吉西他濱和髓細(xì)胞白血病基因1小干擾RNA納米藥物的制備和表征

王艷冰，程佳禾，高鋒華，蔣興偉，竇向梅，于 群

（1.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院衛(wèi)生勤務(wù)與血液研究所，北京 100850；2.沈陽(yáng)藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110016；3.College of Letters and Science，University of California，Berkeley，CA 94720，USA；4.北京市十一學(xué)校，北京 100039）

胰腺癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，在癌癥死亡原因中位列第7［1］。吉西他濱（gemcitabine，Gem，2，2-二氟脫氧胞苷）作為20世紀(jì)90年代美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)的治療胰腺癌的一線藥物，能明顯改善患者的生活質(zhì)量并延長(zhǎng)生存期，被譽(yù)為胰腺癌治療的金標(biāo)準(zhǔn)［2］。雖然術(shù)后輔以Gem和其他細(xì)胞毒性藥物聯(lián)合化療，可將胰腺癌患者的5年生存率提高到30%，但中位生存期僅為26個(gè)月［3］。因此，迫切需要探索更加有效的治療方案。

髓細(xì)胞白血病基因1（myeloid cell leukemia-1，MCL-1）是BCL-2家族成員中功能獨(dú)特的一個(gè)分子，參與抗細(xì)胞凋亡和線粒體呼吸，為胚胎發(fā)育和成人多細(xì)胞系生存所必需［4-5］。MCL-1在胰腺癌等多種腫瘤中表達(dá)異常升高，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性生長(zhǎng)和耐藥性產(chǎn)生，是腫瘤治療理想的分子靶標(biāo)。本研究集體前期研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）選擇性地降低胰腺癌細(xì)胞的MCL-1基因表達(dá)，不僅可以直接抑制腫瘤生長(zhǎng)，還可以顯著提高胰腺癌對(duì)化療藥物的敏感性［6-7］。但是裸露的siRNA在血液循環(huán)中很容易降解，半衰期很短（＜1 h），到達(dá)腫瘤組織的少量siRNA則因?yàn)楦哂H水性、大分子質(zhì)量和負(fù)電荷，很難穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞。采用納米技術(shù)包裹MCL-1siRNA（siMCL-1）和Gem，制成納米藥物則有可能克服該障礙。

用于siRNA體內(nèi)遞送的脂質(zhì)體和聚合物具有負(fù)載量大、可修飾性強(qiáng)、細(xì)胞毒性低和便于保存等優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)用于制成納米藥物，并被批準(zhǔn)用于臨床試驗(yàn)和臨床治療［8］。本研究采用一種磷脂-聚合物混合型納米載體磷脂雙分子層覆蓋的ε-多聚賴氨酸改性的單甲氧聚乙二醇-羥基乙酸〔monomethoxy poly（ethylenecol）-poly（lactic-co-glycolic acid），mPEG-PLGA〕共聚物（lipid bilayer coated ε-polylysine-modified mPEG-PLGA nanoparticles，LENP）制備治療胰腺癌的納米藥物L(fēng)ENP-Gem-siMCL-1，包括裝載化療藥物Gem和吸附siMCL-1的聚合物核心、覆蓋在聚合物核心外面的磷脂雙分子層以及最外層的聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）表面修飾，并對(duì)制備的納米藥物L(fēng)ENP-Gem-siMCL-1進(jìn)行系統(tǒng)的特性表征和體外抗腫瘤活性檢測(cè)，為臨床治療胰腺癌提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑和儀器

人胰腺癌BxPC-3和PANC-1細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（American Type Culture Collection），用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

我們前期優(yōu)化的siMCL-1（5’-CCAAGAAAGCUGCAUCGAA-3’）和非特異性陰性對(duì)照siRNA（siControl）［7］以及羧基熒光素FAM標(biāo)記的siMCL-1（FAM-siMCL-1）由上海生工生物技術(shù)公司合成。Gem和膽固醇購(gòu)自美國(guó)Sigma Aldrich公司；mPEG-PLGA購(gòu)自濟(jì)南岱罡生物科技有限公司；ε-多聚賴氨酸購(gòu)自鄭州拜納佛生物工程股份有限公司；聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）和卵磷脂購(gòu)自北京百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司；二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧聚乙二醇-2000〔distearoylphosphoethanolamine-methoxy（polyethylene glycol）-2000，DSPE-PEG-2000〕購(gòu)自西安瑞禧生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco BRL公司；溶酶體染料LysoTracker Red和細(xì)胞核染料4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；兔抗人MCL-1單抗和兔抗人α微管蛋白抗體單抗購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司；Odyssey標(biāo)記羊抗兔IgG抗體（二抗）購(gòu)自美國(guó)LI-COR生物公司。

