產(chǎn)β-葡萄糖苷酶洋蟲(chóng)內(nèi)共生真菌篩選、鑒定及聯(lián)合轉(zhuǎn)化人參皂苷作用機(jī)制

房 柳 王艷成 董微巍 姬文秀

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133000)

人參(PanaxginsengC.A.Meyer)，素有“百草之王”之美稱，是中國(guó)中醫(yī)藥寶庫(kù)中的瑰寶，也是吉林省得天獨(dú)厚的特產(chǎn)資源，目前已有3 000多年的應(yīng)用歷史[1]。由于人參具有免疫調(diào)節(jié)、抗癌、抗氧化、治療糖尿病和抗炎等藥理活性[2-6]。經(jīng)過(guò)多年來(lái)的產(chǎn)業(yè)培育，人參開(kāi)始走出中藥柜，被作為主要活性成分添加到食品、保健品之中，用來(lái)提高其產(chǎn)品功能性。人參皂苷是人參的主要活性成分，主要包括Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2和Rd等人參主皂苷和一些含量甚微的Rg3、compound K、Rh1、Rh2、Rh3等稀有人參皂苷，不同種類的人參皂苷具有不同的藥理活性。研究[7]表明，人參皂苷經(jīng)水解(脫糖基)作用脫去糖基，轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷，稀有人參皂苷所含糖基少，生物利用度和藥理活性高。孫廣仁等[8]開(kāi)發(fā)了一種多菌種發(fā)酵人參酒，人參酒發(fā)酵產(chǎn)生稀有皂苷提高了其功能性，改善了人參酒風(fēng)味。蔡爽[9]開(kāi)發(fā)了一種人參術(shù)苓酵素，發(fā)酵使人參皂苷轉(zhuǎn)化，具有緩解非潰瘍性消化不良的功效。篩選有利于人參發(fā)酵、高效轉(zhuǎn)化人參皂苷的功能菌株，提高人參產(chǎn)品功能性，體外合成稀有人參皂苷已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者們所關(guān)注的焦點(diǎn)[10-12]。

昆蟲(chóng)體內(nèi)共生菌生存環(huán)境獨(dú)特，積累著大量具有特殊生理活性和功能的物質(zhì)，也是人們發(fā)現(xiàn)微生物新物種和制備較好生物活性代謝產(chǎn)物的重要來(lái)源。目前多利用昆蟲(chóng)共生菌中纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶等分解纖維素、木質(zhì)素、制備生物農(nóng)藥等研究[13]，對(duì)開(kāi)發(fā)利用昆蟲(chóng)共生功能菌改性中草藥活性的研究報(bào)道很少。利用昆蟲(chóng)內(nèi)生菌資源發(fā)酵改性中草藥提高其功能與活性，為中草藥及其功能產(chǎn)品發(fā)酵提供微生物資源目前已日益被關(guān)注。Wang等[14]利用冬蟲(chóng)夏草中真菌高效轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1→Rd→F2→compound K，轉(zhuǎn)化率高達(dá)82%，制得compound K純度高達(dá)91%。冬蟲(chóng)夏草是中國(guó)青藏高原特有的名貴藥材，其資源稀少，價(jià)格昂貴，限制了它的廣泛使用[15]。藥用昆蟲(chóng)洋蟲(chóng)(Martianusdermestoides)主要以中藥人參、茯苓、紅花等為食，根據(jù)其習(xí)性推測(cè)洋蟲(chóng)體內(nèi)具有降解人參皂苷功能菌株。前期課題組成員[16]對(duì)洋蟲(chóng)幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)內(nèi)生菌組成結(jié)構(gòu)進(jìn)行了系統(tǒng)分析，結(jié)果表明，洋蟲(chóng)內(nèi)不可培養(yǎng)的和未被分類的菌種占一定的比例，洋蟲(chóng)體內(nèi)共生菌是龐大的動(dòng)態(tài)微生物寄居場(chǎng)所，是有待開(kāi)發(fā)的生物資源。試驗(yàn)擬利用動(dòng)物藥洋蟲(chóng)內(nèi)特殊生境的微生物進(jìn)行產(chǎn)β-葡萄糖苷酶功能菌株篩選、鑒定，并與植物藥人參中全組分人參皂苷發(fā)酵反應(yīng)制備人參稀有皂苷(Rg3、Rh1和compound K)，以期改善人參生物利用度。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

