家蠅抗菌肽MDC協(xié)同慶大霉素抗普通變形桿菌作用研究

陳晴汝 桂水清 盧雪梅

（1.廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院 廣東省生物活性藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510006；2.深圳市第二人民醫(yī)院 深圳大學(xué)第一附屬醫(yī)院中心，深圳 518031）

普通變形桿菌（Bacillus proteus vulgaris）廣泛存在于土壤、水體和糞便污染的物質(zhì)之中。這種細(xì)菌是引起食物中毒的常見(jiàn)致病菌，當(dāng)攝入變形桿菌污染的食物后，可引發(fā)中毒性腸炎和過(guò)敏性中毒等疾?。?］。慶大霉素對(duì)變形桿菌（吲哚陽(yáng)性和陰性）屬的細(xì)菌均有較強(qiáng)的抗菌活性。臨床上慶大霉素可以用于治療由細(xì)菌感染引起的輕微腸炎。由于不恰當(dāng)?shù)氖褂每股兀胀ㄗ冃螚U菌的耐藥率不斷上升，對(duì)頭孢唑林、復(fù)方磺胺甲噁唑都呈現(xiàn)比較高的耐藥性（> 40%），所以尋找能夠與慶大霉素聯(lián)用治療普通變形桿菌感染的藥物，從而減少慶大霉素用量，減緩普通變形桿菌耐藥率上升成為臨床迫切所需［2-4］。

抗菌肽（Antimicrobial peptides，AMP）是一類廣泛存在于生物體中的具有抗菌活性的肽類物質(zhì)，可以抑制病毒、細(xì)菌、真菌、腫瘤細(xì)胞、寄生蟲(chóng)等的生長(zhǎng)，還具有免疫調(diào)節(jié)的作用［5-9］。目前關(guān)于抗菌肽的抗菌機(jī)理主要涉及兩類：膜結(jié)合型與非膜結(jié)合型［10］。膜結(jié)合型模式下陽(yáng)離子型抗菌肽可通過(guò)靜電作用結(jié)合到負(fù)電荷的細(xì)菌細(xì)胞膜表面，通過(guò)改變膜構(gòu)象或形成疏水性離子通道，導(dǎo)致細(xì)菌因內(nèi)容物泄露而死亡［11］。非膜結(jié)合型模式下抗菌肽可通過(guò)抑制細(xì)胞壁合成、抑制細(xì)胞呼吸、抑制細(xì)胞外膜蛋白合成等導(dǎo)致靶細(xì)胞死亡［12］。與傳統(tǒng)的抗生素相比，抗菌肽不易產(chǎn)生耐藥性，且副作用小。

昆蟲(chóng)抗菌肽是昆蟲(chóng)血淋巴中形成的一類抗菌肽，在昆蟲(chóng)受到外界微生物的刺激時(shí)，能夠大量迅速地合成。家蠅抗菌肽（Musca domestica cecropin，MDC）是本實(shí)驗(yàn)室從家蠅幼蟲(chóng)脂肪體cDNA文庫(kù)中克隆的一種昆蟲(chóng)抗菌肽。實(shí)驗(yàn)室的前期研究證明MDC能夠在體外殺死金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus），大腸埃希氏菌（Escherichia coli，E.coli）等多種革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌［13-14］。更為重要的是，我們發(fā)現(xiàn)家蠅抗菌肽可快速殺滅多重耐藥大腸桿菌（臨床分離株MDR E.coli，GIM1.457），且在高達(dá)200 μmol/L的濃度范圍內(nèi)對(duì)人紅細(xì)胞沒(méi)有毒性［13］。

慶大霉素是一種氨基糖苷類藥，其抗菌機(jī)制是作用于細(xì)菌體內(nèi)的核糖體，抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成，并破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性［15］?？咕腗DC能夠破壞細(xì)菌細(xì)胞膜或穿過(guò)細(xì)菌細(xì)胞膜作用于胞內(nèi)靶位點(diǎn)，作用機(jī)制獨(dú)特，不易產(chǎn)生耐藥性，從抗菌機(jī)制上分析二者可以聯(lián)合應(yīng)用，但兩藥聯(lián)合對(duì)變形桿菌的抗菌作用研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬通過(guò)對(duì)抗菌肽MDC和慶大霉素的體外聯(lián)合抗菌作用及其機(jī)制研究，評(píng)價(jià)兩藥的聯(lián)合用藥效果，并利用流式細(xì)胞術(shù)和電子顯微鏡術(shù)對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討，以期為臨床上兩藥的聯(lián)合使用，減少慶大霉素用量及毒副作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

