孕康口服液對環(huán)磷酰胺誘導大鼠卵巢早衰的改善作用及其機制

夏 偉，劉學武，王小青，姜德建，李欣榮

（1.湖南省藥物安全評價研究中心，湖南省新藥藥效與安全性評價重點實驗室，湖南 長沙 410331；2.復旦大學附屬婦產科醫(yī)院，上海 200011）

卵巢早衰指發(fā)生在40歲以前女性因環(huán)境、心理和疾病等因素造成的卵巢功能衰竭，其主要表現(xiàn)為生殖器官萎縮退化，并伴有雌激素（estrogenic hormone，E2）低下，促卵泡激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）升高，嚴重影響女性正常生活與工作［1-2］。卵巢早衰病因復雜，確切發(fā)病機制尚不明確，通過調節(jié)激素水平能改善卵巢早衰的臨床癥狀，但長期使用激素副作用大［3］。孕康口服液（Yunkang oral solution，YKos）主要有山藥、斷續(xù)、黃芪和當歸等，具有健脾固本、養(yǎng)血安胎之功效。臨床應用表明，YKos可治療黃體功能不全，具有顯著的助孕療效，其機制與調節(jié)激素水平有關［4］。本研究通過環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）誘導雌性大鼠卵巢早衰模型，觀察YKos對卵巢早衰的改善作用，并初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、藥品、試劑和主要儀器

SPF級SD大鼠168只，雌性108只，體質量200～240 g，雄性60只，體質量300～350 g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，生產許可證號：SCXK（湘）2016-0002；飼養(yǎng)于湖南省藥物安全評價研究中心屏障環(huán)境，使用許可證號：SYXK（湘）2015-0016。本研究獲得動物倫理委員會的許可〔編號IACUC-2018（3）019〕，所有大鼠均在麻醉狀態(tài)下安樂死。

YKos（國藥準字Z10920062，批號：180501），江西濟民可信藥業(yè)有限公司；黃體酮軟膠囊（國藥準字H20040982，批號：180103），浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠；注射用CTX（每瓶0.2 g，批號：18032225），江蘇盟迪醫(yī)藥有限公司。大鼠E2 ELISA試劑盒（批號：RA20666）和FSH ELISA試劑盒（批號：RA20044），中國Bio-swamp公司；兔抗大鼠促性腺激素釋放激素受體（gonadotropinreleasing hormone receptor，GnRHR）多抗（貨號：19950-1-AP）、兔抗大鼠FSH受體（FSH receptor，F(xiàn)SHR）多抗（貨號：22665-1-AP）、兔抗小鼠β肌動蛋白單抗（貨號：60008-1-Ig）和HRP標記的山羊抗兔IgG抗體，美國Proteintech公司。SpectiaMax i3x型多功能酶標儀，奧地利美股光子公司；DFC 420C病理成像系統(tǒng)、RM2235型石蠟切片機、TP1020型全自動脫水機、HI1210型攤片機、HI1220型烤片機、EG1150H+C型組織包埋機和DM2000型生物顯微鏡，德國Leica公司；PL203電子天平，中國梅特勒-托利多儀器有限公司；Power Pac TM Basic電泳儀，美國Bio-Rad公司；JY04S-3C凝膠成像分析系統(tǒng)，北京君意東方公司。

1.3 動物分組、模型制備和給藥

將108只雌性大鼠隨機分為6組，每組18只，分別為正常對照組、CTX模型組、黃體酮軟膠囊（18 mg·kg-1）（陽性對照）組及YKos 2.5，5.0和10.0 mL·kg-1組。除正常對照組外，其余各組單次ip給予CTX 100 mg·kg-1，制備大鼠卵巢早衰模型，正常對照組ip相應體積的生理鹽水。于造模當天開始，黃體酮軟膠囊組（每日給藥前用純水將黃體酮軟膠囊配制成1.8 g·L-1藥液）和YKos 3個劑量組（每日給藥前用純水將YKos原液配制成濃度為0.25和0.50 L·L-1藥液）以10.0 mL·kg-1ig給予大鼠（藥液或原液），每天1次，連續(xù)28 d。正常對照組和CTX模型組每天ig給予相應體積的蒸餾水。

