亞麻籽油增強(qiáng)小鼠免疫功能的研究

董和亮 郭嘉欣 白坤穎 趙娟

摘 要：目的：研究亞麻籽油對小鼠免疫力功能的影響。方法：測定亞麻籽油中亞麻酸的含量，以高、中、低劑量組給予小鼠30 d灌胃實(shí)驗(yàn)，分析測定碳粒廓清實(shí)驗(yàn)，遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，抗體生成細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，腹腔巨噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，NK細(xì)胞活性測定。結(jié)果：亞麻籽油對小鼠的體重、臟器/體重比值、血清溶血素以及單核巨噬細(xì)胞功能無顯著影響（P>0.05）;與對照組比較，高劑量組能夠顯著提高小鼠的細(xì)胞免疫功能，如淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化、遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)、NK細(xì)胞活性（P<0.05）。結(jié)論：亞麻籽油對小鼠具有增強(qiáng)免疫力的功能。

關(guān)鍵詞：亞麻籽油;小鼠;免疫功能;亞麻酸

Abstract：Objective： To study the effect of linseed oil on the immune function of mice. Method： The content of linolenic acid in linseed oil was analyzed， and linseed oil were used as high， medium and low dose groups to give mice a 30 d gavage experiment to analyze and determine carbon Clearance test， delayed type allergy， antibody-producing cell test， chicken macrophage cell test， lymphocyte transformation test， NK cell activity determination. Results： Linseed oil had no significant effect on the body weight， organ/weight ratio， serum hemolysin and mononuclear macrophage function of mice （P>0.05）; compared with the control group， the high-dose group could significantly improve the mice Cellular immune function， such as lymphocyte transformation， delayed type allergy， NK cell activity （P<0.05）. Conclusion： Linseed oil has the function of enhancing immunity in mice.

Key words：Linseed oil; Mice; Immune function; Linolenic acid

中圖分類號(hào)：TS201.4

亞麻籽油中的亞麻酸對維持和提高正常的生理功能、預(yù)防疾病及患病風(fēng)險(xiǎn)具有積極的作用[1-3]。隨著人們健康意識(shí)的提高，各類營養(yǎng)補(bǔ)充劑不斷興起，亞麻酸已成為重要的食品與保健品原料[4]。亞麻籽油富含人體所需的必需脂肪酸，可彌補(bǔ)日常飲食中脂肪酸攝入量不足，解決比例失衡的問題[5-7]。鑒于飲食中不飽和脂肪酸的缺乏，市場上出現(xiàn)了各種脂肪酸保健品。亞麻籽油作為豐富亞麻酸的植物來源，目前關(guān)于其對免疫力的影響尚處于空白階段，亟需理論研究支持[8-10]。

基于亞麻籽油表現(xiàn)出的功能特性，本文分析測定了亞麻籽油中亞麻酸的含量，并以小鼠為研究對象，依據(jù)保健食品檢驗(yàn)與技術(shù)評價(jià)規(guī)范，采用碳粒廓清實(shí)驗(yàn)，遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，抗體生成細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，腹腔巨噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，NK細(xì)胞活性測定等方法，研究分析亞麻籽油對小鼠免疫力的影響，以期闡明亞麻籽油的免疫調(diào)節(jié)過程及調(diào)節(jié)途徑，為其全面利用和開發(fā)亞麻籽油提供科學(xué)指導(dǎo)和理論依據(jù)，為開發(fā)功能保健食品提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與動(dòng)物

亞麻籽油，由山西五臺(tái)山沙棘制品有限公司提供，為淺黃色至黃色液體。體重18～22 g清潔級ICR雌性小鼠200只，由上海萊斯克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002。飼料，由上海普路騰生物科技有限公司提供，許可證號(hào)：滬飼證（2014）04001

1.2 儀器設(shè)備

8 mm直徑打孔器，微量血凝試驗(yàn)板，2-16K通用離心機(jī)，RT-6100酶標(biāo)儀，96孔培養(yǎng)板，Co-150 CO2培養(yǎng)箱，UV-1800紫外可見分光光度計(jì)，OlympusIX71倒置顯微鏡，電子天平，顯微鏡。

1.3 主要試劑

注射用墨汁，刀豆蛋白A（ConA），MTT，DNFB，丙酮，麻油，SRBC，生理鹽水，雞紅細(xì)胞，羊紅細(xì)胞，甲醇，Giemsa染色，YAC-1細(xì)胞，Hanks液（pH7.2～7.4），RPM11640完全培養(yǎng)液，乳酸鋰，碘硝基氯化四氮唑（INT），吩嗪二甲酯硫酸鹽（PMS）、NAD、Tris-HCL緩沖液（pH8.2），1%NP40，臺(tái)酚蘭，1 mol·L-1鹽酸，酸性異丙醇等。