納米粒度及Zeta電位分析儀（英國(guó)馬爾文儀器有限公司）；透射電子顯微鏡（美國(guó)FEI公司）；高效液相色譜UPLC1290（美國(guó)Agilent公司）；TiA1激光倒置共聚焦顯微鏡（日本NIKON公司）；蛋白電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；Odyssey?CLx顯像系統(tǒng)（美國(guó)Lincoln公司）；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱和MK3酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）。

1.2 LENP-Gem-siRNA的制備

LENP納米載體由一個(gè)陽(yáng)離子聚合物核心ENP和表面覆蓋的PEG化的磷脂雙分子層組成［9］。第一步，采用改良的復(fù)乳法制備陽(yáng)離子聚合物核心ENP-Gem-siRNA：稱取mPEG-PLGA溶解在1 mL二氯甲烷中，加入Gem水溶液0.2 mL，用細(xì)胞破碎儀超聲乳化，然后在乳液中加入2%PVA水溶液2 mL和一定量的ε-多聚賴氨酸（ε-多聚賴氨酸和mPEG-PLGA的質(zhì)量比為2.5∶1）進(jìn)行第2次超聲乳化。得到的乳液滴加到10 mL 0.6%PVA中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除有機(jī)試劑二氯甲烷。離心，將沉淀重新分散在去離子水中，即可獲得ENP-Gem。然后加入無(wú)RNA酶去離子水溶解的siRNA（siMCL-1或者siControl），通過(guò)靜電吸附作用將帶有負(fù)電荷的siRNA吸附在表面，離心，將納米顆粒重新分散在去離子水中，得到負(fù)載Gem和siRNA的陽(yáng)離子聚合物核心ENP-Gem-siRNA。第二步，通過(guò)超聲薄膜法進(jìn)行ENP表面的磷脂層自組裝：將卵磷脂、膽固醇、DSPE-PEG-2000按照60∶15∶12的質(zhì)量比溶于二氯甲烷，置于圓底燒瓶，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將有機(jī)試劑旋蒸去除，在瓶壁形成一層致密的磷脂雙分子層薄膜。將ENP-Gem-siRNA加入上述帶有磷脂雙分子層薄膜的圓底燒瓶，在超聲輔助下使磷脂雙分子層薄膜組裝到納米顆粒的表面，制備成負(fù)載Gem和siRNA的磷脂-陽(yáng)離子聚合物混合型納米顆粒LENP-GemsiRNA。離心15 500×g，10 min，將納米顆粒LENPGem-siRNA重新分散在去離子水中用于以下實(shí)驗(yàn)。

1.3 納米粒度和Zeta電位分析儀測(cè)量納米顆粒的粒徑分布和表面電位

在納米顆粒粒徑分布和表面電位的測(cè)量中，采用組成近似但性質(zhì)更穩(wěn)定的DNA代替siRNA［9］。根據(jù)1.2制備ENP，ENP-Gem，ENP-Gem-DNA和LENP-Gem-DNA溶于去離子水，利用納米粒度和Zeta電位分析儀，根據(jù)動(dòng)態(tài)光散射（dynamic light scattering，DLS）法測(cè)量各納米顆粒的粒徑分布，激光源為波長(zhǎng)為633 nm的He-Ne激光，固定散射角為90°。根據(jù)激光多普勒微量電泳法測(cè)量各納米顆粒表面的Zeta電位，根據(jù)其變化對(duì)聚合物納米顆粒的組裝進(jìn)行表征。以上測(cè)試均在25℃下進(jìn)行。

1.4 透射電鏡觀察納米顆粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)

取5 μL濃度為20 g·L-1的LENP，LENP-Gem或LENP-Gem-DNA乳液滴加在碳支撐膜的銅網(wǎng)上，常溫干燥后用2%醋酸雙氧鈾溶液5 μL對(duì)樣品進(jìn)行負(fù)染色2次，每次5 min。常溫干燥后，用透射電子顯微鏡觀察這3種納米顆粒的形貌，并測(cè)算其尺寸。

