輻照處理對樺褐孔菌多糖降血糖作用的影響

張 露 姜 欣 金莉英 林長青 崔承弼

(1. 延邊大學(xué)融合學(xué)院，吉林 延吉 133000；2. 延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林 延吉 133000；3. 延邊大學(xué)長白山天然藥物研究教育部重點實驗室，吉林 延吉 133000)

糖尿病作為近些年來逐漸多發(fā)的以慢性高血糖為明顯特點的內(nèi)分泌代謝型疾病，受到自身免疫系統(tǒng)、環(huán)境及遺傳因素的共同影響，臨床主要分為3種類型：1型、2型及妊娠糖尿病[1]。2019年全球成年人(20～79歲)患糖尿病數(shù)目約達4.63億，其中中國已達1.16億，位居榜首，每年中國因糖尿病死亡人數(shù)約達83.4萬[2-3]。糖尿病已然發(fā)展成癌癥和心腦血管病之后的又一大全球性頑癥，各種并發(fā)癥會導(dǎo)致患者的殘疾或早亡[4]。

糖尿病不宜單純依賴藥物治愈，長期服用相關(guān)西藥存在一定副作用，所以目前食療是臨床上醫(yī)治糖尿病的基礎(chǔ)措施[5]。許多研究人員選擇依賴性弱、安全性高、不良反應(yīng)小的植物多糖和微生物多糖作為飲食治療糖尿病的研究方向，主要是從研究材料的可獲取性和有效性的角度進行研究[6]。

樺褐孔菌(Inonotusobliquus)，即白樺茸(Chaga)，是一類生長于白樺樹上的藥用真菌，其含有大量的植物纖維類多糖體，具有抵抗癌癥、降血壓、降血糖、復(fù)活免疫等作用[7]，謝洋等[8]發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌菌核中的多糖可降低人體血糖指標(biāo)。據(jù)研究[9-10]報道，從樺褐孔菌多糖菌核和菌絲中提取的水溶性多糖(F1)及糖蛋白(FIS-1)可降低人體血糖濃度，并使之維持在較低水平長達2 d。Diao等[11]發(fā)現(xiàn)，樺褐孔菌多糖可使STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的血糖水平及低密度脂蛋白(LDL)顯著下降，高密度脂蛋白(HDL)顯著提升。同時，可通過抑制腸道α-淀粉酶和α-葡萄糖酶，減少碳水化合物吸收，有效降低餐后血糖值，亦可修復(fù)胰島損傷，改善并發(fā)癥[12]。

“輻照食品”即以放射性元素(銫-137，鈷-60等)的輻照處理來進行殺菌消毒的食品。輻照是一種新型食品保鮮滅菌技術(shù)[13]，在1～5 kGy范圍內(nèi)可以消除食物中的病原微生物，不會影響食物的感官和營養(yǎng)品質(zhì)，同時可節(jié)省大量的能源和時間[14-15]。樺褐孔菌因富含多種活性成分，為避免其在生長期儲存和加工過程中營養(yǎng)成分受微生物污染影響衛(wèi)生質(zhì)量，必須對其進行滅菌處理，但一些有機生物的活性成分也會發(fā)生變化[16]。研究[17]顯示，經(jīng)一定劑量60Co-γ射線照射后能有效殺滅黃精中微生物，但也可能使多糖含量降低。隨著研究的深入，國際食品法典委員會(CAC)于2003年去除了食品輻照加工中10 kGy最大吸收量的限制[18-19]。目前60Co-γ射線輻照對樺褐孔菌多糖的降血糖效果的影響研究尚未見報道。

試驗擬探討經(jīng)60Co-γ射線輻照與未輻照的樺褐孔菌多糖對STZ建模小鼠的降糖效果，以及對其糖耐量、臟器系數(shù)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)和糖化血紅蛋白(GHb)等相關(guān)指標(biāo)是否具有一定影響，能否使其性能得到改善，從而可以進一步擴大應(yīng)用范圍，為輻照技術(shù)在樺褐孔菌多糖降血糖領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

