玉米鐵還原酶基因ZmFRO2的功能分析

喬孟欣 李素貞 陳景堂

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 國(guó)家玉米改良中心河北分中心 河北省作物種質(zhì)資源實(shí)驗(yàn)室，保定 071000；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

Fe元素是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中最重要的微量元素之一。Fe在地殼中的含量很高，但在有氧環(huán)境下，F(xiàn)e易與羥基結(jié)合形成不溶態(tài)而不能被植物直接吸收利用［1］。在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，高等植物形成了吸收Fe的不同機(jī)理：即機(jī)理I和機(jī)理II，相應(yīng)的植物稱為機(jī)理I植物和機(jī)理II植物［2］。機(jī)理I植物主要包括雙子葉植物和非禾本科單子葉植物，機(jī)理I植物吸收鐵分為3個(gè)步驟，首先H+-ATPase酸化土壤中的三價(jià)鐵離子，隨后FRO將土壤中的Fe3+還原成Fe2+，再由Fe2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Iron-regulated transporter，IRT1/IRT2）將Fe2+轉(zhuǎn)運(yùn)至植物體內(nèi)以供植物各部分生長(zhǎng)發(fā)育［3］；機(jī)理II植物主要包括禾本科植物，機(jī)理II植物則通過(guò)向胞外分泌植物鐵載體（Phytoziderophore，PS）與土壤中的Fe3+螯合形成Fe3+-PS復(fù)合物，再由專一轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白如黃色條紋蛋白（Yellow stripe-like，YSL）將Fe3+-PS復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)至植物根部細(xì)胞內(nèi)［1］。

FRO基因是機(jī)理I植物吸收鐵過(guò)程中非常重要的組成部分，目前，已在多種植物中被發(fā)現(xiàn)與研究，如擬南芥［4］、番茄［5］、大豆［6］、花生［7］、蒺藜苜蓿［8］和水稻［9］。值得注意的是，水稻是機(jī)理II植物，但是許多研究證明水稻根系中存在具有機(jī)理I特征的基因FRO和IRT的表達(dá)［9-14］。此外，將機(jī)理I和機(jī)理II中的關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)入水稻能顯著提高其產(chǎn)量，Masuda等［15］將大麥麥根酸合成基因IDS3、酵母鐵還原酶基因refre1/372和水稻鐵載體分泌基因IRO2三種基因共同轉(zhuǎn)入水稻得到轉(zhuǎn)基因水稻IRI，發(fā)現(xiàn)IRI的產(chǎn)量比野生型高9倍。近期，一項(xiàng)研究用同位素示蹤法揭示了水稻在鐵充足水培條件下采用機(jī)理I吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)鐵，在缺鐵田間條件下主要采用機(jī)理II［16］。以上關(guān)于水稻吸收轉(zhuǎn)運(yùn)鐵機(jī)理的研究和發(fā)現(xiàn)在機(jī)理I與機(jī)理II之間架起了一座橋梁，也就是說(shuō)，水稻可以采用兩種機(jī)理結(jié)合的方式吸收轉(zhuǎn)運(yùn)鐵。另外Wairich等［17］發(fā)現(xiàn)這種方式不是水稻特有的，也存在于與水稻近緣的物種中，這為想要提高作物植株或種子鐵含量的育種家們打開(kāi)了新視野。

玉米是全世界重要的糧食作物和飼用作物，玉米中微量元素的含量直接關(guān)系到人類的健康。然而，堿性土壤中，玉米極易受到缺鐵脅迫所帶來(lái)的危害。目前，科學(xué)家已經(jīng)完成玉米全基因組測(cè)序，許多與機(jī)理I相關(guān)的基因或基因家族已經(jīng)被分離并研究［18-19］。在轉(zhuǎn)基因擬南芥中，ZmIRT1 和ZmZIP3在不同部位發(fā)揮積累鋅鐵元素的生理功能，F(xiàn)RO基因也已在玉米中預(yù)測(cè)到［20-21］。本研究對(duì)玉米鐵還原酶基因ZmFRO2進(jìn)行了生物信息學(xué)分析、表達(dá)模式分析、亞細(xì)胞定位分析、鐵還原酶活力和鋅鐵含量測(cè)定以初步了解ZmFRO2在玉米中的功能。

