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    云南核桃分心木黃酮提取及抗氧化性研究

    2020-12-07 10:04何旭華闞歡黃陸繄張娟劉燦劉云
    現(xiàn)代食品·上 2020年10期
    關(guān)鍵詞:純化抗氧化性提取工藝

    何旭華 闞歡 黃陸繄 張娟 劉燦 劉云

    摘 要:本研究采用超聲波輔助乙醇提取云南核桃分心木黃酮,通過正交試驗優(yōu)化了提取工藝條件。選取AB-8大孔樹脂對黃酮提取液進行純化,并研究了純化后黃酮提取液的抗氧化活性。結(jié)果表明,在乙醇濃度50%、料液比1∶50 g·mL-1和超聲時間12 min時,黃酮得率為7.15%,純度為48.35%??寡趸钚栽囼炛?,黃酮濃度為2.5 mg·mL-1時,DPPH和ABTS自由基清除率分別達到90.68%和60.24%,鐵離子還原力吸光值為0.456,即云南核桃分心木黃酮有較強的抗氧化性活性。

    關(guān)鍵詞:云南核桃;分心木;黃酮;提取工藝;純化;抗氧化性

    Abstract:The flavonoids of distracted wood from Juglans sigilata was extraction by ultrasound, and the extraction process was optimized by orthogonal experiment. AB-8 macroporous resin was selected to purification the flavonoids, and the antioxidant activity of the flavonoids was determined. The results show that the ethanol concentration 50%, the ratio of material to liquid 1∶50 g·mL-1, and ultrasonic time 12 min, the yield of flavonoids was 7.15% and the purity was 48.35%. In the antioxidant activity test, when the concentration of flavonoids was 2.5 mg·mL-1, the free radical scavenging rates of DPPH and ABTS reach 90.68% and 60.24%, respectively, and the absorption value of iron ion reducing power was 0.456, so the flavonoids of distracted wood have strong antioxidant activity.

    Key words:Juglans sigilata; Distracted wood; Flavonoids; Extraction process; Purification; Antioxidant

    中圖分類號:R284

    云南核桃(Juglans sigilata)分心木,是胡桃科(Jualandaceae)核桃屬(Juglans)植物核桃果仁之間的干燥木質(zhì)隔膜,又稱胡桃隔、胡桃夾、胡桃衣等,占核桃質(zhì)量的4%~5%。核桃分心木體輕質(zhì)脆且易折斷,顏色呈棕色或淺棕褐色[1-2],味道苦澀、食性平和。新疆少數(shù)民族醫(yī)學記載,分心木可改善體寒、腎虛的生理虛弱,且治療多夢、遺精、遺尿、尿血、泄痢、牙齦出血、帶下和口腔潰瘍等多種疾病[3-4]。研究表明,核桃分心木富含多種生物活性成分,包括黃酮、有機酸、酚類、生物堿、油脂、皂苷、揮發(fā)油、氨基酸、鞣質(zhì)、糖類、多肽及其他微量化合物,其中黃酮類化合物含量較高[5-9]。

    黃酮類物質(zhì)廣泛存在植物中,是以α-苯基苯并吡喃酮為主體的一系列物質(zhì),被廣泛應(yīng)用在食品添加劑和治療疾病方面,它能抑制人體產(chǎn)生有害的自由基,也能清除多余的自由基,可延緩衰老、抗腫瘤、預防心腦血管疾病和癌癥[10]。相關(guān)研究表明,核桃分心木的水提液或醇提液能抗菌,所含黃酮皂苷物質(zhì)具有較強的抗氧化效果,可改善小鼠的腎陽虛病癥[11-13]。云南省作為全國最大的核桃生產(chǎn)基地,也是深紋核桃的原產(chǎn)地和高產(chǎn)區(qū),其核桃具有種源獨特、品質(zhì)好、產(chǎn)量高、產(chǎn)值高、營養(yǎng)豐富、味道醇香等優(yōu)點,深受大眾歡迎[14-15]。分心木作為核桃副產(chǎn)物,開發(fā)利用不足,其有一定的藥用價值和食用價值,富含多種營養(yǎng)成分。研究其抗氧化性能,以治療疾病和開發(fā)天然的抗氧劑。