洋蟲(chóng)：延邊大學(xué)植物保護(hù)實(shí)驗(yàn)室；

鮮人參根(4年生植物)：吉林集安；

正丁醇、甲醇、無(wú)水乙醇等：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

PCR相關(guān)試劑：美國(guó)Genview公司；

色譜級(jí)乙腈(ACN)、甲醇(MeOH)和去離子水：色譜級(jí)，美國(guó)費(fèi)希爾科學(xué)世界公司；

人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品(Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rh1、Rg2、Rg3、F1和compound K)：國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng)；

真菌DNA提取試劑盒：上海生工生物工程有限公司；

PCR擴(kuò)增儀：2720-Thermal-Cycler型，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；

高效液相色譜儀：Aglient1260LC型，安捷倫科技有限公司；

電子天平：YP600型，天津天馬橫基儀器有限公司；

離心沉淀器：80-2型，天津賽得利斯實(shí)驗(yàn)儀器分析制造廠；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-52A型，上海亞榮生化儀器廠；

恒溫水浴鍋：HH-S8A型，上海儀器儀表科技有限公司。

1.2 人參皂苷提取物

取新鮮人參根(4年生植物)樣品干燥并粉碎，取10 g粉末在82 ℃下用1 000 mL 80%乙醇回流冷凝2 h，反復(fù)兩次，合并萃取液，減壓濃縮后在50 ℃的烘箱中烘干，制備人參皂苷粗提物[17]。

1.3 洋蟲(chóng)內(nèi)共生菌液制備

1.3.1 洋蟲(chóng)的飼養(yǎng)與馴化 按照80%紅棗和20%人參的比例混合飼料飼養(yǎng)馴化洋蟲(chóng)，在30 cm×20 cm×10 cm培養(yǎng)箱中保持(24±2) ℃的溫度，培養(yǎng)1年。每批幼蟲(chóng)培養(yǎng)15 d左右，裝入昆蟲(chóng)培養(yǎng)箱，保持幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)的適當(dāng)密度，便于連續(xù)取食，保持種群的穩(wěn)定。

1.3.2 洋蟲(chóng)內(nèi)共生菌液制備 取洋蟲(chóng)成蟲(chóng)15只，置于75%乙醇中90 s，用無(wú)菌水反復(fù)沖洗，在無(wú)菌操作臺(tái)用研缽研磨，加極少量蒸餾水移至離心管；先以500 r/min離心5 min，取出上清液，再以10 000 r/min離心5 min，取下方沉淀，加入生理鹽水制備洋蟲(chóng)內(nèi)共生菌菌液。

1.4 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株的篩選與鑒定

1.4.1 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株的篩選 利用10倍稀釋法逐級(jí)稀釋菌液，然后取100 μL洋蟲(chóng)菌液加到MRS篩選培養(yǎng)基(加入七葉苷、檸檬酸鐵)上，采用涂布平板法將菌液在培養(yǎng)基上涂布均勻，密封，厭氧條件下恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)72 h，觀察其生長(zhǎng)狀況。挑選菌落呈黑色且邊緣整齊的單一菌落，利用劃線法將其接種到新的培養(yǎng)基上，多次重復(fù)直至得到單一菌株。從中挑選兩株生長(zhǎng)狀態(tài)良好且菌落顏色較深的菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)[18]。

1.4.2 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶功能菌株的鑒定 DP336 試劑盒提取基因組DNA，序列通用引物(ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；ITS4：5-TCCTCCG CTTATTGATATGC-3’)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物的測(cè)序工作由北京百邁客有限公司完成。

1.5 菌液與人參皂苷提取物發(fā)酵反應(yīng)

取4 mg人參皂苷粗提物，加入500 μL菌液至2 mL離心管中，在85% N2、10% H2和5% CO2的厭氧條件下，將篩選出的菌株以及二者的混合菌株富集培養(yǎng)24 h，取人參主皂苷與菌液反應(yīng)20 d，采用高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS/MS)對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間(0，1，2，3，7，12，20 d)下的生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行研究。

1.6 LC-MS/MS分析產(chǎn)物

發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)飽和正丁醇3倍體積萃取，以5 000 r/min離心5 min，取上清液，反復(fù)3次；將萃取出的菌液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至膏狀，加入100 μL液相甲醇，移至液相小瓶，LC-MS/MS分析。安捷倫1260系列液相色譜系統(tǒng)與安捷倫Poroshell ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)和C18保護(hù)柱對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)分析。該系統(tǒng)使用Mass Hunter采集軟件B.07.00進(jìn)行操作。流動(dòng)相由水(0.1%甲酸，溶劑A)和乙腈(0.1%甲酸，溶劑B)組成，采用以下梯度洗脫程序：0～13 min，0%～23% B；13～33 min，23%～46% B；33～38 min，46%～68% B；38～45 min，68%～68% B；45～55 min，68%～100% B。進(jìn)樣量2 μL，流速0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm。

