模擬胃腸消化對牡蠣低聚肽抗氧化活性的影響

馬 勇 高麗輝 馮曉文谷瑞增 韓 濤 劉文穎

(1. 浙江省動物蛋白食品精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315832；2. 中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京 100015；3. 北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心，北京 100015；4. 北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，北京 102206)

牡蠣(Ostrea)又名生蠔，是世界上第一大養(yǎng)殖貝類，是中國四大養(yǎng)殖貝類之一。牡蠣營養(yǎng)價(jià)值高，蛋白質(zhì)含量高，氨基酸含量豐富且均勻，有“海洋牛奶”之稱。通過生物酶解、分離純化、噴霧干燥等技術(shù)制備牡蠣肽，是牡蠣高值化利用的有效途徑[1-2]。研究[3-6]表明，牡蠣肽具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、降血糖和抑制ACE活性等生理作用。

牡蠣低聚肽主要成分為短肽，相對分子量小。與氨基酸相比，人體對短肽的吸收利用率更高且不易飽和，例如二肽和三肽的吸收速度高于相同組成的氨基酸[7]。但經(jīng)口服進(jìn)入人體后，受胃腸道中各種消化酶的作用，可能會造成生物活性的降低[8-9]。目前，關(guān)于牡蠣低聚肽消化前后抗氧化活性的研究未見報(bào)道。

研究擬以去殼牡蠣肉為原料，經(jīng)蛋白提純、酶解、分離純化等步驟制得牡蠣低聚肽，采用胃蛋白酶和胰蛋白酶對其進(jìn)行體外模擬消化，通過對比消化前后牡蠣低聚肽分子量分布、DPPH自由基清除能力、羥自由基(·OH)清除能力、ABTS自由基清除能力以及氧自由基吸收能力(ORAC)變化，驗(yàn)證牡蠣低聚肽消化前后抗氧化能力的變化，以期為牡蠣低聚肽在抗氧化功能性食品的開發(fā)方面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冷凍去殼牡蠣肉：北京中食海氏生物技術(shù)有限公司；

堿性蛋白酶(≥4.0×105DU/g)、中性蛋白酶(≥1 600 AU/g)：杜邦丹尼斯克公司；

胃蛋白酶：≥250 Units/mg，美國Sigma公司；

胰蛋白酶：≥250 NFU/mg，美國Solarbio公司；

偶氮二異丁脒鹽酸鹽(AAPH)、Fluorescein(熒光指示劑)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、Trolox(水溶性維生素E)、分子量標(biāo)準(zhǔn)品：分析純，美國Sigma公司；

乙腈、三氟乙酸：色譜純，美國Fisher公司；

ABTS自由基清除率檢測試劑盒：碧云天生物技術(shù)研究所；

其他試劑：分析純，北京化工廠；

恒溫水浴鍋：HH-501型，常州國宇儀器制造有限公司；

電子天平：SI-114型，美國Denver Instrument公司；

噴霧干燥機(jī)：GZ-5型，無錫市陽光干燥設(shè)備廠；

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：DHG-9075A型，北京陸?？萍加邢薰荆?/p>

多功能酶標(biāo)儀：Spectra MR型，美國Dynex公司；

高效液相色譜儀：LC-20A型，日本Shimadzu公司；

多功能酶標(biāo)儀：SpectraMax i3x型，美國MD公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 牡蠣低聚肽的制備 將冷凍去殼牡蠣肉先用蒸餾水洗凈，然后稱取600 g絞碎，加入蒸餾水?dāng)嚢璩蓜驖{?？販?50±2) ℃，調(diào)節(jié)pH至8.5，以每克原料2 500單位的酶量加入堿性蛋白酶，酶解2 h，使用0.1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)水解液pH為6.5，以每克原料3 000單位的酶量加入中性蛋白酶，酶解2 h。酶解過程中用0.1 mol/L的HCl或NaOH調(diào)節(jié)水解液使pH保持不變。酶解結(jié)束后，100 ℃沸水浴滅酶，10 000×g下離心20 min，取上清液，利用孔徑為200 nm的陶瓷膜進(jìn)行過濾，取濾過清液，再用超濾膜超濾(截留分子量1 000 Da)，取分子量<1 000 Da 的濾過液進(jìn)行噴霧干燥，進(jìn)料溫度25 ℃，進(jìn)料速度14 mL/min，進(jìn)風(fēng)溫度135 ℃，進(jìn)風(fēng)壓力20 kPa，制備出牡蠣低聚肽干粉。