    本文研究云南核桃分心木中黃酮的提取及工藝優(yōu)化,并初步純化黃酮提取液,考察純化液對DPPH、ABTS自由基清除,以及鐵離子還原力的抗氧化活性。為深入研究和開發(fā)利用核桃分心木提供參考依據(jù),同時提高云南核桃副產(chǎn)物經(jīng)濟收益和資源利用率。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    核桃分心木,云南磨漿農(nóng)業(yè)有限公司提供。AB-8大孔樹脂,購自安徽三星樹脂科技有限公司;蘆丁標準品,購自上海源葉科技有限公司;1,1-二苯-2-苦基肼(DPPH)、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS),購自合肥博美生物科技有限責任公司;亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁、無水乙醇(99.7%)、過硫酸鉀、鐵氰化鉀、磷酸鹽緩沖液、三氯乙酸、六水合三氯化鐵,購自天津市風船化學試劑科技有限公司。以上試劑均為分析純。

    1.2 主要儀器

    UV-2600紫外可見分光光度計,島津儀器(蘇州)有限公司生產(chǎn);YB-250A型高速多功能粉碎機,永康市速峰工貿(mào)有限公司生產(chǎn);SHZ-DⅢ循環(huán)水式多用真空泵,上海力辰邦西儀器科技有限公司生產(chǎn):SB25-12DTDS超聲波清洗機,寧波新藝超聲設(shè)備有限公司生產(chǎn);KH20R-Ⅱ臺式冷凍高速離心機,湖南凱達科學儀器有限公司生產(chǎn);2.5 L型冷凍干燥機,LABCONCO公司生產(chǎn);RV3V旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,艾卡儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn);DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋,天津市泰斯特儀器有限公司生產(chǎn);DHG-9240A電熱恒溫鼓風干燥機,上海齊欣科學儀器有限公司生產(chǎn)。

    2 方法

    2.1 蘆丁標準曲線的繪制

    參照文獻[16],方法稍做改動。精密稱量10 mg蘆丁標準品,溶解于30%乙醇并定容至100 mL。以0.1 mg·mL-1蘆丁標準品作為母液,按濃度梯度分別配制濃度為0.000、0.005、0.010、0.020、0.030、0.040、0.050、0.060、0.070 mg·mL-1和0.080 mg·mL-1的標準溶液于10 mL容量瓶中,分別加入0.3 mL 5%(質(zhì)量分數(shù))NaNO2和10%Al(NO3)3,再加入4 mL 4%NaOH,每次加液間隔6 min,最后用30%乙醇定容至10 mL。均勻混合靜置15 min,510 nm處測定樣品吸光值,每組平行測定3次。

    以蘆丁標準品吸光值(Y)對蘆丁濃度(X)進行回歸分析,回歸方程為Y=5.356 6X+0.086 6,R2=0.999 44,具有良好的線性關(guān)系,蘆丁標準曲線具有較強的可靠性。所得蘆丁標準曲線如圖1所示。

    2.2 總黃酮提取及測定

    核桃分心木預處理:將云南核桃分心木分揀,清洗,鋪于不銹鋼托盤置50 ℃恒溫干燥箱,干脆后經(jīng)粉碎機粉碎,過80目篩保存于密封袋。

    稱1 g核桃分心木,用一定濃度乙醇溶解并置超聲波中輔助提取,抽濾得黃酮粗提液,定容至50 mL,備用。參照標準曲線測定方案,取0.6 mL備用液于10 mL容量瓶測定分心木黃酮吸光值,將吸光值代入標準曲線方程算出黃酮濃度,利用得率方程(1)算出黃酮含量。