利用安捷倫6420型三重四極質(zhì)譜儀(QQQ-MS)對(duì)化合物進(jìn)行質(zhì)譜分析。采用正電噴霧離子化(ESI)MS-MS對(duì)人參皂苷的代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析。毛細(xì)管電壓為4 000 V，氣體以3 L/min的速度流動(dòng)，氣體溫度為300 ℃。獲得了m/z500～1 500質(zhì)量范圍內(nèi)的全掃描質(zhì)譜圖。通過(guò)測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物中[M+Na]+或[M-2H2O+OH]+離子片段質(zhì)量來(lái)確定人參皂苷含量。

1.7 方法驗(yàn)證

定量分析采用外標(biāo)法。制備含有12種人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液，并稀釋至適當(dāng)濃度，以繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過(guò)繪制峰面積與各分析物濃度之間的關(guān)系，得到校正曲線。在色譜條件下，以信噪比S/N=3為檢測(cè)限(LOD)、S/N=10為定量限(LOQ)為原則，計(jì)算12個(gè)目標(biāo)分析物的檢測(cè)限和定量限。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的鑒定

利用七葉苷顯色原理，即七葉苷被β-葡萄糖苷酶水解后生成的6,7-二羥香豆素也叫七葉苷元，與鐵離子反應(yīng)，使培養(yǎng)基內(nèi)的菌落周圍生成黑褐色物質(zhì)，從洋蟲(chóng)成蟲(chóng)10個(gè)菌液樣品體內(nèi)篩選出2株具有產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶的功能真菌，編號(hào)為WY1、WY2，經(jīng)18S rRNA基因擴(kuò)增分別對(duì)兩株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶真菌進(jìn)行鑒定。洋蟲(chóng)內(nèi)生真菌WY1經(jīng)PCR擴(kuò)增后獲得1條558 bp左右的特異性條帶，WY2經(jīng)PCR擴(kuò)增后獲得1條598 bp左右的特異性條帶，將序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)Blast搜索與所得到的序列相似性高的序列，并通過(guò)軟件CLUSTALX 1.83和MEGA 7.00構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(見(jiàn)圖1)。

通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析結(jié)果表明，WY1序列與菌株Chaetomiumglobosum相似度達(dá)98%，定性該菌株為Chaetomium屬，WY2序列與菌株Aspergillusfumigatus相似度達(dá)93%，初步定性該菌株為Aspergillus屬。

2.2 菌株與人參皂苷發(fā)酵反應(yīng)

2.2.1 定量方法驗(yàn)證 對(duì)一定濃度范圍內(nèi)的人參皂苷標(biāo)椎品線性校準(zhǔn)曲線進(jìn)行分析，并進(jìn)行線性回歸計(jì)算，按3倍信噪比和10倍信噪比計(jì)算方法分別確定檢出限和定量限，參數(shù)與結(jié)果見(jiàn)表1。

如表1所示，在質(zhì)量濃度50～5 000 ng/mL范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)均大于0.992，所有分析物的濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系，可以滿足12種人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)化合物檢測(cè)計(jì)算要求。

2.2.2 內(nèi)生菌WY1與人參皂苷提取液發(fā)酵產(chǎn)物分析

利用內(nèi)生菌WY1對(duì)人參皂苷提取液進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，通過(guò)HPLC-MS/MS對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中人參皂苷進(jìn)行定性分析，檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，在人參粗提掖中共有7種人參主皂苷(Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd)在WY1作用下，發(fā)酵產(chǎn)物為稀有人參皂苷Rh1。