1 材料與方法

1.1 ZmFRO2的識(shí)別與生物信息學(xué)分析

在玉米全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//maizesequence.org/index.html）中用Blast搜尋與AtFRO2（GenBank accession No.Y09581）氨基酸序列具有同源性的基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在玉米中，F(xiàn)RO家族目前只有一名成員ZmFRO2。通過(guò)Clustal X Version 2.0對(duì)來(lái)自擬南芥、番茄、大豆、花生、蒺藜苜蓿、水稻、玉米等的FRO進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)并用BOXSHADE（http：//www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html）進(jìn)行染色。用TMHMM預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)跨膜序列。用MEGA version 4.0對(duì)這些來(lái)自不同物種的19個(gè)FRO蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析。這些蛋白質(zhì)的編號(hào)如下：Arabidopsis thaliana（AtFRO1：AEE27309.1，AtFRO2：AEE27308.1，AtFRO3：AEE30323.1，AtFRO4：AED93241.1，AtFRO5：AED93243.1，AtFRO6：AED95851.1，AtFRO7：AED95852.1，AtFRO8：AED95905.1）；Lycopersicum esculentu（LeFRO1：AAP46144.1）；Glycine max（GmFRO2：XP_003528841.1）；Oryza sativa（OsFRO1：BAD18962.1，OsFRO2：BAD18963.1）；Arachis hypogaea（AhFRO1：XP_025631421.1，AhFRO2：XP_025631421.1）；Medicago truncatula（MtFRO1：AAR15416.1，MtFRO2：XP_003594430.1，MtFRO4：XP_003592210.2，MtFRO5：ABN06137.1，MtFRO6：BAD18962.1）；Zea mays（ZmFRO2：ONM17159.1）。

1.2 ZmFRO2表達(dá)量的檢測(cè)

先把蛭石用Hoagland營(yíng)養(yǎng)液浸透，將玉米自交系B73種子點(diǎn)播于育苗盤中，在溫室（14 h光照/10 h 黑暗，26℃）中培養(yǎng)，10 d幼苗長(zhǎng)至2葉一心移入標(biāo)準(zhǔn)Hoagland（100 μmol/L Fe（III）-EDTA）營(yíng)養(yǎng)液中生長(zhǎng)5 d至三葉一心（每3 d換一次營(yíng)養(yǎng)液），三葉一心的玉米幼苗在標(biāo)準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)液和不加鐵的條件下處理0、6、12、24、48、96 h后，分別收取幼苗地上部和根，液氮速凍后于-80℃保存用于總RNA的提取。用RNA提取試劑盒（HuaYueYang，Beijing，China）提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，Japan）合 成cDNA，將cDNA稀 釋20倍作為RT-PCR的模板，擴(kuò)增引物為RTZmFRO2F 5'-AAACCAGCAAGCCTCCACTA-3' 和RTZmFRO2R 5'-ACATCGGTGATGATGCTCCT-3'，體 系 為20 μL，包括：5 μL cDNA，上下游引物各10 μmol/L和10 μL SYBR Green I（TaKaRa），在CFX-96 Real Time Thermal Cycler中擴(kuò)增。參照基因選用ZmActin1（GenBank：J01238.1），擴(kuò) 增 引 物 為ZmActin1F 5'-ATGTTTCCTGGGATTGCCGAT-3' 和 ZmActin1R 5'-CCAGTTTCGTCATACTCTCCCTTG-3'。選 用ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，2次生物學(xué)重復(fù)，3次技術(shù)重復(fù)。

1.3 融合表達(dá)載體的構(gòu)建

將上述合成的cDNA稀釋10倍作為擴(kuò)增ZmFRO2 cDNA（去掉終止子）的模板，擴(kuò)增引物為ZmFRO2GF 5'-CCCTCGAGCTTCCCGGGCCCCTAGA TTC-3' 和ZmFRO2GR 5'-GCTCTAGAGCTGTGGCTG TTGAAATGGAAG-3'，用KOD酶（TOYOBO）擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃ 3 min；94℃ 15 s，58℃ 1 min，68℃ 2 min 30 s，35個(gè)循環(huán)；68℃延伸10 min。將目的基因跑膠回收后構(gòu)建至pRTL2NGFP 載體，融合質(zhì)粒純化后（1-2 μg/μL）用于轉(zhuǎn)化玉米葉肉原生質(zhì)體。