1.4 方法

1.4.1 亞麻酸含量的測定

（1）待測樣品制備。準(zhǔn)確稱取油脂樣品50 mg移入10 mL小容量瓶內(nèi)，向其中加入3 mL正己烷與苯混合溶液（1∶1比例），并輕輕搖晃使其混合均勻。再加入2 mL NaOH-CH3OH溶液，充分振蕩使其混合均勻后，在常溫下靜置30 min，向容量瓶內(nèi)添加一定量去離子水使容量瓶內(nèi)原有的有機(jī)溶劑升至瓶口，靜置5 min待穩(wěn)定后，吸取上清液進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析[11]。

（2）測定方法。將100 m×0.25 mm×0.20 μm的HP-88型號(hào)毛細(xì)管柱連接到6890/5973安捷倫氣質(zhì)聯(lián)用儀上。氦氣作為載氣，載氣壓力保持在100 kPa，進(jìn)樣模式選擇split，分流比設(shè)為1∶30，流速為1 mL·min-1，注射溫度定為250 ℃，EI作為為離子源（溫度設(shè)為230 ℃），將四級桿溫度設(shè)為150 ℃，傳輸溫度設(shè)為250 ℃，并在50～550 amu的范圍、電離壓力為70 eV的條件下進(jìn)行掃描。掃描升溫過程如下：將儀器的初始溫度設(shè)為80 ℃并保持5 min;以10 ℃·min-1的速度升至150 ℃，保持2 min;再以5 ℃·min-1的速度升至230 ℃，保持10 min;整個(gè)分析過程持續(xù)40 min。采用外標(biāo)法測定油樣，每個(gè)樣品重復(fù)測定3次。根據(jù)脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間及面積歸一法計(jì)算脂肪酸的相對含量。

1.4.2 受試樣品及配制

亞麻籽油的成人日推薦量為3 g，即0.05 g·kg-1?BW（成人體重以60 kg計(jì)）。按日推薦量的5倍、10倍、30倍配制受試樣品濃度分別為0.15、0.05和0.025 g·mL-1的高、中、低劑量組，以食用大豆油作為對照組。臨用前稱取亞麻籽油15 g與食用大豆油混合均勻至100 mL，為高劑量組;取高劑量組樣品40 mL，與食用大豆油混合均勻至120 mL，為中劑量組，取中劑量組樣品40 mL，與食用大豆油混合均勻至80 mL，作為低劑量組。

1.4.3 動(dòng)物分組與給藥

參照韓飛方法，200只小鼠隨機(jī)分成5大組，再分成4小組，每小組10只小鼠，分別進(jìn)行體重、空斑、溶血素測定、臟器指數(shù)，NK活性、淋轉(zhuǎn)試驗(yàn)，DTH試驗(yàn)，小鼠碳粒廓清試驗(yàn)，小鼠腹腔巨噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)。按每日10 mL·kg-1 BW連續(xù)灌胃30 d后，分別進(jìn)行試驗(yàn)。

1.4.4 小鼠體重的測定。

標(biāo)記每只小鼠，記錄小鼠的初始體重和終期體重。

1.4.5 碳粒廓清實(shí)驗(yàn)測定

在最后一次給予受試物24 h后，稱小鼠體重，小鼠尾部靜脈注入稀釋的印度墨汁，2 min、10 min后，取內(nèi)眥靜脈血20 μL，并立即加入2 mL 0.1%NaCO3溶液中，以NaCO3溶液為空白對照，在600 nm處測定OD值，將小鼠處死后，取出肝臟、脾臟后稱重，計(jì)算吞噬指數(shù)a[12]。

式（1）（2）中：K-碳粒廓清指數(shù)，表示吞噬速率;OD1-t1時(shí)的吸光度值;OD2-t2時(shí)的吸光度值;t1-給墨汁后第2次取血的時(shí)間;t2-給墨汁后第2次取血的時(shí)間;a-吞噬指數(shù)，反映每單位組織質(zhì)量的吞噬活性。

1.4.6 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DTH）檢測

在最后一次給予受試物24 h后，對小鼠腹部皮膚約3 cm×3 cm進(jìn)行脫毛處理，用50 μL的DNFB溶液涂抹均勻致敏;5 d后，再以10 μL的上述溶液均勻涂抹小鼠右耳。24 h后，頸椎脫臼處死小鼠，剪下左右耳，用打孔器取下直徑8 mm的耳片稱重[13]。