定量分析了人參主皂苷在WY1菌液作用下動(dòng)態(tài)發(fā)酵過(guò)程發(fā)酵產(chǎn)物中人參皂苷的變化趨勢(shì)，如圖3所示。人參主皂苷(Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2)含量隨著與WY1菌液的發(fā)酵反應(yīng)時(shí)間增長(zhǎng)而逐漸減少，而人參主皂苷Rd含量呈先減少后升高的變化趨勢(shì)。代謝初期Rd 被水解轉(zhuǎn)化，在0～5 d其含量隨著時(shí)間變化而逐漸減少，但是，由于二醇類人參皂苷Rb1、Rc、Rb2在發(fā)酵反應(yīng)過(guò)程中水解掉C-20位外部糖基轉(zhuǎn)化被轉(zhuǎn)化生成Rd，在5～20 d 其含量又呈升高趨勢(shì)，所以在WY1作用下轉(zhuǎn)化途徑是Rb1/Rb2/Rc→Rd。稀有人參皂苷Rh1是三醇類人參皂苷(Rg1，Re，Rf)主要發(fā)酵產(chǎn)物，其可能由于在WY1作用下人參皂苷Re水解掉C-6位外部糖基轉(zhuǎn)化為人參皂苷Rg1，人參皂苷Rg1水解掉C-6位外部糖基轉(zhuǎn)化為人參皂苷Rh1；Rf水解掉C-6位外部糖基直接轉(zhuǎn)化為Rh1，其轉(zhuǎn)化途徑為Re→Rg1→Rh1；Rf→Rh1，為此，隨著發(fā)酵反應(yīng)進(jìn)行人參皂苷Rh1含量逐漸升高。目前，稀有人參皂苷Rh1主要是通過(guò)合成和轉(zhuǎn)化的方法來(lái)獲取，其中微生物轉(zhuǎn)化法具有反應(yīng)體系穩(wěn)定、菌種生長(zhǎng)迅速且無(wú)需分離純化酶液等優(yōu)點(diǎn)，受到眾多研究者的青睞[19]，試驗(yàn)從洋蟲(chóng)內(nèi)分離的C. WY1可以與人參總皂苷發(fā)生去糖基化反應(yīng)，將人參皂苷中二醇類皂苷轉(zhuǎn)化為Rd，將三醇類皂苷生物轉(zhuǎn)化為稀有皂苷Rh1，可為制備靶向制備Rh1發(fā)酵功能菌提供資源。

圖1 菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.2.3 內(nèi)生菌WY2與人參皂苷提取液發(fā)酵產(chǎn)物分析

利用HPLC-MS/MS定性分析內(nèi)生菌WY2對(duì)人參皂苷提取液發(fā)酵產(chǎn)物中的人參皂苷，發(fā)酵反應(yīng)總離子色譜圖如圖4所示。

由圖4可知，在人參粗提液中共有7種人參主皂苷(Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd)在WY2作用下，發(fā)酵產(chǎn)物為稀有人參皂苷Rh1、Rg3和compound K。定量分析了人參主皂苷在WY2菌液作用下動(dòng)態(tài)發(fā)酵過(guò)程發(fā)酵產(chǎn)物中人參皂苷的變化趨勢(shì)，如圖5所示。

表1 12種人參皂苷的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢測(cè)限和定量限

1. Re 2. Rg1 3. Rf 4. Rb1 5. Rc 6. Rb2 7. Rg2 8. Rd 9. Rh1 10. F1 11. Rg3 12. compound K

圖3 發(fā)酵過(guò)程中7種人參主皂苷含量及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物Rh1隨時(shí)間變化曲線

WY2菌液發(fā)酵人參皂苷(0，1，3，5，7，10，20 d)動(dòng)態(tài)反應(yīng)中，人參主皂苷濃度—時(shí)間曲線如圖5(a)所示，人參主皂苷(Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2)含量隨著與WY2菌液的發(fā)酵反應(yīng)時(shí)間增長(zhǎng)而逐漸減少，發(fā)酵第3天產(chǎn)生稀有人參皂苷Rg3和compound K，其主要由于人參皂苷(Rb1、Rb2、Rc)水解掉C-20位外部糖基轉(zhuǎn)化為人參皂苷Rd，Rd作為中間代謝產(chǎn)物水解掉C-20位糖基轉(zhuǎn)化為人參皂苷Rg3，水解掉C-3位糖基轉(zhuǎn)化為compound K，其轉(zhuǎn)化途徑為Rb1/Rb2/Rc→Rd→Rg3/compound K，所以人參主皂苷Rd含量呈先減少后升高，Rg3和compound K含量隨著發(fā)酵反應(yīng)時(shí)間增長(zhǎng)而增加的變化趨勢(shì)。同2.3.1人參皂苷Rh1是三醇類皂苷Rg1、Re和Rf的主要轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，隨著發(fā)酵反應(yīng)進(jìn)行含量逐漸升高。

煙曲霉WY2屬曲霉菌屬，目前在微生物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域具有一定的應(yīng)用前景，如馬宗敏等[20]采用黑曲霉對(duì)薯蕷科植物黃山藥根莖進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后得到了4個(gè)化合物，左明星等[21]利用煙曲霉GZWMJZ-152將茶粕中的山茶苷代謝，從發(fā)酵提取物中分離得到5個(gè)化合物，其曲霉菌屬在發(fā)酵中草藥植物中已具有較高的研究?jī)r(jià)值。試驗(yàn)利用洋蟲(chóng)內(nèi)分離的煙曲霉WY2轉(zhuǎn)化人參皂苷萃取液新增了3種活性皂苷化合物。