1.4 玉米葉肉原生質(zhì)體的制備及轉(zhuǎn)化

將玉米自交系B73種子種植于用水浸透的蛭石中，置于28℃培養(yǎng)箱中，不提供光照。待玉米黃化苗生長(zhǎng)至三葉一心時(shí)，取第二片葉子中間部分，用刀片切成0.5-1 mm的細(xì)絲；加入酶解液后置于水平搖床（30 r/min）上室溫遮光消化3-4 h；加入等體積的W5緩沖液混勻終止消化；過(guò)濾酶解液，100 g，離心1 min，沉淀原生質(zhì)體；用預(yù)冷的 W5 緩沖液重懸沉淀，冰上放置30 min后計(jì)數(shù)；4℃，100×g，離心1 min，沉淀原生質(zhì)體；加入MMg溶液至原生質(zhì)體的終濃度約為106個(gè)/mL；向200 μL原生質(zhì)體中加入20 μL已純化好的質(zhì)粒，再加入220 μL 40%的PEG-Ca2+溶液，用手輕彈混勻，室溫放置30 min；加入880 μL緩沖液W5，用手輕彈混勻，室溫，100×g，離心1 min；吸棄上清，加入1 mL W5緩沖液，室溫黑暗孵育12-16 h，熒光顯微鏡觀察。

1.5 過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因玉米的獲得

將上述合成的cDNA稀釋10倍作為擴(kuò)增ZmFRO2 cDNA（全長(zhǎng)）的模板，擴(kuò)增引物為35SZmFRO2F 5'-CCAGATCTCTTCCCGGGCCCCTAGA TTC-3' 和35SZmFRO2R 5'-GCGGTCACCTGAACCGA CCAAACGAGACG-3'，用KOD酶（TOYOBO）擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃ 3 min；94℃ 15 s，58℃ 1 min，68℃ 2 min 30 s，35個(gè)循環(huán)；68℃延伸10 min。將目的基因跑膠回收后構(gòu)建至pCAMBIA3301載體，融合質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后用于侵染HiII玉米幼胚［22］。出苗后移至大田與鄭58雜交后再連續(xù)回交，收取BC2F1代種子進(jìn)行表達(dá)量檢測(cè)后用于下一步試驗(yàn)。

1.6 玉米根部鐵還原酶活力的測(cè)定

將轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因玉米種子置于潤(rùn)濕的濾紙上發(fā)芽，14 h光照/10 h黑暗，28℃培養(yǎng)室培養(yǎng)，待根長(zhǎng)約為2-3 cm時(shí)，移入標(biāo)準(zhǔn)Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中生長(zhǎng)至2葉一心，隨后對(duì)所有幼苗進(jìn)行缺鐵處理，0、1、3、5、9 d后，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因玉米幼苗根部的鐵還原酶活力。用檢測(cè)液（0.2 mmol/L CaSO4，5 mmol/L HEPES，pH5.5，0.1 mmol/L Fe（III）-EDTA，0.2 mmol/L BPDS）清洗幼苗根部；將幼苗根部浸沒(méi)于含有50 mL檢測(cè)液的錐形瓶中，于25℃黑暗條件下孵育1 h；將幼苗根部取出，搖晃混勻，于535 nm下讀取溶液的吸光值A(chǔ)，檢測(cè)液作為空白對(duì)照；用吸水紙除去幼苗根部殘余溶液，稱量幼苗根部鮮重FW；用消光系數(shù)28.6 mM-1cm-1計(jì)算Fe（II）-BPDS濃度，根據(jù)比爾定律計(jì)算：鐵還原酶活力（nmol/g FW/h）=5A/（28.6×FW）×104。本試驗(yàn)共測(cè)定2個(gè)轉(zhuǎn)基因事件（OX-1和OX-2），每個(gè)事件3次重復(fù)，每次重復(fù)包含1株幼苗，選擇分離出的陰性植株作為對(duì)照。