1.5 高效液相色譜（HPLC）測(cè)定LENP對(duì)Gem的包封率

新合成的LENP-Gem經(jīng)15 500×g離心10 min后，取上清用于HPLC儀分析其中Gem的濃度。HPLC色譜柱為C18反相柱（20 mL，4.6 mm×150 mm），進(jìn)樣量為20 μL。Gem的吸收波長(zhǎng)為270 nm，洗脫時(shí)間約為2 min。藥物包封率（%）=（初始時(shí)加入的Gem質(zhì)量-上清中未包載到LENP中的Gem質(zhì)量）/初始時(shí)加入的Gem質(zhì)量×100%，其中藥物質(zhì)量單位為mg。

1.6 共聚焦顯微鏡檢測(cè)LENP對(duì)siRNA的輸運(yùn)作用

為了觀察納米載體能否將siRNA有效輸運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，分別以綠色熒光素FAM和紅色熒光染料LysoTracker Red標(biāo)記siMCL-1和溶酶體。首先，在siMCL-1上修飾一個(gè)帶有綠色熒光的基團(tuán)（FAM），制備FAM-siMCL-1；再包載到LENP中制備LENP-FAM-siMCL-1。把胰腺癌細(xì)胞PANC-1接種入共聚焦顯微鏡專用皿，每孔1×105細(xì)胞。向細(xì)胞中加入LENP-FAM-siMCL-1（終濃度60 nmol·L-1），以未包載的裸FAM-siMCL-1作為對(duì)照，分別在37℃培養(yǎng)2和4 h。然后，加入紅色熒光的溶酶體染料LysoTracker Red繼續(xù)培養(yǎng)1 h；4%多聚甲醛固定，用DAPI將細(xì)胞核染成藍(lán)色。通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞對(duì)帶綠色熒光siMCL-1的攝取及其細(xì)胞內(nèi)定位，判斷LENP能否將siRNA有效輸運(yùn)到胰腺癌細(xì)胞內(nèi)。

1.7 Western印跡法檢測(cè)PANC-1細(xì)胞MCL-1蛋白表達(dá)

將PANC-1細(xì)胞接種入6孔板，每孔3×105細(xì)胞，分為5組，分別加入裸siMCL-1、空納米載體LENP、LENP-siControl和 LENP-siMCL-1處理，siControl和siMCL-1的終濃度是60 nmol·L-1，同時(shí)設(shè)生理鹽水對(duì)照組。在Opti-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基中37°C，5%CO2培養(yǎng)5 h，換成DMEM加10%胎牛血清完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后提取蛋白質(zhì)。用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量后，每組等量蛋白經(jīng)過(guò)12%SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，封閉，洗膜，加入抗MCL-1或抗α-微管蛋白抗體（稀釋比1∶1000）4°C孵育過(guò)夜；洗膜，加入熒光素標(biāo)記的二抗（稀釋比1∶2000）室溫避光孵育1 h；最后在Odyssey?CLx顯像系統(tǒng)下，用Gel-pro Analyzer軟件檢測(cè)蛋白條帶積分吸光度（integrated absorbance，IA）值。MCL-1蛋白相對(duì)表達(dá)水平用IAMCL-1/IAα微管蛋白比值表示。

1.8 MTT法測(cè)定PANC-1和BxPC-3癌細(xì)胞存活率

將胰腺癌PANC-1和BxPC-3細(xì)胞接種入96孔板，分為6組。LENP組：空納米載體對(duì)照；Gem組：?jiǎn)渭覩em處理；Gem+siMCL-1組：Gem和裸露的siMCL-1聯(lián)合處理；LENP-Gem組：納米載體包裹Gem藥物處理；LENP-Gem-siControl組：納米載體包裹Gem和對(duì)照siControl處理；LENP-GemsiMCL-1組：納米載體包裹Gem和siMCL-1處理。每組4復(fù)孔，siControl和siMCL-1的終濃度是60 nmol·L-1，Gem的終濃度為32 μmol·L-1。在Opti-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基中37°C，5%CO2培養(yǎng)5 h，換成DMEM加10%胎牛血清完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔加入 MTT（5 g·L-1）10 μL，4 h 后加入 10%SDS 100 μL溶解紫色結(jié)晶，2 h后利用酶標(biāo)儀讀570nm吸光度值（A570nm）。細(xì)胞存活率（%）=各組A570nm/LENP組A570nm×100%。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)均以±s表示，用GraphPad Prism 6.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間比較采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 納米顆粒粒徑分布、Zeta電位、電鏡結(jié)構(gòu)和包封率的表征

