miRNA 在口腔正畸領域研究進展

張媛媛 王小玢 胡泊洋 田玉樓

作者單位：110002 沈陽，中國醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院·附屬口腔醫(yī)院，遼寧省口腔疾病重點實驗室（田玉樓為通訊作者）

miRNA 是一類內源性長度約為 22 個核苷酸的保守序列非編碼 RNA，miRNA 通過與靶 mRNA 的3'端非翻譯區(qū)相結合，影響靶 mRNA 的穩(wěn)定性或抑制其翻譯，從而對靶基因進行轉錄后表達的調控。miRNA 特異性調控細胞生長、細胞分化、細胞凋亡，進而調控機體的生長發(fā)育、疾病的發(fā)生發(fā)展。本文就 miRNA 在機械力、成骨分化、破骨破分化方向的研究現狀進行論述，闡明 miRNA 在正畸牙齒移動過程中的研究進展。

一、miRNA 與正畸牙齒移動

正畸牙齒移動的機理是機械外力作用于牙齒產生張力側和壓力側，壓力側 RANKL 表達上調，導致破骨細胞分化及骨吸收，同時張力側成骨生長因子（TGF-β、OPG）等表達升高，促使 MSCs 分化為成骨細胞從而導致骨的新生，兩者處于相對平衡狀態(tài)并最終導致牙齒位置的移動[1]。牙齒移動正是在成骨細胞的骨形成作用與破骨細胞的骨吸收作用這樣一個成骨 - 破骨的動態(tài)平衡中進行。

Chen 等[2]發(fā)現 miR-21 通過靶向 PDCD4 調控下游基因 C-fos，從而調控正畸牙齒移動過程中壓力側與張力側的破骨細胞生成及張力側成骨分化，進而影響正畸牙齒移動。另外，Liu 等[3]進行大鼠牙齒移動動物實驗發(fā)現 miR-503-5p 在張力側牙槽骨中表達明顯降低，體內過表達 miR-503-5p 后，成骨標志基因 Runx2、ALP mRNA 水平和蛋白水平的表達也下降，牽張側牙槽骨骨形成受到抑制。表明miR-503-5p 在大鼠牙齒移動過程中對牽張側牙槽骨形成起重要的負性調控作用。Yu 等[4]在大鼠正畸牙齒移動過程中，發(fā)現 MiR-34a 可增強正畸作用力下的牙槽骨重塑，使 Runx2、ColI 表達升高、牙槽骨合成代謝指數上調從而降低正畸牙齒運動速度。

二、miRNA 與機械力

機械外力是正畸牙齒移動的主要手段，也是調節(jié)骨形成與牙周改建的重要因子[5]。體外實驗證明，在機械力引起的細胞功能變化中，miRNA 起到重要作用。周期性拉伸可以促進 miR-21 表達，在機械力作用下，人來源 PDLSCs 的成骨分化能力增加，且隨著時間延長，miR-21 表達升高。并且 miR-21 通過靶向調控 ACVR2B，從而調節(jié) PDLSCs 成骨細胞的分化[6]。在 miRNAs 響應機械力影響牙周膜干細胞研究中發(fā)現，在壓力作用后的 PDLSCs 中，miR-146a下調 NF-kappa B 信號通路，進而調控 PDLSCs 的成骨分化能力，NF-kappa B 信號通路在成骨分化中有重要作用[7]。在壓力作用下的 PDLSCs 中，miR-218靶向下調 RUNX2 來調控 PDLSCs 的成骨分化[8]。Liu等[3]在實驗過程中通過 miRNA 基因芯片篩選出在牽張力誘導下大鼠骨髓間充質干細胞向成骨分化過程中表達有明顯變化的 miR-503-5p，并驗證了其對骨髓 間充質干細胞向成骨細胞分化的抑制作用。Qi等[9]對流體剪切力誘導的牙周膜細胞成骨分化樣本芯片檢測發(fā)現 6 種 miRNAs 的表達變化具有統(tǒng)計學意義，并進行 RT-PCR 驗證。Wu[10]等通過機械張力引導 PDLCs 向成骨分化，高通量測序結果發(fā)現 9 種成骨相關的 miRNAs 表達有顯著差異，并進行大鼠牙齒移動動物實驗顯示有 6 種 miRNAs 變化有統(tǒng)計學意義。Zuo[11]的研究則發(fā)現牽張力敏感的 miR-103a通過作用于基因 Runx2，降低 Runx2 蛋白水平表達，進而抑制在周期性牽張力作用下誘導的成骨細胞分化及骨形成。同時在吊尾小鼠的研究中發(fā)現miR-103a 在骨組織的表達升高，降低 miR-103a 的表達可緩解缺乏力刺激所導致的骨丟失。流體剪切力 可通過對 miR-23b-3p 的抑制作用使E-Tmod41的表達上調，從而促進血紅蛋白形成過程中 F- 肌動蛋白細胞骨架的重塑[12]。另外，也有研究表明，在牽 張力作用下誘導的MC3T3-E1細胞成骨分化過程中，miR-218、miR-191 * 、miR-3070a 和 miR-33表達變化明顯，這些 miRNAs 對應力反應敏感[13]。在張應力作用下，miR-154-5p 通過靶向Wnt/PCP 通路阻止脂肪來源的間充質干細胞的成骨分化[14]，miR-195-5p 靶向WNT3A、FGF2、BMPR1A 抑 制PDLSCs 的成骨分化[15]。