雄性昆明種小鼠：35只，體重20～25 g，延邊大學(xué)動物實驗中心；

樺褐孔菌：長白山科學(xué)院；

鏈脲佐菌素(STZ)：色譜級，美國Sigma公司；

鹽酸二甲雙胍：純度0.5 g/片(以C4H22N5·HCl計)，河北山姆士藥業(yè)有限公司；

檸檬酸、檸檬酸鈉：分析純，天津華東試劑廠；

氯化鈉注射液(0.9%)：吉林康乃爾制藥集團；

葡萄糖粉劑：廣西梧州制藥(集團)股份有限公司；

T-CHO試劑盒、TG試劑盒、GHb試劑盒：南京市建成生物研究所；

苯酚：分析純，天津永晟化工廠；

硫酸：分析純，北京化工廠；

無水乙醇：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

落地式連續(xù)投料粉碎機：DF-35型，溫嶺市林大機械有限公司；

電熱恒溫培養(yǎng)箱：DNP-9082型，上海市精宏設(shè)備股份公司；

血糖儀：AG-605型，天津市九安醫(yī)療公司；

離心機：TG16A-WS型，上海盧湘儀器有限公司；

實驗型冷凍干燥機：LyoQuest-55型，西班牙Telstar集團；

真空泵：DTC-22B型，日本Uluac Kiko公司；

冷凝器：CCA-1111-CE型，東京理化器械株式會社；

水浴鍋：OSB-2100-CE型，東京理化器械株式會社；

渦旋混勻器：MS 3 basic型，德國IKA集團。

1.3 方法

1.3.1 輻照處理 常溫運輸樣品至四川省原子能研究院進行輻照處理。采用60Co-γ輻照裝置，輻照方式為動態(tài)步進。輻照過程以實測值為準(zhǔn)進行劑量(重鉻酸銀和重鉻酸鉀劑量計)跟蹤，劑量計經(jīng)中國劑量科學(xué)院丙氨酸劑量計(NDAS)比對標(biāo)定。γ射線輻照劑量分別為5，10，20，30 kGy，每個劑量3次平行[20-21]。

1.3.2 多糖的提取及含量測定

(1) 多糖提?。豪脽崴岱╗22]。取不同輻照劑量(5，10，20，30 kGy)樺褐孔菌菌粉各5 g，分別添加體積分數(shù)為85%的乙醇并充分混勻，80 ℃水浴2.5 h，溫度降至室溫，4 000 r/min離心10 min，抽濾上清液旋蒸后凍干，即得樺褐孔菌多糖粉末。

(2) 含量測定：利用苯酚—硫酸法。取不同輻照劑量(5，10，20，30 kGy)樺褐孔菌多糖粉末各1 mg，分別使用蒸餾水定容至10 mL，移取1 mL加入苯酚0.5 mL和濃硫酸2.5 mL，混合均勻，沸水浴15 min，溫度降至室溫，測得490 nm處的OD值[23]。

1.3.3 血糖水平及糖耐量測定 小鼠隔夜禁食12 h(晚9:00～早9:00)，剪尾取血，取第2滴血液進行測量。末次灌胃后隔夜禁食測定其糖耐量[24]：經(jīng)口一次性灌胃大劑量葡萄糖溶液后(2 g/kg·BW)，持續(xù)觀察2 h，每30 min測量血糖水平并記錄。

1.3.4 建立糖尿病模型

(1) 鏈脲佐菌素(STZ)配制：將STZ每管5 mg分裝，錫紙包裹。將檸檬酸—檸檬酸鈉溶解配置成緩沖溶液(0.1 mol/L，pH 4.39)，以其溶解STZ配置成12 mg/mL注射液，振蕩混勻，避光冰浴保存，現(xiàn)配現(xiàn)用[25]。

(2) 小鼠造模：禁食過夜后，根據(jù)體重進行一次性大劑量(120 mg/kg·BW)腹腔注射STZ，建立1型糖尿病模型，濃度12 mg/mL，空白組注射相同劑量的緩沖溶液。每組小鼠在30 min內(nèi)完成注射，并在注射后1 h自由進食[26]。最終空腹血糖值高于11.1 mmol/mL為1型糖尿病造模成功[27]。

1.3.5 分組及劑量設(shè)置 如表1所示，35只小鼠隨機分成7組，每組5只。每日給藥一次，連續(xù)30 d記錄體重、食物和水的攝入量。根據(jù)小鼠體重增量與其攝食量的比值求得食物效價(%)。每7 d檢測血糖水平，給藥治療35 d后測量糖耐量，并解剖。

表1 分組及劑量設(shè)置

1.3.6 指標(biāo)測定 受試小鼠解剖時取心、肝、脾和腎，觀察差異，稱量并記錄分析得臟器系數(shù)。受試小鼠取眼血和肝臟，冰浴保存，然后分別按照相應(yīng)試劑盒的使用方法進行操作，測定吸光值，而后分別計算TC、TG和GHb含量[28]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品最佳輻照劑量的選定

經(jīng)測定，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.541x+0.950(R2=0.998)。如表2所示，20 kGy劑量時多糖含量最高，且早在1999年相關(guān)機構(gòu)即提出使用超過10 kGy的吸收劑量的輻照食品是安全的[29]。故試驗選取輻照劑量為20 kGy 的樺褐孔菌用于后續(xù)的動物試驗。

表2 不同輻照劑量處理后的樺褐孔菌多糖含量?