1.4 卵巢和子宮系數(shù)的測定

末次給藥前記錄大鼠體質量。各組隨機取8只雌性大鼠，安樂死后立即取出卵巢和子宮，剔除脂肪和結締組織后稱重，計算卵巢和子宮系數(shù)。卵巢（子宮）系數(shù)=卵巢（子宮）濕量（g）/體質量（g）×100。

1.5 HE染色觀察卵巢和子宮組織病理變化

將大鼠的右側卵巢和子宮組織用濃度為4%多聚甲醛溶液固定，經脫水、透明化、石蠟包埋和切片處理后，HE染色，光學顯微鏡下觀察卵巢和子宮組織病理變化。卵巢病理評分標準：0分，卵泡形態(tài)無異常，卵巢顆粒細胞層多，排列整齊；1分，卵泡形態(tài)無明顯異常，卵巢顆粒細胞層較少，排列較混亂；2，卵泡形態(tài)變小，卵巢顆粒細胞層明顯減少，且顆粒細胞排列紊亂；3分，卵巢萎縮，無卵巢顆粒細胞或較少。子宮病理評分標準：0分，子宮壁厚度無異常，且無炎癥細胞浸潤；1分，子宮壁厚度略減小，子宮內膜少量炎癥細胞浸潤；2分，子宮壁厚度變小，子宮內膜炎癥細胞浸潤；3分，子宮壁厚度明顯減小，炎癥細胞大量浸潤。

1.6 ELlSA法測定大鼠血清E2和FSH水平

末次給藥后次日，腹主動脈采血，室溫靜置30 min后，以1650×g離心10 min取上清，參照試劑盒說明書操作，測定大鼠血清中E2和FSH水平。

1.7 Western印跡法測定大鼠卵巢組織GnRHR和FSHR表達水平

左側卵巢組織勻漿后，加入RIPA裂解液提取卵巢總蛋白，采用BCA法進行蛋白質定量。隨后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，電轉至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，以5%的脫脂奶粉封閉1.5 h；隨后TBST漂洗3次，用一抗（抗GnRHR，1∶2000；抗FSHR，1∶2000）與PVDF膜結合，4℃孵育過夜；TBST洗3次，室溫孵育HRP標記的山羊抗兔IgG抗體（二抗）（1∶20000）90 min；TBST漂洗3次，ECL化學發(fā)光法曝光拍照掃描，用Quantity One軟件分析卵巢組織中GnRHR和FSHR蛋白條帶的積分吸光度（integrated absorbance，IA），以待測蛋白IA/內參β肌動蛋白IA比值表示待測蛋白的相對表達水平。

1.8 雌性大鼠生育力和胎仔發(fā)育的測定

各組剩余的10只雌性大鼠與正常雄性大鼠按雄∶雌=1∶1合籠交配，14 d后，各組大鼠安樂死，取出子宮，觀察記錄各組雌性大鼠總著床數(shù)、活胎數(shù)、死胎數(shù)和吸收胎數(shù)，計算活胎率、死胎率和吸收胎率。活胎率（%）=活胎數(shù)/著床數(shù)×100%，死胎率（%）=死胎數(shù)/著床數(shù)×100%，吸收胎率（%）=吸收胎數(shù)/著床數(shù)×100%。

1.9 統(tǒng)計學分析

實驗結果數(shù)據用±s表示，用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學分析。組間顯著性差異比較采用單因素方差分析（one way ANOVA）；方差齊性者組間比較采用LSD檢驗，不滿足方差齊性者采用TamhaneT2檢驗，P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 YKos對卵巢早衰模型大鼠卵巢和子宮系數(shù)的影響