1.4.7 體液免疫功能測定

在最后一次給予受試物24 h后，腹腔注射0.2 mL 2%（V/V）SRBC懸液。5 d后，進(jìn)行血清溶血素檢測和抗體生成細(xì)胞檢測。

（1）抗體生成細(xì)胞的測定。頸椎脫臼處死小鼠，取脾臟，經(jīng)磨碎、過濾、離心，洗滌后懸浮于8 mL Hanks液中。取25 μL脾細(xì)胞懸液、50 μL 10%SRBC、0.5mL 0.5%的瓊脂糖Hanks液混合培養(yǎng)基迅速混勻，傾倒于6 cm已刷瓊脂薄層的平皿上，于CO2培養(yǎng)箱中溫育1.5 h，然后用SA緩沖液稀釋的補(bǔ)體（1∶8）加入，溫育3 h后，統(tǒng)計(jì)溶血空斑數(shù)[14]。

（2）血清溶血素的測定。將小鼠摘除眼球采血，2 000 r·min-1離心10 min進(jìn)行血清的分離，用生理鹽水稀釋不同倍數(shù)并置于微量血凝板內(nèi)，每孔100 μL，加入同體積的0.5%（v/v）的SRBC懸液，混勻，37 ℃溫箱孵育3 h，觀察血球凝集程度[15]。

1.4.8 小鼠腹腔巨噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（半體內(nèi)法）和臟器/體重比值

在最后一次給予受試物24 h后，腹腔注射1 mL 20%雞紅細(xì)胞懸液。30 min后，頸椎脫臼處死動(dòng)物，固定在鼠板上剪開腹壁皮膚，經(jīng)腹腔注入2 mL生理鹽水，轉(zhuǎn)動(dòng)鼠板1 min。吸出1 mL腹腔洗液，滴于2片載玻片上，移置37 ℃溫育30 min。生理鹽水漂洗、晾干、固定、染色、蒸餾水漂洗晾干。在油鏡下閱片計(jì)數(shù)，計(jì)算吞噬率和吞噬指數(shù)。

吞噬率（%）=（吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)）×100? ?（3）

吞噬指數(shù)=被吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)/計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)? ?（4）

取脾臟及胸腺，稱重，計(jì)算胸腺指數(shù)和脾指數(shù)[16]。

胸腺指數(shù)=胸腺重量（mg）/體重（g）? ?（5）

脾臟指數(shù)=脾臟重量（mg）/體重（g）? ?（6）

1.4.9 ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)和小鼠NK細(xì)胞活性測定

在最后一次給予受試物24 h后，頸椎脫臼法處死小鼠，無菌取脾，置于無菌的適量Hanks液的小平皿中，用鑷子輕輕將脾撕碎，過200目篩網(wǎng)，為單細(xì)胞懸液。

（1）ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。參照楊迪[17]的方法，并做適當(dāng)修改，將上述細(xì)胞懸液經(jīng)離心，調(diào)整濃度為3×106個(gè)/mL。分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL，一孔加75 μL ConA液，另一孔為對照，培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)68 h時(shí)，每孔吸去0.7 mL上清液，并加入同體積不含小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液與50 μL的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，分裝于96孔培養(yǎng)板，3個(gè)平行孔，于570 nm處測定OD值。

（2）小鼠NK細(xì)胞活性測定（乳酸脫氫LDH測定法）。參照王曉林的方法[18]。試驗(yàn)前24 h將靶細(xì)胞傳代培養(yǎng)，Hanks液洗3次，RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105個(gè)/mL。棄上清液將細(xì)胞漿彈起，加入0.5 mL滅菌水20 s，裂解紅細(xì)胞后再加入0.5 mL 2倍Hanks液及8 mL Hanks液，離心10 min（1 000 r·min-1），用1 mL完全培養(yǎng)液重懸，用1%冰醋酸稀釋后計(jì)數(shù)，染色計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107個(gè)/mL。取靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞各100 μL（效靶比為50∶1），加入96孔培養(yǎng)板中;靶細(xì)胞自然釋放孔加靶細(xì)胞和培養(yǎng)液各100 μL、靶細(xì)胞最大釋放孔加靶細(xì)胞和1%NP40各100μL，上述各項(xiàng)均設(shè)3個(gè)平行孔，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，然后將培養(yǎng)板1 500 r·min-1離心5 min，每孔吸取上清液100 μL置于96孔培養(yǎng)板中，并加入同體積的LDH基質(zhì)液，反應(yīng)3min，每孔加入30 μL 1 moL·L-1的HCl，于490 nm處測定OD值。

1.5 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以O(shè)rigin作圖，SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析。經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，方差齊的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用LSD法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，方差不齊的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Tamnane法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞麻籽油中亞麻酸含量測定