2.2 樺褐孔菌多糖對小鼠基礎(chǔ)指標(biāo)的影響

經(jīng)試驗對比觀察后得：空白組小鼠墊料干燥，毛發(fā)健康，體重增長較快；陰性組小鼠攝食量、飲水量明顯多于其他各組，墊料浸濕嚴(yán)重，毛發(fā)枯黃粗糙，體型瘦??；給藥各組隨給藥次數(shù)的增加狀態(tài)均有好轉(zhuǎn)。

如表3所示，高劑量組體重增量顯著高于陰性組(P<0.05)且與陽性組相近(P>0.05)，其飲水量顯著低于未輻照組(P<0.05)，給藥后高劑量組食物利用率最高，未輻照組最低。綜上，輻照處理可以提高食物利用率，改善糖尿病小鼠健康狀況及“三多一少”癥狀。

2.3 樺褐孔菌多糖對小鼠血液指標(biāo)的影響

2.3.1 空腹血糖 如表4所示，造模1周后除空白組外，血糖均穩(wěn)定在11.1 mmol/L以上，開始給予藥物治療。造模后14 d即給藥1周后，治療組血糖值均有所下降，且隨給藥劑量的增加血糖值逐漸降低，其中在相同的給藥劑量下，輻照組的血糖顯著低于未輻照組(P<0.05)，且持續(xù)1周；末次檢測結(jié)果顯示：給藥組中陽性、高劑量和未輻照的降糖效果相似，且顯著優(yōu)于其他組(P<0.05)。已有動物試驗[30]結(jié)果顯示，藥用真菌樺褐孔菌多糖具有一定的降糖效果，能夠修復(fù)糖尿病小鼠受損胰島β細胞功能，促使胰島素分泌，有效改善小鼠血糖，與試驗中的效果相符。綜上，隨著給藥時間的延長，輻照高劑量組與未輻照組的樺褐孔菌多糖降糖效果均與陽性對照組的療效相似(P>0.05)，但經(jīng)輻照處理后的樺褐孔菌多糖相比于未輻照的起效更快，在給藥后的第1周即可觀察到顯著差異(P<0.05)，且持續(xù)一段時間，而未輻照組在給藥后的第3周降糖效果才與之相似(P>0.05)。

表3 試驗期間各組小鼠體重及攝食飲水情況?

表4 試驗各組小鼠血糖值變化?

2.3.2 糖耐量 如圖1所示，在60～90 min高劑量組、未輻照組和陽性對照組的血糖水平急劇下降，且與空白對照組下降趨勢相似，與陰性對照組有顯著差異(P<0.05)。因此，由STZ導(dǎo)致的小鼠糖耐量水平異常現(xiàn)象在樺褐孔菌多糖干預(yù)下得到了改善，其中高劑量組與未輻照組效果相似，表明輻照并未降低小鼠抗高血糖能力。有體外研究[31]得出，樺褐孔菌多糖有較強的α-葡萄糖苷酶抑制活性，在一定范圍內(nèi)可以提升IR細胞的葡萄糖消耗量。

2.3.3 GHb、TC、TG 由表5可知，高劑量組、未輻照組和陽性對照組的各項檢測值均無顯著性差異(P>0.05)，三者均低于中、低劑量組，并且與陰性對照組差異顯著(P<0.05)。結(jié)合相關(guān)研究[32]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)發(fā)酵處理的樺褐孔菌可使糖尿病大鼠的TC、TG含量明顯降低，說明其具有較佳改善血脂的作用。同時輻照處理并沒有對以上指標(biāo)造成影響，亦不會降低其降糖功效。

2.4 樺褐孔菌多糖對小鼠臟器系數(shù)的影響

由表6可知，心脾臟器系數(shù)無顯著差異(P>0.05)，而肝腎重量均在造模后顯著增加(P<0.05)，經(jīng)樺褐孔菌多糖治療的肝腎系數(shù)顯著低于陰性對照組(P<0.05)。張苗等[33]通過研究得出，樺褐孔菌總多糖對STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠肝臟有保護作用，與試驗結(jié)果相符。但相同給藥劑量下，輻照組的肝臟臟器系數(shù)顯著低于未輻照組(P<0.05)，腎臟臟器系數(shù)與空白組無顯著差異(P>0.05)。說明經(jīng)輻照處理后的樺褐孔菌多糖緩解糖尿病肝腎腫大并發(fā)癥的能力明顯優(yōu)于未經(jīng)輻照的多糖，甚至對肝臟的抗損傷作用明顯好于陽性組。

圖1 給藥劑量對各試驗組小鼠糖耐量的影響

表5 樺褐孔菌多糖對GHb、TC、TG的影響?

表6 樺褐孔菌多糖對各組小鼠臟器系數(shù)的影響?

3 結(jié)論

使用60Co-γ射線輻照技術(shù)滅菌在殺滅微生物的基礎(chǔ)上沒有削弱樺褐孔菌多糖降血糖的作用效果。輻照處理后的樺褐孔菌與未經(jīng)輻照處理的相比，在降血糖方面起效更快(P<0.05)，提前2周即達到效果，很大程度上縮短了治療時間，同時其能夠顯著緩解糖尿病肝腎腫大并發(fā)癥(P<0.05)，且不會對其他臟器造成負擔(dān)。輻照處理也最大程度地保留了其對小鼠血清及糖耐量水平的改善效果。但輻照所引起的具體成分變化和作用機理尚不明確，需在下一步的研究中進行探討。