1.7 玉米鋅鐵含量的測(cè)定

將轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因玉米種子分別點(diǎn)播于用水浸透的蛭石和盆栽堿性土壤中，14 h光照/10 h黑暗，28℃培養(yǎng)，分別收取三葉一心期幼苗地上部與根部，吐絲期授鄭58花粉，成熟后收取棒三葉與籽粒，將材料洗凈，烘干用于測(cè)定鋅鐵含量。將烘干后的材料粉碎后稱取幼苗地上部，棒三葉各0.3 g，籽粒0.4 g，幼苗根部0.1 g；將稱量好的樣品倒入消解罐底部，向其中加入7 mL硝酸，過(guò)夜消化；加入1 mL H2O2微波消解，徹底消化；將溶液小心轉(zhuǎn)移至容量瓶中（幼苗根部及籽粒溶液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶，幼苗地上部及棒三葉溶液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶），用超純水定容，搖勻后過(guò)濾，濾出液4℃保存待測(cè)；用原子吸收光譜儀測(cè)定各樣品鋅鐵含量；計(jì)算：根/籽粒鋅鐵濃度（μg/g）=機(jī)器測(cè)定濃度（μg/mL）×25 mL/樣品干重（g）；幼葉/棒三葉鋅鐵濃度（μg/g）=機(jī)器測(cè)定濃度（μg/mL）×50 mL/樣品干重（g）。共測(cè)定2個(gè)轉(zhuǎn)基因事件（OX-1和OX-2），每個(gè)事件3次重復(fù)，每次重復(fù)3株混收，籽粒每株2粒，共6粒，選擇分離出的陰性植株作為對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 氨基酸序列比對(duì)

為了找到玉米中的鐵還原酶基因家族，本研究利用已經(jīng)報(bào)道的AtFRO2的氨基酸序列在玉米基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST，僅有一個(gè)FRO基因被找到，即ZmFRO2。ZmFRO2基 因 全 長(zhǎng)4 590 bp，cDNA序列長(zhǎng)2 585 bp，該基因編碼的蛋白質(zhì)具有759個(gè)氨基酸，10個(gè)跨膜區(qū)域，1個(gè)FAD結(jié)合區(qū)，一個(gè)NADPH結(jié)合區(qū)，在V和VII跨膜區(qū)域上有兩對(duì)組氨酸殘基構(gòu)成的亞鐵血紅素結(jié)合區(qū)，在VIII跨膜區(qū)域內(nèi)存在氧化還原標(biāo)志序列（圖1）。這些特征在各物種中的FRO之間高度保守。說(shuō)明ZmFRO2具有發(fā)揮鐵還原酶功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

ZmFRO2與AtFRO1、AtFRO2、AtFRO3、AtFRO4、AtFRO5、AtFRO6、AtFRO7、AtFRO8、LeFRO1、GmFRO2、AhFRO1、MtFRO1、MtFRO2、MtFRO4、MtFRO5、MtFRO6、OsFRO1、OsFRO2等18種FRO蛋白之間的進(jìn)化樹(shù)分析表明 ZmFRO2與OsFRO1 處于同一分支，且兩者與MtFRO2、AtFRO6 和 AtFRO7聯(lián)系緊密并處于同一分支簇中（圖2）。推測(cè)ZmFRO2在玉米植株中的特性與功能與OsFRO1在水稻中，MtFRO2在蒺藜苜蓿中以及AtFRO6 和 AtFRO7在擬南芥中的特性與功能類似。

2.3 ZmFRO2田間表達(dá)模式分析

為了在整體上了解玉米中ZmFRO2的表達(dá)模式，在田間正常生長(zhǎng)的玉米植株上進(jìn)行取樣，取樣部位分別為冠根（C-root）、側(cè)根（L-root、）、莖（Stem）、葉（Leaf）、葉鞘（Sheath）、雄穗（Tassel）、花藥（Anther）、穗軸（Cob）、花絲（Silk）、種皮（Husk）、授粉后10 d的種子（10 seed）、授粉后15 d的胚（15 E）、授粉后15 d的胚乳（15 En）、授粉后20 d的胚（20 E）、授粉后20 d 的胚乳（15 En），對(duì)這15個(gè)樣品進(jìn)行RT-PCR以得到ZmFRO2在這些部位中的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果（圖3）表明，ZmFRO2在葉片中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在其他部位中的表達(dá)量，其次是在葉鞘中的表達(dá)量較高。說(shuō)明在田間正常條件下，玉米中的ZmFRO2主要在葉片中表達(dá)。