三、miRNA 與骨平衡

目前，已確認多種 miRNA 在骨形成過程中起重要的調控作用，在動物胚胎時期的骨形成階段、骨骼發(fā)育階段以及成熟階段的過程中起到非常重要的作用[16]。特異性敲除 miRNA 合成所需的 Dicer 酶基因小鼠，會出現所有 miRNA 形成的缺陷，這些基因缺陷小鼠出生時骨骼大小明顯比正常小鼠小，表明miRNAs 在動物胚胎發(fā)育時對骨形成發(fā)揮重要調控作用[17]。骨質疏松癥是全身性骨代謝異常導致的疾病，臨床 研 究發(fā)現，在骨質疏松 患 者骨組織中，miR-21，miR-23a，miR-24，miR-25，miR-100 和miR-125b 呈現明顯高表達。這既表明 miRNAs 在骨質疏松中有明顯提示作用，又提示它在骨平衡中有重要作用[18]。

1.miRNA 與成骨分化：研究發(fā)現一些特異性miRNAs 及其作用靶點，通過調節(jié)靶基因 mRNA 的表達，從而調控成骨分化中某些重要信號通路的關鍵調節(jié)因子及受體表達水平[19]。Zhang 等[20]研究發(fā)現，miRNA-335-5p 能夠直接對Wnt通路抑制劑DKK1 產生負性調控作用，從而促進 C3H10T-1/2、MC3T3-E1、MLO-A5、MLO-Y4等多種成體干細胞的成骨向分化過程。Tilde Eskildsen 等[21]向人骨髓間充質干細胞內轉染 miRNA-138 過表達質粒時，其骨形成能力隨之下降，而當向人骨髓間充質干細胞內轉染 miRNA-138 siRNA 后，其骨形成能力增強，提示 miRNA-138 與成骨密切相關。同時利用熒光素酶報告基因技術檢測發(fā)現 miRNA-138 的靶基因是點狀黏附激酶（FAK），miRNA-138 通過抑制 FAK的表達，使 FAK-ERK1/2 信號通路受到抑制，最終抑制人骨髓間充質干細胞成骨的分化。過 表 達miRNA-20a 可特異性沉默 PPARγ，Bambi 和 Criml（PPARγ 是 BMP/Runx2 信號通路的負性調節(jié)因子，而 Bambi 和 Criml 是 BMP 通路的拮抗劑），同時證明，miRNA-20a 可靶向 PPARγ，并與 BMP 信號通路協(xié)同調節(jié)人間充質干細胞的成骨分化[22]。Itoh T等[23]利用鼠前體成骨細胞 MC3T3-E1 作為實驗對象，使用 BMP-2 誘導 MC3T3-E1 細胞的成骨分化，同時將 miR-141 和 miR-200a 轉染到經誘導后的細胞當中，實驗結果發(fā)現 Dix5mRNA 表達明顯降低，提示 miR-141 和 miR-200a 在翻譯水平上對 Dix5發(fā)揮抑制作用。Wang 等[24]在老年骨折患者中發(fā)現骨組織骨量顯著降低，檢測骨組織發(fā)現 miRNA-214表達水平升高。體內試驗進一步證實 miRNA-214對骨的形成具有負向調節(jié)作用，同時經過體外實驗發(fā) 現 miR-214可通過靶向調節(jié)轉錄激活因子4（ATF4），從而抑制成骨分化。Fan 等[25]的研究表明miR-221-5p 可通過靶向 smad3 來調控骨髓瘤骨病的成骨分化。在 miR-221-5p 抑制后，PI3K/AKT/mTOR 信號通路被激活，從而增加間充質干細胞成骨分化能力。Xu 等[26]研究骨質疏松癥患者中 miR-889 的表達高于健康組，miRNA-889 靶 向WNT7A 通過 Wntβ-catenin 信號通路抑制成骨細胞的分化。在PDLSCs 的成骨分化過程中，miR-132水平下調。miR-132通過靶向GDF5以及激活NF-κB 軸來抑制成骨細胞的分化[27]。