亞麻籽油中含豐富的營養(yǎng)成分如維生素E、甾醇等[3-6]。另外，亞麻籽油中亞麻酸含量較高，大量研究認(rèn)為，亞麻酸具有降低心血管疾病的作用，對提高身體機(jī)能具有積極的影響，是目前最理想的單一植物油脂[7-9]，因此，測定分析樣品中亞麻酸的含量。圖1為亞麻籽油脂肪酸氣相色譜圖，經(jīng)測定分析本實(shí)驗(yàn)中采用的亞麻籽油中亞麻酸含量高達(dá)44.0%。

2.2 亞麻籽油對小鼠體重的影響

亞麻籽油對小鼠體重的影響見表1。由表1可知，30 d灌胃試驗(yàn)結(jié)束后，低劑量組小鼠的體重最高為33.2 g，與對照組比較，高、中、低各劑量組小鼠的體重均無顯著差異（P>0.05），說明亞麻籽油對小鼠體重?zé)o影響。

2.3 小鼠碳粒廓清試驗(yàn)

圖2為小鼠的碳粒廓清試驗(yàn)，由圖2可知，高、中、低各劑量組小鼠碳粒廓清吞噬指數(shù)a與對照組比較，差異均不顯著（P>0.05）。其中，高劑量組的吞噬指數(shù)a最高為4.82，低劑量組的吞噬指數(shù)a最低為4.56。

2.4 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)

表2為DTH測定結(jié)果，由表2可知，高劑量組小鼠左右耳腫脹度差最高為22.2 mg，明顯高于對照組，差異顯著（P<0.05），而中、低劑量組與對照組相比，差異不顯著（P>0.05）。

2.5 體液免疫功能測定

2.5.1 抗體生成細(xì)胞檢測試驗(yàn)

小鼠抗體生成細(xì)胞檢測試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，與對照組比較，高劑量組與中劑量組具有顯著的差異（P<0.05），低劑量組與對照組比較，差異不顯著（P>0.05）。

2.5.2 血清溶血素試驗(yàn)

血清溶血素試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，各劑量組小鼠抗體積數(shù)與對照組比較，差異均不顯著（P>0.05）。

2.6 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)

巨噬細(xì)胞功能主要為吞噬作用，其代表著多個(gè)器官的免疫潛能。巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3可知，高、中、低各劑量組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的吞噬率、轉(zhuǎn)換值及吞噬指數(shù)與對照組比較，差異不顯著（P>0.05）。

2.7 臟器/體重比值的測定

正常時(shí)各臟器與體重的比值比較恒定。當(dāng)動(dòng)物染毒后，受損臟器重量可能發(fā)生改變，從而引起臟體比的變化。各劑量組胸腺指數(shù)、脾指數(shù)的測定結(jié)果見表4，由表4可知，與對照組比較，高、中、低各劑量組均無顯著差異（P>0.05）。說明亞麻籽油對小鼠的臟器/體重比值無影響。其中P為概率值，取值在0～1之間，其數(shù)值越小，說明置信度就越高。由表4可知，P值均大于0.05，說明實(shí)驗(yàn)各組無差異，進(jìn)一步說明受試樣品亞麻籽油對小鼠的臟器/體重比值無影響。

2.8 細(xì)胞免疫功能測定

表5為ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)結(jié)果，由表5可知，與對照組比較，低劑量組和中劑量組小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化OD值差異不顯著（P>0.05），而高劑量組小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化OD差值明顯高于對照組，差異顯著（P<0.05）。說明亞麻籽油具有增強(qiáng)細(xì)胞免疫的功能。

2.9 NK細(xì)胞活性測定

NK細(xì)胞活性測定結(jié)果見表6。由表6可知，高劑量組小鼠NK細(xì)胞活性明顯高于對照組，NK細(xì)胞活性提高了21.6%，差異顯著（P<0.05），而中、低劑量組與對照組比較，差異不顯著（P>0.05）。

3 結(jié)論

經(jīng)30 d灌胃試驗(yàn)后，與對照組比較，高、中、低各劑量組小鼠體重，胸腺指數(shù)，脾指數(shù)，小鼠血清溶血素水平，碳粒廓清能力，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而亞麻籽油高劑量組能夠明顯增強(qiáng)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力和DNFB誘導(dǎo)的小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，能顯著提升小鼠抗體生成能力及小鼠NK細(xì)胞活性，說明亞麻籽油可提高小鼠的細(xì)胞免疫和體液免疫功能。根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》（衛(wèi)生部2003）的規(guī)定，說明亞麻籽油具有增強(qiáng)小鼠免疫功能的作用，其可用于食品、保健食品提高免疫力等功能產(chǎn)品的開發(fā)和應(yīng)用。

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