng)典名方制備方法除成型工藝外，其余制備方法應(yīng)當(dāng)與古代醫(yī)籍記載基本一致，宜用水煎[8]，為保持宣郁通經(jīng)湯傳統(tǒng)經(jīng)典名方的特點(diǎn)，本試驗(yàn)以水提取。

3.2 傳統(tǒng)的中藥煎煮方法一般要求先將中藥用冷水浸泡20～40 min后才進(jìn)行煎煮，藥材在煎煮前保持適當(dāng)?shù)慕輹r(shí)間可以充分潤(rùn)透[9-10]，經(jīng)試驗(yàn)，宣郁通經(jīng)湯中的飲片吸水量約為飲片的1.5倍左右，加水量少，不易藥材中有效成分的提出，煎煮時(shí)間太長(zhǎng)，易破壞有效成分，以飲片的干膏率和芍藥苷含量為指標(biāo)，試驗(yàn)了浸泡時(shí)間，加水量，提取次數(shù)與提取時(shí)間，優(yōu)選出了較為合理的提取工藝。為驗(yàn)證優(yōu)選工藝(飲片加8倍量水浸泡30 min，提取3次，每次60 min)的可行性，進(jìn)行了3批驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果優(yōu)選的工藝穩(wěn)定、可行。

3.3 宣郁通經(jīng)湯每日飲片量約92.5 g，水煎服，湯劑量較大，不方便患者服用；處方中飲片水提出干膏率約28%(約26 g)，按日分3次服用計(jì)，每次服用干膏8.6 g，只適合于制成顆粒劑；在顆粒成型試驗(yàn)中分別以稠膏與不同輔料試驗(yàn)，使用輔料較多，制成顆粒量較大，不方便患者服用；與為減少服用量，宜將稠膏干燥，粉碎成細(xì)粉與輔料混勻，以適宜濃度的乙醇為潤(rùn)濕劑制粒。