CYP3A4介導(dǎo)的睪酮和卡馬西平與香芹酚的相互作用

李 洋，George Desideri KASHANGAKI，衣服新

（錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，遼寧 錦州 121001）

香芹酚（carvacrol），即2-甲基-5-異丙基苯酚，是一種存在于百里香油等植物的天然活性物質(zhì)［1］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，香芹酚具有抗炎和抗氧化等多種藥理活性［1-2］。近年來發(fā)現(xiàn)，香芹酚具有抗癲癇作用和神經(jīng)元保護(hù)作用，受到廣泛關(guān)注［3-5］。

細(xì)胞色素P450酶3A4（cytochrome P450 3A4，CYP3A4）是重要的藥物代謝酶，＞50%上市藥物是通過CYP3A4代謝，包括抗癲癇藥物卡馬西平［6-8］?？R西平治療窗窄，癲癇患者長(zhǎng)期服用卡馬西平的同時(shí)可能會(huì)服用中藥或中藥制劑，從而誘發(fā)藥物不良反應(yīng)［6，9-11］。因此，有必要評(píng)估中藥活性成分對(duì)CYP3A4介導(dǎo)的卡馬西平代謝的影響，有助于指導(dǎo)卡馬西平臨床合理用藥。

卡馬西平在體內(nèi)經(jīng)CYP酶代謝生成10個(gè)代謝產(chǎn)物，其中CYP3A4介導(dǎo)產(chǎn)生的卡馬西平10，11環(huán)氧代謝物是主要代謝產(chǎn)物［7-8］。該反應(yīng)可用作為探針反應(yīng)考察CYP3A4的酶活性，還可用于中草藥-卡馬西平相互作用風(fēng)險(xiǎn)的篩查和評(píng)估［9-11］。除卡馬西平外，睪酮、硝苯地平、紅霉素和咪達(dá)唑侖等均是美國食品藥品監(jiān)督管理局（US Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）推薦的體外 CYP3A4探針底物［12-14］。但需要指出的是，CYP3A4晶體結(jié)構(gòu)中存在多個(gè)底物結(jié)合位點(diǎn)［12-13］。使用不同CYP3A4探針底物獲得的藥物-藥物相互作用（drug-drug interaction，DDI）數(shù)據(jù)可能存在差異。例如，α-萘黃酮不僅激活CYP3A4介導(dǎo)的咪達(dá)唑侖1′-羥化反應(yīng)和硝苯地平氧化反應(yīng)，還可抑制睪酮6β-羥化反應(yīng)［15］。為提高預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率，當(dāng)待測(cè)化合物和探針底物與CYP3A4的結(jié)合位點(diǎn)不一致時(shí)，應(yīng)使用待測(cè)化合物本身作為底物開展DDI預(yù)測(cè)。

現(xiàn)有研究表明，香芹酚具有抗癲癇作用［5］。然而，香芹酚是否能與卡馬西平等CYP3A4底物聯(lián)用尚不清楚。本研究旨在應(yīng)用人肝微粒體孵育體系比較香芹酚對(duì)CYP3A4介導(dǎo)的睪酮和卡馬西平代謝的抑制作用。通過抑制動(dòng)力學(xué)研究，闡明香芹酚對(duì)CYP3A4介導(dǎo)的卡馬西平10，11-環(huán)氧反應(yīng)的抑制參數(shù)和抑制類型。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

香芹酚、卡馬西平、卡馬西平10，11環(huán)氧化物、睪酮、6β-羥化睪酮、酮康唑、葡萄糖-6-磷酸和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和氧化型輔酶Ⅱ（NADP+）（Sigma-Aldrich公司，美國）；乙腈為色譜純，磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀為分析純，其他的試劑均色譜純級(jí)（默克公司，德國）；人混合肝微粒體（上海瑞德肝臟疾病研究有限公司）。LC-10AVP高效液相色譜系統(tǒng)（SCL-10AVP系統(tǒng)控制器、LC-10ATVP雙泵、SPD-10AVP紫外-可見光檢測(cè)器、SIL-10ADVP自動(dòng)進(jìn)樣器和CLASS-VP色譜工作站）（島津，日本）；3-18KS高速離心機(jī)（Sigma，德國）；JHN-4F超聲波清洗儀（上海杰恩普超聲設(shè)備有限公司）；色譜柱為華普XAqua C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）（大連華普公司）。