1.2.2 牡蠣低聚肽體外模擬消化

(1) 體外模擬胃液消化試驗(yàn)：準(zhǔn)確稱取5.0 g牡蠣低聚肽和0.2 g NaCl加入到50 mL去離子水中，用1.0 mol/L 的HCl調(diào)節(jié)pH至2.0，37 ℃水浴，加入0.05 g胃蛋白酶消化2 h，消化完畢后100 ℃沸水浴滅酶，待冷卻至室溫，用1.0 mol/L NaOH溶液將pH調(diào)至7.5，最后定容至100 mL?？瞻讓φ胀鲜鎏幚矸椒ǎ患游傅鞍酌竅10-12]。

(2) 體外模擬腸液消化試驗(yàn)：準(zhǔn)確稱取5.0 g牡蠣低聚肽和0.68 g KH2PO4加入到50 mL去離子水中，用濃度為1.0 mol/L NaOH將pH調(diào)至7.5，37 ℃水浴，加入0.05 g 胰蛋白酶恒溫消化4 h，消化完畢后100 ℃沸水浴滅酶，冷卻至室溫后，加去離子水定容至100 mL?？瞻讓φ胀鲜鎏幚矸椒?，不加胰蛋白酶[10-12]。

1.2.3 分子量分布的測定 采用反相高效液相凝膠色譜法進(jìn)行分子量分布分析。流動相：乙腈—水—三氟乙酸(V乙腈∶V水∶V三氟乙酸=45∶55∶0.1)；色譜柱：TSKgel G2000 SWXL 300 mm×7.8 mm；流速：0.5 mL/min；樣品濃度：1.0 mg/mL；進(jìn)樣體積：10 μL；檢測器：紫外檢測器；檢測波長：220 nm；柱溫：30 ℃。用孔徑0.2 μm的聚四氟乙烯濾膜將樣品溶液過濾后，上機(jī)進(jìn)行凝膠過濾。將乙氨酸—乙氨酸—乙氨酸、乙氨酸—乙氨酸—酪氨酸—精氨酸、桿菌酶和細(xì)胞色素C配制成0.1 g/100 mL的溶液，用于制作相對分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線[13]。

1.2.4 牡蠣低聚肽消化前后的DPPH自由基清除率測定

依次加入100 μL 0.1 mmol/L DPPH-無水乙醇溶液和100 μL不同濃度的樣品溶液，室溫避光放置30 min，于517 nm處測定吸光值；將100 μL不同濃度的樣品溶液與100 μL無水乙醇混合，測定吸光值；以蒸餾水代替樣品作為空白對照，與100 μL 0.1 mmol/L DPPH-無水乙醇溶液混合，測定吸光值[14]。按式(1)計(jì)算DPPH自由基清除率。

(1)

式中：

S——自由基清除率，%；

Ax——樣品組吸光值；

A0——空白組吸光值；

A1——對照組吸光值。

1.2.5 牡蠣低聚肽消化前后的·OH清除率測定 采用水楊酸法，其原理是H2O2和Fe2+反應(yīng)生成·OH，再加入水楊酸后能夠捕捉·OH顯色。依次加入100 μL不同濃度的樣品溶液，200 μL 5 mmol/L水楊酸—乙醇溶液，200 μL 5 mmol/L FeSO4溶液，試驗(yàn)組以100 μL 5 mmol/L H2O2啟動反應(yīng)；對照組以等體積蒸餾水啟動反應(yīng)。空白組以等體積蒸餾水代替樣品。渦旋震蕩，反應(yīng)1 h后取200 μL反應(yīng)液在510 nm處測定吸光值[15]。按式(1)計(jì)算·OH清除率。

1.2.6 牡蠣低聚肽消化前后的ABTS自由基清除率測定

將2.45 mmol/L高硫酸鉀溶液加入到7 mmol/L ABTS儲備液中，室溫避光靜置16 h，制備成ABTS+自由基儲備液。用磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.4)將ABTS+自由基儲備液稀釋35倍后作為工作液。每個(gè)孔中加入200 μL稀釋35倍的工作液。向標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測孔中加入10 μL不同濃度的Trolox(水溶性維生素E)標(biāo)準(zhǔn)溶液，向樣品檢測孔中加入樣品10 μL，輕輕混勻后室溫孵育6 min，于734 nm處測定吸光值。同時(shí)制作Trolox溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終樣品的抗氧化能力以mmol/g Trolox表示[16]。