普通變形桿菌ATCC 49027購(gòu)自廣東省微生物菌種保藏中心；家蠅抗菌肽（純度97.15%；分子量：4301.59 Da 由北京中科亞光生物科技有限公司合成）；硫酸慶大霉素注射液購(gòu)自廣州白云山天心制藥股份有限公司；TSBg培養(yǎng)基購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。CO2培養(yǎng)箱，德國(guó)New Brunswick公司；熒光倒置顯微鏡，德國(guó) Leica公司；流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD公司；酶標(biāo)儀，美國(guó) Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 MDC和慶大霉素抗菌效果研究 采用微量肉湯稀釋法分別測(cè)定MDC及慶大霉素對(duì)普通變形桿菌的最小抑菌濃度（Minimal inhibit concentration，MIC）和最小殺菌濃度（Minimum bactericidal concentration，MBC）。在96孔板的每個(gè)對(duì)應(yīng)孔中加入100 μL稀釋好的菌液（1×106CFU/mL），MDC（2 mg/mL-4 μg/mL）及慶大霉素（128 μg/mL - 0.25 μg/mL）藥液倍比稀釋后加入100 μL，放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。次日取出96孔板，以小孔內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最小藥物濃度為該藥對(duì)普通變形桿菌的MIC值。在無(wú)菌條件下，取MIC值對(duì)應(yīng)孔及擴(kuò)大梯度濃度的前4個(gè)孔中的菌液各100 μL，依次均勻涂在LB固體培養(yǎng)皿中，倒置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。次日取菌落數(shù)小于5的最小藥物濃度為該藥對(duì)普通變形桿菌的MBC值。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 聯(lián)用抗菌效果研究 以測(cè)得的MDC（藥液甲）或慶大霉素（藥液乙）單用時(shí)對(duì)普通變形桿菌的MIC值和MBC值為基礎(chǔ)，運(yùn)用棋盤法確定分級(jí)抑菌濃度（Fractional inhibitory concentration，F(xiàn)IC）。在96孔板的每個(gè)對(duì)應(yīng)孔中首先加入100 μL的菌液，之后按梯度濃度差異順序依次加入藥液甲50 μL，然后垂直方向按梯度濃度差異順序依次加入藥液乙50 μL，此時(shí)每個(gè)孔中的反應(yīng)體系為200 μL，放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。次日小心取出96孔板，計(jì)算FIC。

FIC指數(shù)=MIC（AB聯(lián)合）/ MIC（A單用）+MIC（AB聯(lián)合）/MIC（B單用）

當(dāng)FIC≤0.5時(shí)，表示A與B之間在抑菌作用中為協(xié)同作用；當(dāng)0.5＜FIC≤1.0，表示A與B之間在抑菌作用為相加作用；當(dāng)1＜FIC＜2時(shí)，表示A與B之間在抑菌作用為無(wú)關(guān)作用；當(dāng)FIC≥2時(shí)，表示A與B之間存在抑菌作用為拮抗作用。

1.2.3 生物膜實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn) 取無(wú)菌6孔板，每孔放入一張干凈的蓋玻片，加入500 μL的菌液（1×106CFU/mL），按照分組（MDC：2×MIC，1×MIC，0.5×MIC；慶大霉素：2×MIC，1×MIC，0.5×MIC；MDC混合慶大霉素，使兩藥終濃度均為1×MIC作為協(xié)同組）依次加500 μL藥液，空白對(duì)照組只加TSBg培養(yǎng)基1 mL，陰性對(duì)照組只加菌液1 mL（每組3個(gè)復(fù)孔），在37℃條件下培養(yǎng)18 h。棄去6孔板中的溶液，加入無(wú)菌生理鹽水重復(fù)清洗3次。然后取99%的甲醇溶液1 mL分別加入到每個(gè)孔中，用來(lái)固定成膜的細(xì)菌，將6孔板放置在室溫約13 min，倒掉孔中溶液，自然揮干。取2%的結(jié)晶紫溶液1 mL分別加入到每個(gè)孔，室溫染色5 min。倒掉孔中溶液，用輕緩的流水沖洗6孔板，將非特異吸附的結(jié)晶紫洗去，封片，標(biāo)記，待稍微凝固后用顯微鏡觀察拍攝。