為了確證在納米藥物合成過(guò)程中各組分是否進(jìn)行了有效組裝，對(duì)制備過(guò)程中的各納米顆粒進(jìn)行表征。如圖1所示，DLS檢測(cè)到納米載體核心顆粒ENP的平均水合粒徑為154.50 nm，依次包載Gem和DNA后，ENP-Gem和ENP-Gem-DNA的平均水合直徑分別為183.54和191.00 nm；當(dāng)核心顆粒表面覆蓋了PEG化的磷脂雙分子層，LENP-Gem-DNA的平均水合直徑增至213.50 nm。相應(yīng)地，采用激光多普勒微量電泳法測(cè)量這4種納米顆粒表面的Zeta電位，ENP，ENP-Gem，ENP-Gem-DNA和LENP-Gem-DNA的表面電位分別為11.50，6.35，-12.60和-22.60 mV，提示在納米藥物L(fēng)ENP-GemsiMCL-1合成過(guò)程中各組分依次進(jìn)行了有效的組裝。

隨后對(duì)LENP，LENP-Gem和LENP-Gem-DNA的內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察。在電子透射電鏡下（圖2），可以看到3種納米顆粒為結(jié)構(gòu)和大小分布均勻的球形粒子，具有典型的核殼結(jié)構(gòu)。LENP的直徑約190 nm，而LENP-Gem和LENP-Gem-DNA直徑升至約210 nm，提示Gem和核酸成功包載。

通過(guò)HPLC對(duì)Gem的包載效率進(jìn)行了檢測(cè)。在紫外可見(jiàn)吸收光譜中，Gem吸收峰的波長(zhǎng)為270 nm，將其設(shè)為HPLC檢測(cè)Gem時(shí)的檢測(cè)波長(zhǎng)。如圖3所示，LENP-Gem的色譜圖具有Gem的特征峰，說(shuō)明Gem被成功包載到了LENP中。其次，根據(jù)前期優(yōu)化的mPEG-PLGA與Gem質(zhì)量比，測(cè)量出初始時(shí)加入Gem 5 mg時(shí)，上清中未包載到納米材料中的Gem質(zhì)量為3.77 mg。LENP對(duì)Gem的包封率為24.6%。

2.2 LENP對(duì)siRNA的輸運(yùn)作用

如圖4所示，LENP-FAM-SiMCL-1與PANC-1細(xì)胞在孵育2 h后，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的紅色和綠色熒光信號(hào)。4 h后細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，2種信號(hào)相互疊加形成橙色熒光。有的細(xì)胞中2種顏色的熒光則分離開(kāi)來(lái)，提示siMCL-1已經(jīng)從溶酶體逃逸出來(lái)并進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中。由此說(shuō)明，LENP能夠?qū)iRNA有效輸運(yùn)至胰腺癌細(xì)胞內(nèi)部，并且通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞途徑進(jìn)入溶酶體中。

Fig.1 Size distribution of nanoparticles measured by dynamic light scattering （DLS）.The nanoparticles were fabricated reproducibly by combining a double-emulsion method for polymer nanocore and ultrasound assisted self-assembly of a lipid film for lipid shell.The size distribution of four nanoparticles was measured by DLS equipped with a He-Ne laser beam at a wavelength of 633 nm and a fixed scattering angle of 90°。The average diameters of ENP（nanoparticle core，A），ENP-Gem［ENP encapsulated with gemcitabine（Gem），B］，ENP-Gem-DNA（ENP encapsulated with Gem and DNA，C），and LENP-Gem-DNA（LENP encapsulated with Gem and DNA，D）were 154.50，183.54，191.00 and 213.50 nm，respectively.

Fig.2 Structure of nanoparticles observed by transmission electron microscopy（TEM）.LENP（A），LENP-Gem（B）and LENP-Gem-DNA（C）（5 mL，20 g·L-1）were deposited onto a carbon-coated copper grid，respectively，negatively stained twice with 2% uranyl acetate solution，and viewed under TEM.

Fig.3 Gem in LENP-Gem measured by high performance liquid chromatography（HPLC）.The synthesized LENPGem was centrifuged and the supernatant was collected for HPLC assay.The eluent was monitored at 270 nm for Gem.Upper peak：free Gem；lower peak：Gem in the supernatant of synthesized LENP-Gem.