1.2.7 牡蠣低聚肽消化前后的ORAC值測定 將25 μL樣品溶液和100 μL的Fluorescein(熒光指示劑，0.8 μmol/L)于96孔板中混合，然后加入75 μL 150 mmol/L 偶氮類化合物AAPH啟動反應(yīng)，此為試驗(yàn)組。分別用25 μL Trolox標(biāo)準(zhǔn)品(6.25，12.50，25.00，50.00，100.00，250.00，500.00 μmol/L)代替樣品作為陽性對照(制作標(biāo)準(zhǔn)曲線)、25 μL磷酸緩沖液(pH 7.4，75 mmol/L)代替樣品為空白對照，于37 ℃保溫20 min，熒光酶標(biāo)儀激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長530 nm，每隔2 min 測定一次，測定150 min。同時(shí)以磷酸緩沖液代替AAPH作為對照。以樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的熒光衰退曲線的保護(hù)面積之比計(jì)算樣品的ORAC值，結(jié)果表示為μmol/g Trolox[17-18]。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)平行測定3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。使用Origin 8.0軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 消化前后牡蠣低聚肽分子量分布

分子量分布分析結(jié)果(表1)表明，牡蠣低聚肽的分子量主要在1 000 Da以下，占總比例的89%以上，具有較好的水溶性、消化吸收性。研究[19]表明，肽的抗氧化作用與其分子量大小有關(guān)，分子量低的短肽往往表現(xiàn)出較高的抗氧化活性。因此，牡蠣低聚肽是一種具有潛力的天然抗氧化性物質(zhì)。胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后，牡蠣低聚肽的重均分子量略微減少，這是由于低聚肽經(jīng)蛋白酶消化后，部分肽段會被酶切降解，進(jìn)一步生成小肽，將一些活性基團(tuán)暴露出來，增加低聚肽與自由基發(fā)生反應(yīng)的機(jī)會[20]。但是消化前后重均分子量變化不超過8.2%，因此牡蠣低聚肽具有一定的消化穩(wěn)定性。

2.2 消化前后牡蠣低聚肽的DPPH自由基清除能力

在體外模擬胃蛋白酶和胰蛋白酶消化前后，牡蠣低聚肽對DPPH自由基清除能力的變化如圖1所示。由圖1可知，在濃度為1～20 mg/mL時(shí)，消化前后的牡蠣低聚肽對DPPH自由基清除率與濃度呈明顯的劑量關(guān)系。與消化前相比，消化后的牡蠣低聚肽對DPPH自由基清除能力稍有下降。胃蛋白酶消化前后，IC50值分別約為6.1，7.8 mg/mL，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，最高降低7.9%；胰蛋白酶消化前后，IC50值分別約為6.3，6.6 mg/mL，最高降低8.7%。但胃腸消化對DPPH自由基清除能力均無顯著性影響(P>0.05)。因此，經(jīng)模擬消化后，牡蠣低聚肽仍可保持較高的抗氧化活性。王熙等[21]的研究中也報(bào)道了相似的結(jié)果，條滸苔抗氧化肽模擬胃腸消化后，其DPPH自由基清除能力稍有下降，但沒有顯著性影響。

2.3 消化前后牡蠣低聚肽的·OH清除能力

經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶消化前后牡蠣低聚肽對·OH清除能力的變化如圖2所示。牡蠣低聚肽的·OH 清除能力在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)呈濃度依賴趨勢。徐兆剛等[22]制備的河蚌蛋白肽在濃度31.32 mg/mL時(shí)，·OH 清除率為82.29%，低于試驗(yàn)中牡蠣低聚肽的·OH 清除率。胃蛋白酶消化前后，濃度6 mg/mL時(shí)·OH 清除率變化最大，降低9.3%，在8～15 mg/mL范圍內(nèi)，牡蠣低聚肽的·OH清除能力與未處理的基本相同，消化前后IC50值分別約為8.1，8.3 mg/mL。胰蛋白酶消化前后，整體·OH清除能力較胃蛋白酶處理更加穩(wěn)定，濃度4 mg/mL時(shí)·OH清除率變化最大，降低3.8%，其余濃度下變化很小，消化前后IC50值分別約為5.9，6.0 mg/mL。胃腸消化對·OH清除能力均無顯著性影響(P>0.05)，說明牡蠣低聚肽在·OH清除能力方面具有一定的消化穩(wěn)定性，可能是具有·OH清除能力的肽類因其結(jié)構(gòu)不符合消化酶的特異要求從而能夠抵抗消化酶水解，使整體保持較高的抗氧化活性[21]。