2.4 ZmFRO2缺鐵處理表達(dá)模式分析

為了解玉米在缺鐵條件下ZmFRO2的表達(dá)模式，在缺鐵處理后不同時(shí)刻（0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、96 h）分別收取玉米幼苗地上部全部葉片及地下部所有根系進(jìn)行RT-PCR。結(jié)果顯示，在缺鐵處理24 h時(shí)，玉米葉片中ZmFRO2的表達(dá)量顯著高于對(duì)照，而24 h后，顯著低于對(duì)照（圖4-A）；在缺鐵處理6 h時(shí)，玉米根部ZmFRO2的表達(dá)量顯著高于對(duì)照，而6 h后，顯著低于對(duì)照（圖4-B）。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，缺鐵條件對(duì)玉米葉片和根部ZmFRO2表達(dá)的調(diào)控均具有暫時(shí)性，葉片在缺鐵處理24 h之后，根部在缺鐵處理6 h之后，仍受到缺鐵條件的脅迫，甚至ZmFRO2的表達(dá)量比對(duì)照組還低，說(shuō)明缺鐵條件在某一特定時(shí)間誘導(dǎo)，之后則抑制ZmFRO2的表達(dá)。根部對(duì)缺鐵脅迫更為敏感。

2.5 ZmFRO2的亞細(xì)胞定位

亞細(xì)胞定位能夠?qū)崿F(xiàn)目標(biāo)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的精確定位，有助于在細(xì)胞水平上理解目的基因的表達(dá)特性。本試驗(yàn)構(gòu)建了pRTL2NGFP-ZmFRO2融合表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化玉米葉肉原生質(zhì)體，熒光顯微鏡下分別開(kāi)啟綠色激發(fā)光、紅色激發(fā)光、綠色和紅色激發(fā)光和明場(chǎng)觀察發(fā)現(xiàn)，ZmFRO2融合蛋白定位于質(zhì)膜與胞質(zhì)（圖5），跟與其親緣關(guān)系較近的OsFRO1在水稻中、AtFRO6和AtFRO7在擬南芥中的定位均有所不同，ZmFRO2在玉米中的亞細(xì)胞定位有其獨(dú)特性。

圖1 ZmFRO2與其他FRO的氨基酸序列比對(duì)

圖2 ZmFRO2與其他FRO的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

圖3 土壤條件下ZmFRO2在玉米各部位的表達(dá)模式

2.6 轉(zhuǎn)基因玉米ZmFRO2表達(dá)量檢測(cè)

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將pCAMBIA3301-ZmFRO2過(guò)表達(dá)載體（圖6-A）轉(zhuǎn)化玉米，為確認(rèn)ZmFRO2基因在玉米植株中是否過(guò)表達(dá)，取轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因玉米植株（BC2F1）葉片提取總RNA，進(jìn)行Realtime PCR擴(kuò)增檢測(cè)目的基因相對(duì)表達(dá)量，鄭58作為對(duì)照。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)玉米植株中ZmFRO2基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于非轉(zhuǎn)基因玉米植株，是非轉(zhuǎn)基因植株的10-15倍（圖6-B），說(shuō)明在回交轉(zhuǎn)育材料中ZmFRO2基因確實(shí)過(guò)量表達(dá)，該批回交轉(zhuǎn)育材料可作為試驗(yàn)材料進(jìn)行以下試驗(yàn)。