1.2.3.2 藥物對(duì)生物膜初始附著的影響 取無(wú)菌96孔板，每孔放入一張干凈的蓋玻片，加100 μL的菌液（1×106CFU/mL），按照分組依次加100 μL藥液，空白對(duì)照組只加TSBg培養(yǎng)基200 μL，陰性對(duì)照組只加菌液200 μL（每組3個(gè)復(fù)孔），37℃恒溫培養(yǎng)2 h。洗板，固定步驟同1.2.3.1。然后吸取33%冰乙酸溶液160 μL分別加入到每個(gè)孔中，將96孔板放在搖床上搖10 min。等結(jié)晶紫完全溶解后，在波長(zhǎng)570 nm處檢測(cè)吸光值。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組都要重復(fù)3次。

1.2.3.3 藥物對(duì)成熟生物膜的破壞作用 在無(wú)菌96孔板中，每孔加入100 μL濃度為1×106CFU/mL的菌液，在37℃條件下培養(yǎng)1 d，倒掉孔中的溶液，用生理鹽水清洗3次，洗去游離狀的細(xì)菌。按照分組依次加入100 μL藥液（每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔），在37℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)1 d，倒掉孔中的溶液，洗板，固定，染色，檢測(cè)步驟同1.2.3.2。

1.2.4 對(duì)胞外物質(zhì)含量的影響 取50 μL菌液轉(zhuǎn)種于5 mL肉湯培養(yǎng)基中（170 r/min，37℃），培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，用MH肉湯培養(yǎng)基調(diào)節(jié)OD600值至0.05。搖菌管內(nèi)加入5 mL菌液，同時(shí)加入相應(yīng)藥物組（MDC組終濃度為128 μg/mL，慶大霉素組終濃度為1 μg/mL，生理鹽水作為對(duì)照組）每組重復(fù)6次，37℃恒溫培養(yǎng)8 h。吸取1.8 mL菌液到EP管中，4℃，4 000 r/min，20 min離心棄上清，沉淀加入蒸餾水重溶，加入24 μL的37%的甲醛在4℃保存3 h；取出混合物放至室溫，再加入0.16 mL的NaOH（1 mol/L）在4℃保存3 h，再次離心（4℃，4 000 r/min，20 min），棄上清，所得沉淀用蒸餾水溶解，后續(xù)測(cè)定總糖和總蛋白量。取2 mL菌液，4℃，4 000 r/min，15 min離心后，放置于100℃的烘箱過(guò)夜，次日稱取細(xì)菌干重。蛋白含量用BCA試劑盒測(cè)定。

1.2.5 MDC和慶大霉素抗菌機(jī)制研究

1.2.5.1 熒光染色和流式細(xì)胞術(shù) 在4℃冰箱中取出已經(jīng)復(fù)蘇好的菌液，搖晃混勻，在超凈工作臺(tái)中用移液器吸取100 μL菌液，加入到含有5 mL液體LB培養(yǎng)基的搖菌管中，180 r/min，37℃恒溫?fù)u菌箱培養(yǎng)4 h，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。取出搖菌管，將菌液加入到EP管中3 000 r/min，5 min離心棄上清，收集菌體，用生理鹽水稀釋至5×108CFU/mL，得到每管500 μL的菌液。4組藥物（MDC：2 × MIC，1 × MIC，0.5 × MIC；慶大霉素：2×MIC，1 × MIC，0.5 ×MIC；MDC混合慶大霉素，使兩藥終濃度均為1 ×MIC作為協(xié)同組）分別加入到4管菌液中，最終每管混合液體1 mL。37℃靜置處理1 h。取生理鹽水 1 mL，加入3.7 μL（7.5 mmol/L）PI染液，0.5 μL（5 mmol/L）SYTO 9染液，充分混合后，將混勻夜加入6孔板中，將6孔板放在暗格里染色15 min，用生理鹽水清洗6孔板，以除去未結(jié)合的熒光染料，封片。在熒光顯微鏡下觀察細(xì)菌存活/死亡情況，按照分組情況每組40 ×各取5個(gè)視野。按照以上熒光染色的基本步驟，染色避光處理15 min后，取1 mL各自加入到流式管中，標(biāo)記，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)菌細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5.2 透射電子顯微鏡 藥物作用于細(xì)菌步驟同