2.miRNA 與破骨分化：破骨細胞是體內唯一進行骨吸收活動的細胞，具有顯著溶骨、吞噬和消化能力，在牙槽骨吸收過程中具有重要作用，miRNAs 可通過影響轉錄因子的表達，直接或間接地調控破骨細胞代謝及分化[28]。

Sugatani 等[29]利用分子生物學技術在小鼠單核 /巨噬前體細胞向破骨細胞分化過程中成功分離出miRNA，基因芯片的檢測結果發(fā)現在前體細胞分化過程中 miR-21 的高表達差異具有顯著性，并且證實在 RANKL 的調控下，miR-21 在破骨細胞分化中發(fā)揮至關重要作用。在 RANKL 誘導的破骨細胞分化過程中，上調的 c-Fos 可使miR-21上調，上調的miR-21 使 PDCD4蛋白表達水平下降，即c-Fos/miR-21/PDCD4 通路在調控破骨細胞分化過程至關重要。在 RANKL誘導的骨髓巨噬細胞（BMMs） 向破骨細胞 分 化 的 過 程 中，Fumitaka Mizoguchi 等[30]發(fā) 現 miR-31明顯高表達，其表達 含量是 BMMs 中的 18 倍，并采取小干擾 RNA 特異性抑制 BMM，發(fā)現 miR-31 表達明顯降低，同時發(fā)現RhoA 作為 miR-31 的靶基因明顯上調。抑制 RhoA的表達可以明顯的修復 miR-31 下調引起的破骨細胞損害，進而抑制骨吸收。Kurowska 等[31]通過敲除骨髓巨噬細胞（BMMs）的 Dicer 基因，發(fā)現 miRNA-155的表達下降，并上調其靶基因 SHIP，破骨細胞的形成 明顯減少。Guo 等[32]發(fā)現在 RANKL 和 M-CSF 誘導 CD14+PBMCs 向破骨細胞分化的過程中，miRNA-125a 的表達明顯降低，另外，miRNA-125a高表達使破骨細胞的形成受阻，并且抑制 TRAF6 及NFATc1 的表達。Ce Dou 等[33]發(fā)現在 RANKL 與M-CSF 誘導的 RAW264.7 細胞向破骨細胞分化的過程中，miR-7b 的表達明顯下降。進一步實驗研究發(fā)現 miR-7b 通過降低靶基因 DC-STAMP 的表達，從而抑制 Nfatc1，c-Fos，Akt，Irf8，Mapk1 和 Traf6 等其它融合基因和關鍵調節(jié)因子的表達，進而發(fā)揮著調控破骨 細 胞的分化及其前體細 胞 的融合作用。Youngkyun Lee 等[34]研究發(fā)現在 RANKL 誘導的小鼠骨髓巨噬細胞 （BMMs） 分化中，miR-124 表達降低，BMMs 被 pre-miRNA-124 轉染后，通過抑制NFATc1 的表達從而調控 BMMs 向破骨細胞分化。Kim 等[35]發(fā)現在破骨細胞前體中 miRNA-26a 抑 制劑能通過上調 CTGF 的表達水平從而促進破骨細胞的生成，導致骨吸收發(fā)生。Zhao 等[36]發(fā)現骨髓巨噬細胞來源的破骨細胞分化過程中，miR-340 通過靶向MITF，下調 MITF 的 mRNA 及蛋白水平，從而抑制破骨細胞的分化。Li 等[37]在絕經后骨質疏松癥患者血清中檢測發(fā)現 miR-133a 上調，并與患者的腰椎骨密度呈負相關。體外實驗進一步證明下調 miR‐133a 可以抑制 RANKL 誘導的破骨細胞形成，動物實驗可減少去卵巢大鼠的骨丟失。

四、miRNA 與炎癥反應

miRNA 可通過影響免疫細胞的分化、成熟以及功能來調節(jié)自身免疫和炎癥反應，從而參與多種炎癥相關性疾病[38]。正畸牙齒移動是周期性牙周膜和骨組織吸收和重塑的過程，同時也是非感染性、微創(chuàng)傷性的炎癥反應過程，在該過程中，炎癥細胞激起分泌的炎癥相關因子具有重要意義。在 TNF-α 誘導的小鼠 BMMs 向破骨細胞分化過程中，微陣列篩選出 miR-378，miR-21，miR-29b，miR-146a，miR-155，miR-210高表達，miR-223 低表達[39]。轉錄因子RBP-J 是被證實的在 TNF-α 誘導的破骨細胞分化和骨吸收過程中發(fā)揮關鍵作用[40]。Miller[41]發(fā)現miR-182 通過抑制 Foxo3 和 Maml1 而促進 TNF-α誘導的破骨細胞生成，并且RBP-J可通過抑制miR-182 的生成，進而抑制 TNF-α 誘導的破骨細胞生成。