Fig.4 Transportation of siRNA into PANC-1 cells by nanoparticle LENP.PANC-1 cells were seeded at a density of 1×105 cells per well and incubated overnight.After being treated with LENP-FAM-SiMCL-1（green）for 2 or 4 h，the cells were stained with Lyso-Tracker Red（red）for another 70 min，fixed，stained nucleus with 4’6-diamidino-2-phenylindole（DAPI）（blue），and observed under a confocal laser-scanning microscope.

2.3 LENP-siMCL-1抑制胰腺癌細(xì)胞MCL-1蛋白表達(dá)

Western印跡結(jié)果（圖5）所示，與LENP組（IA值為0.246）比較，LENP-siControl組PANC-1細(xì)胞MCL-1蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化，LENP-siMCL-1組MCL-1蛋白表達(dá)則顯著降低至57.7%（IA值為0.142）。而裸siMCL-1組與生理鹽水對(duì)照組（IA值為0.547）相比未發(fā)現(xiàn)明顯下調(diào)。提示進(jìn)入胰腺癌細(xì)胞內(nèi)的siMCL-1能夠特異性抑制MCL-1蛋白表達(dá)；如無(wú)LENP納米載體輔助，裸siRNA很難通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散機(jī)制進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮作用。

Fig.5 Knockdown of MCL-1 expression by LENP-siMCL-1 in PANC-1 cells assayed by Western blotting.PANC-1 cells were treated with saline，free siMCL-1，LENP，LENP-siControl or LENP-siMCL-1 for 6 h and incubated for another 48 h.

2.4 LENP-Gem-siMCL-1明顯抑制胰腺癌細(xì)胞存活

如表1所示，與LENP組比較，Gem，Gem+siMCL-1，LENP-Gem，LENP-Gem-siControl和LENP-Gem-siMCL-1組PANC-1細(xì)胞存活率均明顯降低（P＜0.01），LENP-Gem-siMCL-1組最低，為42.7%；與Gem組相比，Gem+siMCL-1組細(xì)胞存活率無(wú)顯著性差異；LENP-Gem-siControl組與LENP-Gem組比較亦無(wú)明顯變化；與LENP-GemsiControl組比較，LENP-Gem-siMCL-1組PANC-1細(xì)胞存活率進(jìn)一步降低（P＜0.01）。LENP-GemsiMCL-1對(duì)BxPC-3細(xì)胞存活的抑制作用與對(duì)PANC-1細(xì)胞的作用相似（表2）。由此提示，LENPGem-siMCL-1能夠提高胰腺癌細(xì)胞對(duì)Gem的敏感性，增強(qiáng)Gem的細(xì)胞殺傷效應(yīng)。

Tab.1 Viability of PANC-1 cells treated with LENPGem-siMCL-1

Tab.2 Viability of BxPC-3 cells treated with LENPGem-siMCL-1

3 討論

目前納米藥物的研究進(jìn)展非常迅速，因其獨(dú)特的性質(zhì)和優(yōu)勢(shì)而成為腫瘤治療的熱點(diǎn)，美國(guó)、加拿大和歐洲一些國(guó)家已經(jīng)有納米化療藥物上市。我國(guó)對(duì)納米藥物治療腫瘤的研究也越來(lái)越受到重視，如紫杉醇脂質(zhì)體治療卵巢癌、多柔比星脂質(zhì)體治療艾滋病相關(guān)的卡波肉瘤等，已經(jīng)進(jìn)入臨床使用［10-11］。除了作為傳統(tǒng)化療藥物的載體，納米載體在基因藥物遞送過(guò)程中也顯示出巨大潛力，包括siRNA、反義核苷酸、信使RNA和DNA寡核苷酸抑制劑等，很大程度上提高了基因治療的安全性［12-13］。用于siRNA體內(nèi)遞送的納米載體主要有脂質(zhì)體和聚合物兩類，前者是最早被用作納米載體的生物材料，通常由磷脂和膽固醇類構(gòu)成，后者主要包括聚乙烯基吡啶、聚賴氨酸和聚乙烯亞胺等。陽(yáng)離子聚合物和陽(yáng)離子脂質(zhì)體通過(guò)靜電吸附作用可以有效地大量吸附帶負(fù)電荷的siRNA。最近出現(xiàn)的新型磷脂-聚合物混合型納米載體兼具二者的優(yōu)勢(shì)，顯現(xiàn)出良好的臨床應(yīng)用前景［14-15］。