1.2.5.1，藥物作用1 h后3 000 r/min，10 min離心棄上清，收集菌體，加入2.5%戊二醛置于4℃固定2 h，用PBS洗滌3次后，再用1%四氧化鋨固定1 h，用PBS洗滌3次。將透射電鏡樣品在分級(jí)乙醇系列中脫水，然后嵌入環(huán)氧樹(shù)脂中制備蠟塊，最后，超薄切片用乙酸鈾-檸檬酸染色。在透射電鏡下進(jìn)行拍攝觀察。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用雙因素方差分析（Two-way ANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MDC和慶大霉素對(duì)變形桿菌的MIC、MBC和FIC值

2.1.1 兩藥單用時(shí)的MIC值和MBC值 MDC對(duì)普通變形桿菌的MIC為 > 128 μg/mL，MBC為 > 1 024 μg/mL（圖1），慶大霉素對(duì)普通變形桿菌的MIC為32 μg/mL，MBC為32 μg/mL（圖2）。

圖1 MDC對(duì)普通變形桿菌的MBC測(cè)定

圖2 慶大霉素對(duì)普通變形桿菌的MBC測(cè)定

2.1.2 兩藥聯(lián)用的FIC指數(shù) MDC和慶大霉素聯(lián)用后，根據(jù)FIC指數(shù)計(jì)算方法計(jì)算FIC= 8/128+8/32 =0.313，F(xiàn)IC＜0.5，說(shuō)明MDC與慶大霉素具有協(xié)同作用，這與預(yù)期結(jié)果相一致。其中，慶大霉素聯(lián)用時(shí)的MIC值是其單用時(shí)的1/4（表1）。

表1 MDC和慶大霉素對(duì)普通變形桿菌的MIC、MBC和FIC

2.2 MDC和慶大霉素對(duì)生物膜作用的研究

2.2.1 藥物對(duì)菌生物膜的形成影響 結(jié)晶紫染色結(jié)果如圖3顯示，空白對(duì)照組中形成的細(xì)菌生物膜比較濃密，MDC和慶大霉素對(duì)其生物膜形成能力的影響隨藥物濃度的梯度變化呈相應(yīng)的梯度變化，且與空白對(duì)照組相比，普通變形桿菌形成的細(xì)菌生物膜比較稀薄。聯(lián)合用藥組在同MIC倍數(shù)濃度組別中，其對(duì)生物膜形成能力的影響也都大于單個(gè)用藥組，表明MDC和慶大霉素在抗普通變形桿菌生物膜方面也具有一定協(xié)同作用。

2.2.2 藥物對(duì)菌初始生物膜附著的影響 從圖4可以得出，與空白對(duì)照組相比，MDC和慶大霉素在低中高濃度均能夠抑制初始生物膜的附著，在低濃度抑制效果不明顯，在中高濃度具有顯著的抑制效果（P＜0.05）。同比MIC倍數(shù)下，兩種藥物單用時(shí)的作用效果相差不大，而兩藥聯(lián)用時(shí)對(duì)生物膜的附著影響增強(qiáng)，說(shuō)明MDC和慶大霉素具有一定的協(xié)同抑制初始生物膜附著的作用。