表1 不同處理的牡蠣低聚肽分子量分布

圖1 不同處理的牡蠣低聚肽對DPPH自由基清除作用

2.4 消化前后牡蠣低聚肽的ABTS自由基清除能力

以Trolox標(biāo)準(zhǔn)品繪制的ABTS標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算消化前后牡蠣低聚肽的ABTS自由基清除率，結(jié)果如表2所示。胃腸消化對ABTS自由基清除能力均無顯著性影響(P>0.05)，胃蛋白酶消化后，牡蠣低聚肽對ABTS自由基的清除能力降低了9.2%；胰蛋白酶消化后，對ABTS自由基的清除能力提高了3.6%。這與Schmelzer等[23]研究的β-酪蛋白和劉珊珊等[20]研究的酪蛋白肽經(jīng)模擬胃腸消化后的降解規(guī)律一致。推測是由于胃蛋白酶將部分高活性肽段酶切降解，阻礙了低聚肽與ABTS自由基的反應(yīng)，使低聚肽對自由基的清除能力略有下降。在隨后的模擬腸道消化階段，胰蛋白酶消化后，進(jìn)一步生成小肽，暴露更多活性基團(tuán)，大大增加與ABTS自由基反應(yīng)的機(jī)會，從而增強(qiáng)對自由基的清除能力[24]。

圖2 不同處理的牡蠣低聚肽對·OH清除作用

圖3 ABTS標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 不同處理的牡蠣低聚肽對ABTS自由基清除作用

2.5 消化前后牡蠣低聚肽的ORAC值

不同濃度Trolox繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算最終牡蠣低聚肽消化前后的ORAC值變化，結(jié)果如表3所示。胃腸消化對牡蠣低聚肽的ORAC值均無顯著性影響(P>0.05)，經(jīng)胃蛋白酶消化后，ORAC值提高了11.5%；經(jīng)胰蛋白酶消化后，ORAC值提高了1.3%。顧敏[25]對青養(yǎng)蛋白抗氧化肽經(jīng)凝膠過濾色譜分離的組分B的胃腸道消化特性進(jìn)行了研究，結(jié)果與試驗(yàn)一致，體外胃腸道消化體系均提高了其抗氧化活性。產(chǎn)生這種結(jié)果可能是因?yàn)榻?jīng)胃、胰蛋白酶處理后，牡蠣低聚肽的部分肽段被酶解，生成小肽段(三肽或二肽)和氨基酸，而某些分子量越小的肽段抗氧化活性越強(qiáng)[19]。另據(jù)報(bào)道[24]，某些氨基酸，如蛋氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸等，因其特殊的結(jié)構(gòu)而具有抗氧化作用。這些都可能是牡蠣低聚肽消化之后ORAC值提高的原因。

圖4 Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線

表3 不同處理的牡蠣低聚肽的ORAC值變化

3 結(jié)論

試驗(yàn)以去殼牡蠣肉為原料，通過兩步酶解法制備牡蠣低聚肽，并以其為研究對象，模擬胃腸道消化試驗(yàn)，通過對比體外消化前后的分子量分布、DPPH自由基清除能力、·OH清除能力、ABTS自由基清除能力和ORAC值，探討胃腸道消化對其抗氧化活性的影響。結(jié)果表明，牡蠣低聚肽的相對分子量主要在1 000 Da以下，胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后重均分子量下降不超過8.2%；胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后，DPPH自由基清除率降低分別不超過7.9%，8.7%；胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后，·OH清除率降低分別不超過9.3%，3.8%；胃蛋白酶消化后，ABTS自由基清除率降低9.2%，胰蛋白酶消化后，ABTS自由基清除率提高3.6%；胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后，ORAC值分別提高11.5%，1.3%。胃腸消化對牡蠣低聚肽的抗氧化活性評價(jià)各指標(biāo)均無顯著性影響(P>0.05)，證明牡蠣低聚肽經(jīng)模擬胃腸道消化后仍保持較高的抗氧化活性，個(gè)別抗氧化評價(jià)指標(biāo)有所提高。這表明牡蠣低聚肽具有較好的綜合抗氧化活性和穩(wěn)定性，此外，由于牡蠣低聚肽具有很高的安全性，長期食用不會產(chǎn)生毒副作用，因此可用于抗氧化功能性食品的開發(fā)應(yīng)用。后續(xù)將通過凝膠色譜、離子交換色譜、反相高效液相色譜等方法分離篩選高活性的抗氧化肽片段，進(jìn)一步探討牡蠣低聚肽發(fā)揮抗氧化作用的機(jī)理和具體功效成分。