1.2 CYP3A4探針底物、反應(yīng)體系和條件

采用睪酮和卡馬西平雙探針底物表征CYP3A4酶的催化活性。200 μL反應(yīng)體系包括：磷酸鉀緩沖液100 μmol·L-1（pH=7.4）、NADPH 系統(tǒng)（NADP+1 mmol·L-1，葡萄糖-6-磷酸10 mmol·L-1，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶1 kU·L-1和氯化鎂4 mmol·L-1），適合濃度的人肝微粒體（g·L-1），相應(yīng)的探針底物和香芹酚（或陽性抑制劑酮康唑）?？R西平10，11環(huán)氧化物及6β-羥化睪酮的生成速率在0～40 min反應(yīng)時(shí)間和微粒體濃度范圍（0.1～0.7 g·L-1）內(nèi)呈線性，且探針底物的消耗量＜20%。因此，在單點(diǎn)法初篩香芹酚（100 μmol·L-1）中，人肝微粒體使用的終濃度為0.5 g·L-1；在抑制能力評(píng)價(jià)中，終濃度為0.2 g·L-1?？R西平用乙腈溶解，反應(yīng)體系中乙腈體積比為1.5%，以避免對(duì)CYP3A4活性的影響［16-17］。該體系下，液相法測(cè)定卡馬西平的最大溶解度為 1 612 μmol·L-1。反應(yīng)體系在 37℃條件下預(yù)孵3 min后，加入NADP+起始反應(yīng)。20 min后，用200 μL的乙腈終止反應(yīng)。然后20 000×g離心10 min，取10 μL上清HPLC進(jìn)樣分析。

1.3 通過抑制動(dòng)力學(xué)考察香芹酚對(duì)CYP3A4酶活性的抑制作用

考察香芹酚100 μmol·L-1對(duì)CYP3A4介導(dǎo)的睪酮6β-羥化反應(yīng)及卡馬西平10，11環(huán)氧化反應(yīng)抑制活性。如抑制率＞50%，選取不同濃度的香芹酚進(jìn)一步求出其半數(shù)抑制濃度（IC50）。采用不同濃度的香芹酚（0～15 μmol·L-1）和卡馬西平（0～1500 μmol·L-1），通過抑制動(dòng)力學(xué)測(cè)定香芹酚對(duì)CYP3A4的抑制能力。Ki根據(jù)競(jìng)爭(zhēng)性抑制方程①、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制方②和反競(jìng)爭(zhēng)性抑制方程③通過GraphPad Prism 6.0軟件非線性回歸計(jì)算獲得。

式中，Vmax是最大反應(yīng)速度；Km是米氏常數(shù)；Ki是抑制常數(shù)，S是底物濃度；α是相關(guān)系數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示，組間統(tǒng)計(jì)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 香芹酚對(duì)CYP3A4酶抑制活性的單點(diǎn)初篩

香芹酚100 μmol·L-1顯著抑制CYP3A4介導(dǎo)的卡馬西平10，11環(huán)氧代謝物的生成，抑制殘留活性為（22.7±1.4）%（P＜0.01）（圖1）。然而，香芹酚100 μmol·L-1不能抑制CYP3A4介導(dǎo)的6β-羥化睪酮的生成。陽性對(duì)照酮康唑1 μmol·L-1幾乎完全抑制CYP3A4酶的催化活性。表明香芹酚對(duì)CYP3A4的抑制活性具有底物依賴性。

Fig.1 lnhibitory effect of carvacrol and ketoconazole on CYP3A4 induced carbamazepine 10，11-epoxidation and testosterone 6 β-hydroxylation.Carvacrol 100 μmol·L-1 or ketoconazole 1 μmol· L-1was incubated with human liver microsomes（0.5 g·L-1）and probe（carbamazepine 500 μmol·L-1；testosterone 50 μmol·L-1）at 37℃ for 20 min.±s，n=3.＊P＜0.01，compared with corresponding control group.

2.2 香芹酚對(duì)CYP3A4酶活性的抑制作用

香芹酚對(duì)CYP3A4介導(dǎo)的卡馬西平10，11環(huán)氧反應(yīng)的抑制作用具有濃度依賴性（圖2）。非線性擬合數(shù)據(jù)獲得的相關(guān)系數(shù)R2值為0.9812，IC50值為（15.3±1.4）μmol·L-1。表明香芹酚對(duì)CYP3A4介導(dǎo)的卡馬西平10，11環(huán)氧反應(yīng)具有強(qiáng)抑制活性。

2.3 香芹酚對(duì)CYP3A4介導(dǎo)的卡馬西平10，11環(huán)氧化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)行為的影響

Fig.2 Effect of carvacrol on formation of carbamazepine 10，11-epoxide mediated by CYP3A4.Carvacrol（0-100 μmol·L-1）was incubated with human liver microsomes（0.2 g·L-1）and carbamazepine（500 μmol·L-1）at 37℃ for 20 min.±s，n=3.