圖3 普通變形桿菌生物膜結(jié)晶紫染色結(jié)果

圖4 藥物對(duì)普通變形桿菌初始生物膜的影響

2.2.3 藥物對(duì)菌成熟生物膜的破壞作用 統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果如圖5所示，MDC對(duì)普通變形桿菌的成熟生物膜的破壞作用明顯（P＜0.001），但濃度依賴性不顯著，而慶大霉素也對(duì)普通變形桿菌成熟生物膜具有明顯的破環(huán)作用（P＜0.001），破環(huán)作用隨濃度增加而增強(qiáng)。

圖5 藥物對(duì)普通變形桿菌成熟生物膜的影響

2.2.4 生物膜胞外蛋白含量測(cè)定 檢測(cè)藥物對(duì)普通變形桿菌生物膜胞外蛋白含量的影響。圖6為蛋白質(zhì)含量與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖7所示，與空白對(duì)照組相比，慶大霉素處理后，細(xì)菌產(chǎn)生總胞外蛋白質(zhì)（μg）的能力顯著降低（P＜0.001）。MDC處理后，細(xì)菌產(chǎn)生總胞外蛋白質(zhì)（μg）的能力升高，聯(lián)合用藥組蛋白含量低于任一藥物單用時(shí)的蛋白含量，表明兩藥聯(lián)用對(duì)生物膜胞外蛋白也有著一定程度的協(xié)同作用。

圖6 普通變形桿菌胞外蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖7 普通變形桿菌胞外蛋白質(zhì)濃度

2.3 抗菌肽MDC和慶大霉素聯(lián)用抗菌機(jī)制結(jié)果

2.3.1 熒光結(jié)果 由圖8可以看出，空白對(duì)照組經(jīng)SYTO 9和PI熒光染色后，熒光顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)菌全部被染成綠色，MDC組和慶大霉素組可見(jiàn)部分被染成紅色的死菌，而兩藥聯(lián)合作用后，被PI染成紅色的死菌數(shù)量比單一用藥組顯著增多。

2.3.2 流式細(xì)胞術(shù) 結(jié)果如圖9所示，PI染色后的M2區(qū)域反映了細(xì)菌的死亡數(shù)量，與空白對(duì)照組相比，MDC和慶大霉素給藥后，細(xì)菌均有一部分死亡，而兩藥聯(lián)合后，細(xì)菌死亡的數(shù)量顯著上升。

圖8 普通變形桿菌熒光染色結(jié)果

2.4 透射電子顯微鏡結(jié)果

透射電鏡觀察結(jié)果見(jiàn)圖10，空白對(duì)照組為正常普通變形桿菌，菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，具完整細(xì)胞膜及厚細(xì)胞壁，細(xì)胞質(zhì)均勻，內(nèi)部結(jié)構(gòu)密實(shí)。MDC組出現(xiàn)菌體變形，內(nèi)容物外泄。慶大霉素組出現(xiàn)細(xì)胞膜破損，細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)變松散，內(nèi)容物外泄。兩藥協(xié)同組不僅出現(xiàn)細(xì)胞膜破損，內(nèi)容物外泄，同時(shí)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)損壞程度相較于MDC組，慶大霉素組明顯增強(qiáng)。

3 討論

普通變形桿菌廣泛存在于自然界之中，屬于變形桿菌屬，當(dāng)機(jī)體抵抗力下降時(shí)，人們食用普通變形桿菌感染的食物后會(huì)引起食物中毒，輕者導(dǎo)致腹瀉、胃腸炎等各種感染，重者危及生命［2］。本實(shí)驗(yàn)采用梯度倍數(shù)釋法分別測(cè)定MDC及慶大霉素對(duì)普通變形桿菌的MIC值和MBC值，利用棋盤法計(jì)算 FIC值。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)慶大霉素單用時(shí)對(duì)普通變形桿菌有較好的抑制作用，慶大霉素對(duì)菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度一致，而MDC單用時(shí)的抑制作用則不是很明顯，但是將MDC與慶大霉素配伍后，兩藥聯(lián)合對(duì)普通變形桿菌的抑制作用卻十分明顯，表明MDC和慶大霉素聯(lián)合使用時(shí)可以明顯增強(qiáng)慶大霉素的抑菌效果。

圖9 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PI染色細(xì)菌給藥后死亡狀況

圖10 透射電鏡下普通變形桿菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)