    式(1)中,C-黃酮濃度,g·mL-1;V-黃酮提取液總體積,mL;M-分心木質(zhì)量,g。

    2.3 單因素試驗

    選取乙醇濃度、料液比、超聲時間進行單因素試驗,分析3個因素對黃酮得率的影響。試驗設(shè)計見表1。

    2.4 正交試驗設(shè)計

    以單因素試驗結(jié)果為基礎(chǔ),設(shè)計三因素三水平正交試驗,優(yōu)化單因素對核桃分心木黃酮提取的影響,確定最優(yōu)方案。試驗設(shè)計如表2。

    2.5 核桃分心木黃酮分離純化試驗

    最優(yōu)工藝下,稱20 g分心木超聲提取,抽濾,旋蒸濃縮,用型號為AB-8的大孔樹脂以樣液每3 s一滴進行洗脫純化,按2.2方法測定純化液黃酮含量,冷凍干燥得黃酮干重,按公式(2)計算黃酮純度。

    式(2)中,m-黃酮粗提物質(zhì)量,g;M-純化后分心木黃酮干重,g。

    2.6 核桃分心木黃酮抗氧化性研究

    2.6.1 DPPH自由基清除率的測定

    用棕色容量瓶配制一定濃度的DPPH-乙醇溶液,參考Cheng等的方法[17],適當調(diào)整。分別取樣品、DPPH-乙醇溶液2 mL于10 mL離心管,避光,37 ℃水浴30 min。在517 nm處測吸光值A(chǔ)1,無水乙醇代替DPPH-乙醇溶液測吸光值A(chǔ)2,無水乙醇代替樣品液測吸光值A(chǔ)0,平行測3次,取平均值。按公式(3)計算DPPH自由基的清除率(RSA表示自由基清除活性)。

    式(3)中,A0-空白吸光值,A1-樣品吸光值,A2-無水乙醇代替DPPH-乙醇溶液吸光值。

    2.6.2 ABTS自由基清除率的測定

    參照文獻[18]改進方案,將7 mmol·L-1 ABTS自由基與140 mmol·L-1過硫酸鉀溶液于棕色容量瓶中等體積混合,靜置反應(yīng)12 h,即得ABTS自由基反應(yīng)液。在734 nm處用無水乙醇稀釋ABTS自由基反應(yīng)液吸光值至0.700±0.02,避光現(xiàn)用。取2 mL樣品溶液,2 mL ABTS自由基反應(yīng)液于10 mL離心管,混合搖勻10 s,靜置6 min后,于734 nm處測吸光值A(chǔ)1,樣品用無水乙醇代替測吸光值A(chǔ)0,平行測定3次,取平均值。按公式(4)計算ABTS自由基的清除率:

    2.6.3 鐵離子還原力的測定

    參照高行恩等[19-20]的方法適當調(diào)整,取2.0 mL樣液于10 mL離心管,加入5 mL 0.2 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH=6.6)和5 mL 1%鐵氰化鉀溶液,混勻,50 ℃水浴反應(yīng)30 min,降至室溫后,加入5 mL 10%三氯乙酸,4 000 r·min-1離心10 min。分別取5 mL離心管上清液、蒸餾水和0.1%三氯化鐵,均勻混合靜置10 min,700 nm處測吸光值。

    3 結(jié)果與分析

    3.1 單因素試驗結(jié)果與分析

    3.1.1 乙醇濃度對云南核桃分心木黃酮得率的影響

    乙醇濃度對云南核桃分心木黃酮得率的影響如圖2所示。由圖2可知,黃酮得率隨乙醇濃度的增大呈先增大后急劇減小趨勢,當濃度為40%時達到最大值3.38%。黃酮類化合物因結(jié)構(gòu)不同而呈現(xiàn)不同的極性,依據(jù)相似相溶原理,極性越大提取物的雜質(zhì)越多,黃酮得率越小;極性越小黃酮溶出量越少,得率越小。因此,選取40%乙醇時,黃酮得率最大。