1. Re 2. Rg1 3. Rf 4. Rb1 5. Rc 6. Rb2 7. Rg2 8. Rd 9. Rh1 10. F1 11. Rg3 12. compound K

圖5 WY2發(fā)酵7種人參主皂苷中發(fā)酵產(chǎn)物皂苷含量隨時(shí)間變化曲線

2.2.4 內(nèi)生菌WY1/WY2聯(lián)合發(fā)酵人參皂苷提取液產(chǎn)物分析 利用HPLC-MS/MS定性分析內(nèi)生菌WY1/WY2兩菌按1∶1比例復(fù)合發(fā)酵人參皂苷，提取液產(chǎn)物中的人參皂苷，發(fā)酵反應(yīng)總離子色譜圖如圖6所示。

由圖6可知，人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2在聯(lián)合菌劑作用下代謝轉(zhuǎn)化的稀有人參皂苷分別為Rh1、Rg3和compound K。WY1/WY2聯(lián)合菌劑發(fā)酵人參皂苷在(0，1，3，5，7，10，20 d)動(dòng)態(tài)反應(yīng)中定量分析了兩株菌株聯(lián)合發(fā)酵轉(zhuǎn)化人參皂苷的反應(yīng)產(chǎn)物，人參皂苷成分隨時(shí)間變化曲線如圖7所示。

1. Re 2. Rg1 3. Rf 4. Rb1 5. Rc 6. Rb2 7. Rg2 8. Rd 9. Rh1 10. F1 11. Rg3 12. compound K

圖7 WY1/WY2發(fā)酵7種人參主皂苷中發(fā)酵產(chǎn)物中皂苷含量隨時(shí)間變化曲線

由圖7(a)可知，人參主皂苷(Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2)含量隨著發(fā)酵反應(yīng)時(shí)間增長(zhǎng)逐漸減少，人參皂苷Rd因在WY1/WY2作用下發(fā)生水解反應(yīng)，發(fā)酵初期因被水解而呈減少趨勢(shì)，但由于二醇類主皂苷(Rb1、Rc和Rb2)在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生了人參皂苷Rd，其含量在3 d后開(kāi)始出現(xiàn)逐漸升高趨勢(shì)。三醇類皂苷反應(yīng)產(chǎn)物稀有人參皂苷Rh1在發(fā)酵第1天開(kāi)始產(chǎn)生，隨著發(fā)酵反應(yīng)進(jìn)行含量逐漸升高，在發(fā)酵第3天產(chǎn)生稀有人參皂苷Rg3和compound K，其含量隨著發(fā)酵反應(yīng)時(shí)間增長(zhǎng)而增加，轉(zhuǎn)化機(jī)制同2.3.2所述。

微生物在生長(zhǎng)發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生很多酶，具有強(qiáng)大的代謝能力，可以提高中藥的有效成分含量。WY1/WY2雙菌聯(lián)合發(fā)酵，可改善人參皂苷生物活性，與單一菌株相比可提高稀有人參皂苷Rh1、Rg3和compound K的轉(zhuǎn)化效率。相關(guān)的研究[22]以及生產(chǎn)實(shí)踐表明，使用多種菌株進(jìn)行混合發(fā)酵制備的相關(guān)產(chǎn)品，與單一菌種發(fā)酵相比，具有更好的品質(zhì)與效果，在試驗(yàn)的兩種菌株作用下人參二醇類皂苷比人參三醇類皂苷更容易被轉(zhuǎn)化，二醇類主皂苷大部分被轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷Rg3。

3 結(jié)論

篩選出兩株洋蟲(chóng)體內(nèi)共生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶真菌ChaetomiumglobosumWY1和AspergillusfumigatusWY2及WY1/WY2聯(lián)合菌劑分別與全組分人參皂苷發(fā)酵培養(yǎng)，通過(guò)比較WY1/WY2聯(lián)合菌劑轉(zhuǎn)化制備稀有人參皂苷Rh1、Rg3和compound K較為高效，轉(zhuǎn)化途徑為Re→Rg1→Rh1；Rf→Rh1；Rb1/Rb2/Rc→Rd→Rg3/compound K。為了更好地提高人參皂苷的轉(zhuǎn)化效率，該研究將繼續(xù)對(duì)WY1/ WY2聯(lián)合菌劑的培養(yǎng)條件pH、溫度、培養(yǎng)基等進(jìn)行優(yōu)化。