辣木多糖除蛋白的工藝技術(shù)

初雅潔

摘 要：本文對辣木多糖除蛋白的工藝進(jìn)行了研究，以辣木蛋白脫除率和多糖保留率為指標(biāo)，比較三氯乙酸法、Sevage法、木瓜蛋白酶法的除蛋白效果，并采用單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化木瓜蛋白酶法除蛋白的工藝。結(jié)果表明：木瓜蛋白酶法除蛋白工藝較簡單，且除蛋白的最佳工藝為酶解時(shí)間1.5 h、溫度60 ℃、pH=6.0時(shí)蛋白脫除率和多糖保留率均較高。

關(guān)鍵詞：辣木;多糖;除蛋白;工藝研究

Abstract：In this paper， the process of removing the protein of Spicywood Polysaccharide was studied， and the removal rate of Spicywood Polysaccharide and the protection of polysaccharide were studied. Compared with trichloroacetic acid， Sevage and papain， the single factor experiment was used to optimize the process of papain. The results showed that the protein was removed by papain enzyme. The process is simple， and the best process for protein removal is enzymatic hydrolysis time 1.5 h、temperature 60 ℃， pH=6.0， protein removal rate and polysaccharide retention rate are higher.

Key words：Spicewood; Polysaccharide; Deprotein; Process research

中圖分類號：R284.2

辣木（Moringa oleifera Lam.）起源于印度，屬于熱帶、亞熱帶多功能植物類別，并以常綠或者半落葉形態(tài)存在。因辣木葉片與果莢含各種礦物質(zhì)以及維生素等使辣木已經(jīng)成為人們重點(diǎn)關(guān)注與研究的植物類型。結(jié)合相關(guān)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，辣木在人體必需氨基酸的含量表現(xiàn)方面，明顯要比世界衛(wèi)生組織推薦攝入標(biāo)準(zhǔn)高[1]。據(jù)資料顯示，辣木中的鈣元素含量及蛋白質(zhì)含量遠(yuǎn)比牛奶中的物質(zhì)含量高得多，可高達(dá)4倍和2倍左右。其中，鉀元素含量比香蕉中的含量高出3倍左右、維生素A含量比胡蘿卜高出4倍左右。結(jié)合當(dāng)前發(fā)展情況來看，辣木憑借自身豐富的營養(yǎng)價(jià)值已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療保健與飲食衛(wèi)生領(lǐng)域當(dāng)中，發(fā)展前景較為寬闊。

多糖物質(zhì)一般廣泛存在于動植物以及微生物細(xì)胞壁中，是生物體重要生物分子之一。近些年來，隨著植物多糖的生物活性逐漸被人們認(rèn)知，它憑借自身獨(dú)特活性以及低毒效應(yīng)在醫(yī)療臨床應(yīng)用中發(fā)揮了較大價(jià)值。但是多糖本身結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜且質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不易被控制，再加上部分多糖在天然產(chǎn)物中含量較低、不易被分離，導(dǎo)致多糖研究與臨床應(yīng)用頻頻受阻。但從客觀角度上來看，我國多糖資源較為豐富，尤其是中草藥植物中的多糖成分較多，在開發(fā)潛力方面表現(xiàn)較為明顯。而辣木作為一種功能性植物，內(nèi)部含有豐富的多糖物質(zhì)，可以被應(yīng)用于醫(yī)療保健與飲食衛(wèi)生領(lǐng)域中，結(jié)合當(dāng)前研究情況來看，關(guān)于辣木多糖的研究工作主要集中在提取工藝以及含量測定方面。對于辣木多糖分離純化工藝的研究內(nèi)容相對較少。因此，本文研究工作主要以確定最佳的辣木多糖脫蛋白工藝為主，以期為辣木粗多糖分離純化提供一定的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

無水乙醇、辣木粗糖、蒸餾水、氯仿、正丁醇、木瓜蛋白酶、考馬斯亮藍(lán)、濃硫酸、苯酚等。

1.2 儀器與設(shè)備

分光光度計(jì)、便攜式酸度計(jì)、離心機(jī)、搖床機(jī)、數(shù)顯恒溫水浴鍋、pH計(jì)、海爾冰箱等。

1.3 研究方法

1.3.1 辣木多糖的提取

辣木粉→石油醚脫脂→80%乙醇回流提取兩次→熱水浸提→抽濾→減壓濃縮→無水乙醇沉淀→靜置過夜→無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌→減壓干燥→辣木粗多糖[2-4]。

1.3.2 Sevage法除蛋白

取多糖樣液配成5%的水溶液，加入1/3體積的Sevage試劑（氯仿∶正丁醇=4∶1）充分振搖10 min，離心分離15 min（4 000r·min-1），取上清液，重復(fù)上述步驟，測定蛋白和多糖吸光度[5]。

1.3.3 三氯乙酸法[6]