圖4 不同供鐵條件下ZmFRO2在玉米幼苗葉片和根部的表達(dá)模式

圖5 ZmFRO2在玉米葉肉原生質(zhì)體中的定位

2.7 轉(zhuǎn)基因玉米根部鐵還原酶活力的測(cè)定

為了解ZmFRO2在玉米中的生理活性，本試驗(yàn)測(cè)定了在缺鐵處理0、1、3、5和9 d時(shí)轉(zhuǎn)基因和野生型玉米幼苗根部的鐵還原酶活力，野生型作為對(duì)照。結(jié)果（圖7）顯示，在缺鐵處理0、1、3和5 d時(shí)轉(zhuǎn)基因和野生型玉米幼苗根部的鐵還原酶活力均維持在較低水平，最高不超過(guò)205.57 nmol/g FW/h，而且在缺鐵處理3 d時(shí)，轉(zhuǎn)基因和野生型玉米幼苗根部受到的缺鐵脅迫最為嚴(yán)重，兩者根部的鐵還原酶活力均出現(xiàn)最低值，最低為14.51 nmol/g FW/h。此后，轉(zhuǎn)基因玉米幼苗根部的鐵還原酶活力逐漸增加，到缺鐵處理9 d時(shí)，事件OX-2玉米幼苗根部鐵還原酶活力極顯著高于野生型玉米幼苗8.35倍，為631.08 nmol/g FW/h，而事件OX-1玉米幼苗根部鐵還原酶活力還未表現(xiàn)出顯著差異。由此可以看出，在缺鐵條件下，過(guò)表達(dá)ZmFRO2基因能夠提高玉米幼苗根部的鐵還原酶活力，該基因所編碼的蛋白可能具有鐵還原酶功能。

圖6 ZmFRO2在轉(zhuǎn)基因玉米中的表達(dá)

2.8 轉(zhuǎn)基因玉米鋅鐵含量的測(cè)定

為了解過(guò)表達(dá)ZmFRO2基因?qū)τ谟衩子酌缁蛑仓赇\鐵含量的影響，本試驗(yàn)測(cè)定了轉(zhuǎn)基因和野生型玉米幼葉、幼根、成熟葉及籽粒的鋅鐵含量，野生型作為對(duì)照。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因玉米幼苗根部的鐵含量顯著高于野生型玉米幼苗6.84-11.82倍，同時(shí)轉(zhuǎn)基因玉米幼苗根部的鋅含量顯著高于野生型玉米幼苗8.44-9.40倍（圖8-B），說(shuō)明過(guò)表達(dá)ZmFRO2基因不僅能夠增加玉米幼苗根部的鐵含量，而且也能夠間接促進(jìn)Zn在玉米幼苗根部的積累。另外轉(zhuǎn)基因玉米幼葉、成熟葉和籽粒中的Fe含量均近于或顯著高于野生型玉米植株，事件OX-2幼葉中的鐵含量比野生型增加23.43%（圖8-A），成熟葉增加42.53%（圖8-C），籽粒增加17.11%（圖8-D），所以過(guò)表達(dá)ZmFRO2基因能夠不同程度增加玉米幼葉、根部、成熟葉以及籽粒中的鐵含量。

圖7 ZmFRO2過(guò)表達(dá)玉米根部鐵還原酶活力

3 討論

截至目前，F(xiàn)RO家族基因已經(jīng)在多種高等植物中被發(fā)現(xiàn)與研究，如擬南芥、番茄、大豆、水稻、花生、蒺藜苜蓿等。但在玉米中還鮮有報(bào)道，那么玉米中的FRO是否與上述高等植物中的FRO一樣具有還原鐵的功能呢？本研究中，利用擬南芥AtFRO2的氨基酸序列在玉米基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中搜尋到ZmFRO2基因，為了解ZmFRO2與其他植物FRO的結(jié)構(gòu)相似性和進(jìn)化關(guān)系，在ZmFRO2和上述植物中已報(bào)道的FRO之間進(jìn)行了氨基酸序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析。結(jié)果表明，ZmFRO2同樣具有10個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，有富含組氨酸的金屬離子結(jié)合區(qū)和氧化還原特征區(qū)域，具有鐵還原酶的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，推測(cè)ZmFRO2可能具有還原鐵的能力；與OsFRO1、MtFRO2、AtFRO6和AtFRO7親緣關(guān)系較近，其中與OsFRO1的親緣關(guān)系最近，推測(cè)ZmFRO2可能與OsFRO1來(lái)自同一祖先，與OsFRO1、MtFRO2、AtFRO6和AtFRO7的特性相似。