    3.1.2 料液比對云南核桃分心木黃酮得率的影響

    料液比對云南核桃分心木黃酮得率的影響如圖3所示。由圖3可知,核桃分心木黃酮得率隨料液比增加呈現(xiàn)上升趨勢,當料液比為1∶70 g·mL-1時,核桃分心木黃酮的得率最大,其最大得率為2.80%。溶劑對分心木中的黃酮具有擴散作用,且溶劑體積越大,對核桃分心木中黃酮的擴散作用越大,而分心木中黃酮的擴散能力越強,黃酮得率越大。料液比為1∶60 g·mL-1和1∶70 g·mL-1時,黃酮得率相差較小,黃酮濃度接近飽和,考慮到成本及資源合理利用,最終選擇黃酮提取的最佳料液比為1∶60 g·mL-1。

    3.1.3 超聲時間對云南核桃分心木黃酮得率的影響

    超聲時間對云南核桃分心木黃酮得率的影響如圖4所示。由圖4可知,核桃分心木黃酮得率隨時間呈先增加后減少的趨勢:當超聲時間為6~12 min時,得率呈上升趨勢;12~14 min時,呈下降趨勢;超聲時間為12 min時,有最大得率2.93%。核桃分心木中黃酮隨超聲時間延長向提取溶劑擴散并達到溶解平衡,因此提取量不斷增加至最大值;超聲時間越長,黃酮結(jié)構(gòu)越易被破壞和氧化,導致提取量下降。此外,超聲時間延長,會造成能源過度消耗,綜合考慮超聲時間應(yīng)選擇12 min。

    3.2 正交試驗

    單因素基礎(chǔ)上,以黃酮得率為指標,采用L9(34)正交試驗設(shè)計表進行試驗,試驗結(jié)果見表3。

    由表3可知,影響核桃分心木黃酮得率的主次順序為B>C>A,最優(yōu)工藝為A3B1C2,即乙醇濃度為50%、料液比1∶50 g·mL-1、時間12 min。

    采用方差分析以減小試驗誤差,提高試驗精準度,同時分析分心木黃酮提取受各因素影響的程度,見表4。利用顯著性檢驗,查表得臨界值F0.01(2,2)=99.00,F(xiàn)0.05(2,2)=19.00,所以對于給定的顯著性水平,由表4可知,F(xiàn)A=26.05>F0.05(2,2),F(xiàn)B=99.19>F0.01(2,2),F(xiàn)C=65.28>F0.05(2,2),通過正交試驗方差分析表可得,因素A、C對試驗有顯著影響,因素B對試驗有非常顯著的影響。

    3.3 黃酮粗提物純化

    選取最優(yōu)工藝,核桃分心木中黃酮經(jīng)過純化試驗后,黃酮純度為48.35%。

    3.4 分心木抗氧化活性分析

    以3.3純化液為樣品,DPPH、ABTS自由基清除率和鐵離子還原能力為指標,進行黃酮抗氧化性研究,結(jié)果見表5。

    由表5可知,分心木黃酮純化液對DPPH、ABTS自由基和鐵離子均有一定清除效果,在試驗濃度范圍內(nèi),黃酮濃度與自由基清除率呈正相關(guān),隨濃度增大而增大。不同黃酮濃度對DPPH和ABTS自由基清除效果不同,濃度在0.5 mg·mL-1,DPPH清除率比ABTS高35.688個百分點,鐵離子還原能力吸光值為0.173。濃度在2.5 mg·mL-1時,DPPH自由基清除率高達90.681%,對DPPH自由基清除效果較強,對ABTS自由基清除率良好,清除率為60.236%。黃酮濃度在0.5~2.5 mg·mL-1時,吸光值從0.173增長到0.456,分心木黃酮的還原能力較強,抗氧化性較好。

    4 結(jié)論

    本文運用正交試驗設(shè)計,優(yōu)化云南核桃分心木黃酮提取,試驗表明,乙醇濃度50%、料液比1:50 g·mL-1、超聲時間12 min是云南核桃分心木黃酮的最優(yōu)提取方案,得率為7.15%。粗提物經(jīng)過AB-8大孔樹脂純化,純度為48.35%。純化液對DPPH、ABTS自由基和鐵離子的抗氧化試驗表明:云南核桃分心木黃酮有較高的抗氧化性,可制備天然的抗氧化劑,為開發(fā)核桃分心木黃酮藥物奠定基礎(chǔ)。

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