考察抑制劑共存下酶動(dòng)力學(xué)的變化是研究酶-抑制劑相互作用機(jī)制的重要方法。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，香芹酚共存時(shí)，CYP3A4介導(dǎo)的卡馬西平10，11環(huán)氧化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)行為發(fā)生改變：Vmax值隨香芹酚濃度增加而減小，但香芹酚濃度增加對(duì)Km值影響不大，符合非競(jìng)爭(zhēng)性抑制行為特點(diǎn)（表1和圖3）。說明香芹酚和卡馬西平與CYP3A4的結(jié)合位點(diǎn)不同。將非線性擬合獲得的動(dòng)力學(xué)參數(shù)代入式②，計(jì)算得Ki值為（14.1±1.0）μmol·L-1。

Tab.1 Effect of carvacrol on kinetic parameters of CYP3A4 mediated carbamazepine 10，11-epoxidation.

Fig.3 Effect of carvacrol on kinetic behavior of CYP3A4 mediated carbamazepine 10，11-epoxidation.Carvacrol（0-15 μmol·L-1）was incubated with microsomes 0.2 g·L-1and carbamazepine（0-1500 μmol·L-1）for 20 min.±s，n=3.

3 討論

卡馬西平是目前臨床治療癲癇復(fù)雜部分性發(fā)作的首選藥。卡馬西平在體內(nèi)主要經(jīng)CYP3A4和CYP1A2代謝，其中CYP3A4是其主要代謝酶，代謝貢獻(xiàn)率為0.4～0.8之間［7-8，18］。由于卡馬西平卡的治療窗較窄，有必要評(píng)估與卡馬西平聯(lián)用的藥物能否通過抑制CYP3A4誘發(fā)臨床DDI。對(duì)大多數(shù)CYP亞型來說，選擇一種高特異性的探針底物即可實(shí)現(xiàn)對(duì)酶活性的表征；探針反應(yīng)也可用于對(duì)酶抑制劑的篩選及抑制機(jī)制研究。但這對(duì)于CYP3A4來說并不適用。截至目前，美國FDA推薦的睪酮、硝苯地平、紅霉素和咪達(dá)唑侖等探針與CYP3A4的結(jié)合位點(diǎn)均存在差異［12-15］。此外，研究顯示，卡馬西平與睪酮的CYP3A4的結(jié)合位點(diǎn)也不同［19］。這與本研究結(jié)果相一致（圖1），說明評(píng)價(jià)CYP3A4介導(dǎo)DDI應(yīng)慎重選擇探針底物。

香芹酚是一種天然單萜酚，廣泛存在于牛至、百里香、冬季香薄荷和亞加菊等芳香植物揮發(fā)油中［2］。香芹酚具有抗炎和抗氧化等多種藥理活性［1-2］。歐盟也將香芹酚納入“大體安全”范疇［2］。當(dāng)使用睪酮作為探針底物時(shí)，未發(fā)現(xiàn)其對(duì)CYP3A4的抑制活性，但使用卡馬西平作為底物時(shí)，香芹酚表現(xiàn)出對(duì)CYP3A4的強(qiáng)抑制活性，抑制類型為非競(jìng)爭(zhēng)性。根據(jù)FDA規(guī)定的藥物體內(nèi)最大暴露量與Ki之比＜0.1的警戒線推算［20］，香芹酚的體內(nèi)暴露量＞1.41 μmol·L-1即可能導(dǎo)致 DDI風(fēng)險(xiǎn)。截至目前，香芹酚在人體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究未見報(bào)道。但香芹酚在臨床Ⅱ期研究中的用藥量為每天 1.2 mg·kg-1［21］。在不考慮口服吸收及代謝情況下，香芹酚在體內(nèi)的最大暴露量將達(dá)7.88 μmol·L-1。另外，值得注意的是，不同個(gè)體CYP3A4活性相差10～100倍［22-23］。對(duì)于低CYP3A4活性攜帶者，如CYP3A4＊22，聯(lián)用香芹酚和卡馬西平的風(fēng)險(xiǎn)隨之加大［24］。因此，香芹酚與卡馬西平聯(lián)用可能存在風(fēng)險(xiǎn)，但仍需經(jīng)過體內(nèi)試驗(yàn)或FDA推薦的定量藥理學(xué)方法加以驗(yàn)證。