圖8 ZmFRO2過(guò)表達(dá)玉米各部位鋅鐵含量

FRO家族基因的主要表達(dá)部位以及缺鐵條件下的表達(dá)模式已經(jīng)被廣泛研究?？傮w來(lái)說(shuō)，各FRO基因的表達(dá)部位不盡相同，但大部分FRO基因的表達(dá)量會(huì)因缺鐵誘導(dǎo)而升高。AtFRO2主要在擬南芥根部表達(dá)并受缺鐵誘導(dǎo)［23］，AtFRO6和AtFRO7主要在擬南芥地上部表達(dá)，表達(dá)水平穩(wěn)定，不受缺鐵誘導(dǎo)［24-25］，AtFRO3和AtFRO8主要在擬南芥維管系統(tǒng)中表達(dá)并受缺鐵誘導(dǎo)［26］，LeFRO1在番茄植株各部位均有表達(dá)，在根中的表達(dá)受缺鐵誘導(dǎo)［27］，GmFRO2主要在大豆地上部表達(dá)并受缺鐵誘導(dǎo)［6］，OsFRO1和OsFRO2在水稻葉片中表達(dá)，OsFRO2的表達(dá)可由鐵過(guò)量或持續(xù)性缺鐵誘導(dǎo)［10-11］，MtFRO1、MtFRO3-6在蒺藜苜蓿地上部表達(dá)并受缺鐵誘導(dǎo)［8］。本研究中，ZmFRO2主要在玉米葉片表達(dá)，跟與其親緣關(guān)系較近的OsFRO1、AtFRO6和AtFRO7相似；在缺鐵處理的幼苗中，ZmFRO2在葉片和根部的表達(dá)量均出現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，葉片和根部分別在缺鐵處理24 h時(shí)和6 h時(shí)表達(dá)量升高，之后降低，推測(cè)缺鐵條件對(duì)ZmFRO2的表達(dá)先誘導(dǎo)后抑制。

前人研究發(fā)現(xiàn)，AtFRO2定位于質(zhì)膜，具有還原Fe3+的功能［28］；AtFRO6和AtFRO7的亞細(xì)胞定位分別為質(zhì)膜和葉綠體，AtFRO6具有在葉片質(zhì)膜上還原Fe3+的功能［29］，AtFRO7可能在類囊體薄膜上參與Fe3+的還原，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞色素等的合成；AtFRO3和AtFRO8定位在線粒體［25］，與線粒體鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MIT1和MIT2協(xié)同作用維持線粒體與胞質(zhì)之間的鐵平衡［30］；OsFRO1定位在液泡膜，參與維持液泡與胞質(zhì)之間的鐵平衡［31］；LeFRO1定位在細(xì)胞膜，具有鐵還原酶功能［32］。本研究中，玉米葉肉原生質(zhì)體的制備及轉(zhuǎn)化試驗(yàn)結(jié)果顯示，ZmFRO2定位在質(zhì)膜與胞質(zhì)，推測(cè)ZmFRO2在質(zhì)膜上和胞質(zhì)中發(fā)揮還原Fe3+的功能，既能還原胞外Fe3+，又能還原胞內(nèi)Fe3+。

因?yàn)閆mFRO2基因所編碼的蛋白是玉米鐵還原酶，所以想要了解ZmFRO2基因的生理功能，必不可少的就是檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米的鐵還原酶活力。Paolacci等［33］發(fā)現(xiàn)缺鐵條件能夠顯著提高番茄根部的鐵還原酶活力。Andaluz等［34］發(fā)現(xiàn)在缺鐵處理5 d后，蒺藜苜蓿根部的鐵還原酶活力顯著增強(qiáng)。Masuda等［35］將酵母的鐵還原酶基因refre1/372轉(zhuǎn)入水稻中發(fā)現(xiàn)在缺鐵處理3 d后水稻根部鐵還原酶活力升高，表明酵母鐵還原酶基因具有鐵還原酶功能。本研究中，對(duì)轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因玉米幼苗進(jìn)行缺鐵處理，缺鐵處理0、1、3、5、9 d時(shí)檢測(cè)根部鐵還原酶活力，結(jié)果顯示，在缺鐵處理9 d后，轉(zhuǎn)基因玉米幼苗根部的鐵還原酶活力出現(xiàn)顯著升高，約為非轉(zhuǎn)基因玉米幼苗的10倍，推測(cè)ZmFRO2基因所編碼的蛋白具有鐵還原酶活性。事件OX-1沒(méi)有表現(xiàn)出鐵還原酶活力的顯著升高，可能原因一是缺鐵處理天數(shù)不足，可能會(huì)在后期出現(xiàn)顯著升高；二是本試驗(yàn)中收取單株檢測(cè)，并沒(méi)有混收，存在因單株基因型不同導(dǎo)致的表型差異問(wèn)題。