與正常對照組比較，CTX模型組大鼠卵巢和子宮系數(shù)明顯降低（P＜0.01）；與CTX模型組比較，YKos 2.5，5.0和10.0 mL·kg-1組大鼠卵巢系數(shù)顯著升高（P＜0.01），5.0和10.0 mL·kg-1組子宮系數(shù)顯著升高（P＜0.01）；黃體酮膠囊組卵巢和子宮系數(shù)均顯著升高（P＜0.01）（表1）。

Tab.1 Effect of Yunkang oral solution（YKos）on ovarian index and uterine index of rats with cyclophosphamide（CTX）-induced premature ovarian failure

2.2 YKos對卵巢早衰模型大鼠卵巢和子宮組織病理改變的影響

圖1和圖2可見，正常對照組光鏡下觀察卵泡成長過程活躍，可見較多各級卵泡，閉鎖細胞較少，黃體發(fā)育好，體積大，黃體細胞豐富。與正常對照組比較，CTX模型組卵巢體積萎縮，各級卵泡少見，閉鎖卵泡增多，卵泡內顆粒細胞層數(shù)較其余各組明顯減少，顆粒細胞排列紊亂；子宮內膜變薄，內膜上皮細胞排列紊亂，腺體減少，腺腔變小，基質稀疏水腫，可見嗜酸性粒細胞浸潤，且組織病理評分顯著降低（P＜0.01）。與CTX模型組比較，YKos 2.5，5.0和10.0 mL·kg-1組大鼠卵巢中閉鎖卵泡顯著減少，卵泡內顆粒細胞層數(shù)顯著增多；子宮膜增厚，嗜酸性粒細胞浸潤減少，病理評分顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。黃體酮膠囊組可見各級卵泡發(fā)育較正常，可見卵泡內母細胞大而圓，卵泡液豐富，輪廓清晰，顆粒細胞層數(shù)增多，排列整齊，病理評分顯著升高（P＜0.05）（表2）。

2.3 YKos對卵巢早衰模型大鼠血清E2和FSH水平的影響

與正常對照組比較，CTX模型組大鼠血清E2含量顯著降低（P＜0.01），F(xiàn)SH含量顯著升高（P＜0.01）；與CTX模型組比較，YKos 5.0和10.0 mL·kg-1組大鼠E2含量顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），F(xiàn)SH水平顯著降低（P＜0.01）；黃體酮膠囊組大鼠E2含量顯著升高（P＜0.05），F(xiàn)SH水平顯著降低（P＜0.05）（表3）。

Fig.1 Effect of YKos on histopathological changes in ovarian tissues of rats with CTX-induced premature ovarian failure（HE staining）.See Tab.1 for the rat treatment.The black arrow indicates ovarian granulosa cells.The red arrow indicates follicles.

Fig.2 Effect of YKos on histopathological changes in uterine tissues of rats with CTX-induced premature ovarian failure（HE staining）.See Tab.1 for the rat treatment.The black arrow indicates the endometrial thickness.The red arrow indicates eosinophil infiltration.

Tab.2 Effect of YKos on pathological scores of ovaries and uterus of rats with CTX-induced premature ovarian failure

Tab.3 Effect of YKos on serum estrogen（E2）and follicle stimulating hormone（FSH）content of rats with CTX-induced premature ovarian failure

2.4 YKos對卵巢早衰模型大鼠卵巢組織GnRHR和FSHR蛋白表達的影響

Western印跡法檢測結果顯示，與正常對照組比較，CTX模型組卵巢組織GnRHR和FSHR蛋白表達水平均顯著下降（P＜0.01）；與CTX模型組相比較，YKos 2.5，5.0和 10.0 mL·kg-1組 GnRHR 和FSHR表達水平均顯著增強（P＜0.01）；黃體酮膠囊組GnRHR和FSHR蛋白表達水平均顯著上升（P＜0.01）（圖3）。

Fig.3 Effect of YKos on protein expressions of gonadotropin-releasing hormone receptor（GnRHR）and FSH receptor（FSHR）of rats with CTX-induced premature ovarian failure.See Tab.1 for the rat treatment.B was the semiquantitative result of A.IA：integrated absorbance.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；##P＜0.01，compared with CTX group.