取多糖樣液50 mL，加入50 mL的3%三氯乙酸，使溶液均勻混合。于5～10 ℃冰箱中放置過夜，離心去除沉淀，測定蛋白和多糖的吸光度。

1.3.4 木瓜蛋白酶法

取10 mL多糖提取液，加入0.2 mL木瓜蛋白酶液（15 g·L-1），55 ℃酶解1.5 h，反應(yīng)結(jié)束后沸水浴10 min，然后冷卻至室溫，4 000 r·min-1離心10 min后去除沉淀，測定蛋白和多糖吸光度[7]。

1.3.5 木瓜蛋白酶法除蛋白單因素試驗(yàn)

（1）酶解時(shí)間對蛋白去除率的影響。分別取10 mL多糖提取液，并向提取液中加入0.2 mL木瓜蛋白酶液。其中，控制溶液中pH=6、酶解溫度為55 ℃。關(guān)于酶解時(shí)間的確定，可以分為設(shè)置為0.5、1.0、1.5、2.0 h和2.5 h。反應(yīng)結(jié)束之后，需要將溶液沸水浴處理10 min。冷卻至室溫之后，以4 000 r·min-1的速度進(jìn)行離心處理，處理結(jié)束后去除沉淀。并在此基礎(chǔ)上，對上清液蛋白濃度進(jìn)行科學(xué)測定。

（2）酶解溫度對蛋白去除率的影響。分別提取10 mL多糖提取液，并向提取液中加入0.2 mL木瓜蛋白酶液。其中，控制溶液中pH=6。關(guān)于酶解溫度的控制，分別設(shè)置為50、55、60、65 ℃和70 ℃。反應(yīng)結(jié)束之后，需要將其置于沸水浴當(dāng)中，處理10 min后。將其冷卻至室溫。并在此基礎(chǔ)上，以4 000 r·min-1的離心速度去除沉淀。并對上清液蛋白濃度進(jìn)行合理測量與分析。

（3）酶解pH對蛋白去除率的影響。分別提取10 mL多糖提取液，并向提取液中加入0.2 mL木瓜蛋白酶液。其中，將溶液pH值控制到3、4、5、6和7當(dāng)中。將溶液置于55 ℃水浴酶解，酶解處理1.5 h之后，沸水浴10 min。冷卻至室溫之后，以4 000 r·min-1離心速度，處理10 min后去除沉淀。并在此基礎(chǔ)上，對上清液蛋白濃度進(jìn)行合理測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 Sevage法除蛋白

Sevage法是利用有機(jī)溶劑使溶液中的蛋白質(zhì)變性而分離清除蛋白質(zhì)，結(jié)果見圖1。由圖可知，脫蛋白4次后蛋白清除率基本穩(wěn)定，多糖仍有少量下降，因此，最佳脫蛋白次數(shù)為4次。

2.2 三氯乙酸法除蛋白

三氯乙酸是酸性物質(zhì)，能使蛋白質(zhì)帶正電荷，并與負(fù)離子結(jié)合成不溶性的鹽類，結(jié)果見圖2。由圖可知，蛋白清除率隨著三氯乙酸脫蛋白次數(shù)的增加不斷升高，脫蛋白次數(shù)達(dá)到第4次時(shí)基本穩(wěn)定，而多糖保留率仍在下降，因此，最佳脫蛋白次數(shù)為4次。

2.3 酶法除蛋白單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 酶解時(shí)間對蛋白清除率的影響

由圖3可知，隨著酶解時(shí)間的延長蛋白清除率逐漸增大，但1.5 h之后蛋白清除率隨時(shí)間延長變化不明顯，多糖保留率隨酶解時(shí)間延長而降低，說明反應(yīng)的最適時(shí)間為1.5 h左右。

2.3.2 酶解溫度對蛋白清除率的影響

由圖4可知，隨著酶解溫度的升高，蛋白清除率逐漸增大，溫度達(dá)到60 ℃趨于穩(wěn)定。而多糖保留率隨酶解溫度升高逐漸降低，說明該酶的最適反應(yīng)溫度在60 ℃左右。

2.3.3 pH值對蛋白清除率的影響

隨著多糖溶液的pH值不同，酶對蛋白的清除率也會相應(yīng)的發(fā)生變化，由圖5可知，pH=6時(shí)蛋白的清除率最大，隨后趨于穩(wěn)定，多糖保留率卻逐漸下降，說明該酶的最適反應(yīng)pH值為6。

綜上所述，酶法脫蛋白的最適pH為6、最適溫度為60 ℃、最適反應(yīng)時(shí)間為1.5 h。

3 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)，三氯乙酸法和Sevage法除蛋白工藝復(fù)雜，需要多次重復(fù)進(jìn)行。綜合比較上述試驗(yàn)結(jié)果，木瓜蛋白酶法更適用，且最佳工藝為酶解時(shí)間1.5 h、溫度60 ℃、pH=6.0，結(jié)合各項(xiàng)指標(biāo)得出木瓜蛋白酶脫蛋白方法效果最好，為辣木多糖脫蛋白進(jìn)一步研究提供了參考。

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