本研究正是采用了磷脂-聚合物混合型納米載體LENP實(shí)現(xiàn)共同遞送化療藥物Gem和siMCL-1。此設(shè)計(jì)具有3個(gè)突出的特點(diǎn)：①聚合物核心可以有效包載藥物和吸附siRNA，為整個(gè)納米顆粒提供優(yōu)異的力學(xué)穩(wěn)定性；②覆蓋在聚合物核心外面的磷脂單分子或雙分子層增強(qiáng)納米顆粒的生物相容性，并將聚合物核心和外界隔離，避免藥物分子的滲漏和水分子對(duì)聚合物核心的滲透，減緩聚合物分子的水解；③最外層的PEG表面修飾賦予了納米顆?！半[身”性質(zhì)，減少血清蛋白吸附，避免網(wǎng)狀內(nèi)體系統(tǒng)對(duì)納米顆粒的清除，利于納米顆粒逃逸免疫清除，延長(zhǎng)體內(nèi)循環(huán)時(shí)間［16］。

納米藥物L(fēng)ENP-Gem-siMCL-1由一個(gè)陽(yáng)離子聚合物核心和PEG化的磷脂雙分子層構(gòu)成。首先，通過(guò)復(fù)乳法合成mPEG-PLGA聚合物核心，在合成過(guò)程中摻入一定量的帶有正電荷的ε-多聚賴氨酸，水溶性的Gem被包裹在親水性內(nèi)核，siMCL-1通過(guò)靜電作用吸附在核心表面。然后通過(guò)薄膜超聲法，在吸附siMCL-1的聚合物核心表面覆蓋一個(gè)PEG化的磷脂雙分子層，形成納米顆粒的保護(hù)層，有助于更多納米顆粒通過(guò)高通透性和滯留效應(yīng)（enhanced permeability and retention effect，EPR）在腫瘤組織內(nèi)靶向富集，并最終殺傷腫瘤細(xì)胞。本研究采用了4種方法對(duì)納米藥物L(fēng)ENP-Gem-siMCL-1進(jìn)行表征和鑒定，即DLS測(cè)量納米顆粒的粒徑分布、激光多普勒微量電泳法測(cè)量納米顆粒表面的Zeta電位、透射電鏡觀察納米顆粒的結(jié)構(gòu)和大小以及HPLC測(cè)量納米顆粒中Gem的特征峰。結(jié)果表明，納米藥物符合設(shè)計(jì)要求，粒徑約200 nm，大小均一，表面帶有負(fù)電荷，并且能夠有效包載Gem和siMCL-1。

納米藥物和普通藥物相比具有截然不同的體內(nèi)性質(zhì)，其中最突出的優(yōu)勢(shì)是具有治療腫瘤的被動(dòng)靶向效應(yīng)［8］。由于腫瘤細(xì)胞新生內(nèi)皮細(xì)胞不連續(xù)性，粒徑約200 nm的粒子可以通過(guò)血管壁進(jìn)入組織間隙。研究表明，將化療藥物（如Gem）包載于納米載體中可將藥物在腫瘤部位的富集提高5～10倍。這種基于納米藥物粒徑及EPR效應(yīng)的靶向稱為被動(dòng)靶向。本研究對(duì)LENP-Gem-siMCL-1的藥物輸運(yùn)和腫瘤抑制作用進(jìn)行檢測(cè)，表明Gem和siMCL-1可以被有效地聯(lián)合輸運(yùn)到胰腺癌細(xì)胞內(nèi)，靶向抑制MCL-1蛋白表達(dá)，并且在體外實(shí)驗(yàn)中明顯抑制胰腺癌細(xì)胞PANC-1和BxPC-3存活，抑制率分別達(dá)到57.3%和66.0%。下一步將建立胰腺癌的動(dòng)物模型，對(duì)LENP-Gem-siMCL-1的體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

本研究采用了磷脂-聚合物混合型納米載體LENP同時(shí)將Gem和siMCL-1有效地輸運(yùn)到腫瘤細(xì)胞內(nèi)，使其發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。LENP的各組分都是經(jīng)美國(guó)FDA批準(zhǔn)的用于臨床藥物或食品添加劑的材料，易被臨床接受。下一步將評(píng)價(jià)該納米藥物在體內(nèi)的抗腫瘤效應(yīng)，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。