2.5 YKos對卵巢早衰模型大鼠生育力和胚仔發(fā)育的影響

與正常對照組比較，CTX模型組受孕大鼠平均黃體數(shù)、平均著床數(shù)和活胎率均顯著降低（P＜0.01），死胎率和吸收胎率顯著上升（P＜0.05，P＜0.01）；與 CTX 模型組比較，YKos 2.5，5.0和10.0 mL·kg-1組及黃體酮膠囊組平均黃體數(shù)、平均著床數(shù)和活胎率均顯著升高（P＜0.01），YKos 2.5和5.0 mL·kg-1組及黃體酮膠囊組死胎率和吸收胎率顯著下降（P＜0.05，P＜0.01），YKos 10 mL·kg-1組吸收胎率顯著降低（P＜0.01）（表4）。

Tab.4 Effect of YKos on fertility of rats with CTX-induced premature ovarian failure

3 討論

卵巢早衰發(fā)病原因主要是原始卵泡儲備過少，卵泡閉鎖或者耗竭［5］。本研究采用CTX制備卵巢早衰大鼠模型，發(fā)現(xiàn)CTX模型組大鼠卵巢明顯萎縮，光鏡下觀察各級卵泡明顯減少，閉鎖卵泡增多，提示造模成功。

YKos臨床日用量為60 mL，按體表系數(shù)折算到大鼠的等效劑量為5.4 mL·kg-1，本研究雌性大鼠ip給予CTX后，給予YKos 2.5，5.0和10.0 mL·kg-1治療。與CTX模型組比較，YKos 2.5，5.0和10.0 mL·kg-1組大鼠卵巢系數(shù)明顯升高，光鏡下各級卵泡數(shù)目增多，閉鎖卵泡明顯減少，顆粒細胞數(shù)增多，且子宮病理改變明顯改善，說明YKos可促進卵泡生長。

體內E2和FSH水平是評價卵巢功能的重要指標，基礎FSH水平升高會降低卵巢儲備功能，E2水平低下會導致卵巢分泌功能不良［6-7］。本研究結果顯示，CTX模型組血清E2水平明顯降低，F(xiàn)SH水平明顯升高；與CTX模型組比較，YKos組E2水平明顯升高，F(xiàn)SH水平明顯下降，提示YKos可改善卵巢功能。與CTX模型組比較，YKos組平均黃體數(shù)、平均著床數(shù)及活胎率明顯升高，且死胎率和吸收胎率明顯降低，表明YKos可改善雌性大鼠的生育能力。

GnRHR是介導GnRH功能不可或缺的物質，主要在次級卵泡、竇卵泡和排卵前顆粒細胞中陽性表達，GnRH通過結合促性腺細胞中特異性極高的GnRHR，進而調節(jié)和控制卵泡成熟和激素的生成［8］。FSHR主要分布在卵泡表面，通過與垂體分泌的FSH結合從而發(fā)揮調節(jié)卵泡發(fā)育的作用［9-11］。本研究結果顯示，CTX模型組雌性大鼠卵巢中GnRHR和FSHR蛋白表達明顯降低，這可能與CTX破壞了卵巢中卵泡結構，并使顆粒細胞明顯減少有關。與CTX模型組比較，YKos組GnRHR和FSHR蛋白表達明顯上升，提示YKos可上調卵巢早衰大鼠卵巢中GnRHR和FSHR的表達，進而緩解卵巢中激素異常狀況，維持卵巢正常的生殖功能。

綜上所述，YKos可有效修復CTX誘導的雌性大鼠生殖系統(tǒng)損傷，恢復卵巢功能，其作用機制可能與調節(jié)GnRHR-FSHR信號通路有關。