由于普通變形桿菌有較強(qiáng)黏附作用，在某種條件下，它可以形成生物被膜來(lái)適應(yīng)環(huán)境的變化。生物被膜能夠幫助細(xì)菌逃避宿主免疫系統(tǒng)的攻擊，使得病原菌能長(zhǎng)時(shí)間存在，這也是造成慢性感染的重要原因之一［16-17］。我們用結(jié)晶紫染色對(duì)其生物膜的形成，初始附著，成熟后破壞以及胞外物質(zhì)含量進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，MDC和慶大霉素都會(huì)抑制生物膜的形成和初始附著且對(duì)成熟生物膜具有殺傷作用，且兩藥同時(shí)作用后效果更明顯。實(shí)驗(yàn)中我們還發(fā)現(xiàn)MDC組蛋白含量明顯超標(biāo)，此問(wèn)題應(yīng)是本身為多肽的MDC的殘留影響，慶大霉素組蛋白含量相較于對(duì)照組有明顯的減少，說(shuō)明其對(duì)生物膜胞外蛋白有著一定程度的溶解作用，聯(lián)合用藥組蛋白含量低于任一藥物單用時(shí)的濃度，可以推測(cè)兩藥聯(lián)用對(duì)生物膜胞外蛋白也有著一定程度的協(xié)同作用。

抗菌肽MDC能破壞普通變形桿菌的細(xì)胞膜從而產(chǎn)生殺菌作用，這也與較多關(guān)于抗菌肽的作用機(jī)制報(bào)道一致［18-19］。SYTO 9可以穿透細(xì)胞壁結(jié)合DNA，PI也可以與DNA結(jié)合，而且能力更強(qiáng)，但是不能透過(guò)完整的細(xì)胞壁，只有細(xì)胞死亡后才可染色成功［20-21］。在氬激光488 nm激發(fā)光下，SYTO 9呈現(xiàn)彌散均勻的綠色熒光，表征活菌，而PI呈現(xiàn)紅色熒光，表征死菌，因此通過(guò)SYTO 9/PI標(biāo)記系統(tǒng)可以反映細(xì)菌的存活狀態(tài)。通過(guò)熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)菌細(xì)胞膜通透性和膜勢(shì)能的改變；結(jié)果顯示MDC和慶大霉素作用后，會(huì)破壞菌細(xì)胞膜，造成一定比例的菌體死亡，且呈時(shí)間和濃度依賴性，兩藥聯(lián)用后死亡數(shù)目顯著增多，說(shuō)明兩者聯(lián)用對(duì)該菌的殺傷效果具有協(xié)同作用。

進(jìn)一步利用透射電鏡觀察兩藥作用后細(xì)菌的細(xì)胞內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果顯示MDC會(huì)損傷菌體細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使其內(nèi)容物溢出，慶大霉素作用后菌細(xì)胞胞內(nèi)結(jié)構(gòu)變松散，細(xì)胞膜的完整性被破壞，兩藥聯(lián)用后效果更為顯著，提示MDC和慶大霉素的作用機(jī)制存在著相輔相成互補(bǔ)的關(guān)系。MDC主要作用機(jī)制為破壞細(xì)胞膜，慶大霉素主要作用于細(xì)菌體內(nèi)的核糖體，抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成，并破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性，這使得配伍后的協(xié)同抗菌作用得以大大提高。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)家蠅抗菌肽MDC對(duì)普通變形桿菌的抑菌效果和殺菌效果較弱，慶大霉素對(duì)普通變形桿菌具有較強(qiáng)的抑制和殺菌效果，而兩藥聯(lián)合使用時(shí)，MDC可以顯著增強(qiáng)慶大霉素對(duì)普通變形桿菌的抑制和殺菌效果，抗菌機(jī)制涉及破壞細(xì)菌細(xì)胞膜和細(xì)菌胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，兩藥形成互補(bǔ)作用。兩藥單用均能夠有效抑制普通變形桿菌生物膜的形成，破環(huán)成熟生物膜的結(jié)構(gòu)，減少胞外蛋白的合成，聯(lián)用后效果更為明顯。