鐵還原酶活性的增強(qiáng)有利于植株對(duì)鐵的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和積累。轉(zhuǎn)refre1/372基因水稻由于根部鐵還原酶活力提高，植株及籽粒中的鐵含量均顯著增加［35］。本研究對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米幼苗、植株或種子進(jìn)行了鋅鐵含量的測(cè)定，分別混合收取三葉期幼苗葉和根，成熟后的棒三葉和籽粒（BC3F1）烘干磨碎消解后用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定鋅鐵含量。結(jié)果顯示，幼苗根部Fe和Zn的含量均顯著增加，表明ZmFRO2基因能夠促進(jìn)Fe在幼苗根部的積累，同時(shí)能夠間接促進(jìn)幼苗根部對(duì)Zn的吸收，這與Vasconcelos等［28］對(duì)AtFRO2的研究結(jié)果一致：AtFRO2不僅可以提高Fe的轉(zhuǎn)運(yùn)效率，也可間接促進(jìn)Zn、Cu、Mn、K、Ni等其他離子的轉(zhuǎn)運(yùn)；幼苗葉片、棒三葉、籽粒中的Fe含量也出現(xiàn)顯著增加，推測(cè)ZmFRO2基因能夠還原更多的Fe到幼苗根部，再次還原更多的Fe到葉片，最終增加籽粒中的Fe含量。事件OX-1成熟葉片中的Fe含量增加不顯著可能是在成熟過(guò)程中葉片中的Fe向繁殖器官大量轉(zhuǎn)移的原因。

基于目前研究結(jié)果，在下一步試驗(yàn)中，本研究將會(huì)深入進(jìn)行對(duì)該基因的功能驗(yàn)證，包括ZmFRO2對(duì)玉米表型的貢獻(xiàn)、對(duì)產(chǎn)量相關(guān)性狀的影響，調(diào)控因素和調(diào)控機(jī)理等，為玉米品質(zhì)育種提供新的功能基因和基礎(chǔ)材料，為提高玉米鋅鐵含量提供新的途徑。

4 結(jié)論

搜尋到預(yù)測(cè)基因ZmFRO2，該基因?yàn)橛衩譌RO基因家族唯一成員，ZmFRO2具有其他植物FRO蛋白所具有的10個(gè)跨膜區(qū)域，F(xiàn)AD結(jié)合區(qū)，NADPH結(jié)合區(qū)，亞鐵血紅素結(jié)合區(qū)和氧化還原標(biāo)志序列；ZmFRO2與OsFRO1、MtFRO2、AtFRO6 和 AtFRO7親緣關(guān)系較近。ZmFRO2是鐵還原酶。

ZmFRO2主要在玉米葉片中表達(dá)，缺鐵處理0 h-96 h內(nèi)，幼苗葉片及根部ZmFRO2的表達(dá)分別在24 h和6 h被誘導(dǎo)，之后則被抑制，推測(cè)ZmFRO2在葉片和根參與Fe3+的還原。亞細(xì)胞定位分析表明ZmFRO2定位在質(zhì)膜和胞質(zhì)，推測(cè)ZmFRO2在質(zhì)膜上和胞質(zhì)內(nèi)參與Fe3+的還原，既能還原胞外Fe3+，又能還原胞內(nèi)Fe3+。

缺鐵條件下，過(guò)表達(dá)ZmFRO2能夠提高鐵還原酶活力、增加植株及籽粒的鐵含量，推測(cè)ZmFRO2具有鐵還原酶活性及功能。