陳明,段萍,徐作剛,萬紅才,劉曉艷
(1.黔南民族醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)?;A(chǔ)醫(yī)學(xué)部藥理學(xué)教研室,都勻 558000;2.黔南州檢驗檢測院食品藥品檢驗所化學(xué)室,都勻 558000)
烏蕨[Stenolomachusanum(L.) Ching.]為鱗始蕨科烏蕨屬的多年生草本植物,又名大葉金花草、烏韭等,在我國主要分布于長江流域以南各省份。從20世紀(jì)60年代開始,國內(nèi)外即有學(xué)者對烏蕨的主要成分、藥理作用、臨床應(yīng)用等方面進行研究。烏蕨植物資源豐富,在醫(yī)藥、畜牧獸醫(yī)、化妝品、園藝栽培等領(lǐng)域均有較大的開發(fā)利用價值。其內(nèi)服治療感冒發(fā)熱、咳嗽、扁桃體炎、腮腺炎、腸炎、痢疾、肝炎、腎炎、食物中毒、農(nóng)藥中毒等;外用可治燒傷、燙傷、皮膚濕疹,近期報道烏蕨還具有降血糖、抗腫瘤的作用[1-5]。烏蕨具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抗酪氨酸酶等生物活性,主要與其含有的黃酮類(葒草苷、葒草苷-2-0-B-D-吡喃葡萄糖苷、牡荊素、牡荊素鼠李糖苷、木犀草苷、芹菜素、山柰酚等),酚酸類(原兒茶酸、原兒茶醛、香草酸、丁香酸等)等化學(xué)成分有關(guān)[6-7]。根據(jù)文獻[8-12],目前主要采用紫外分光光度法測定烏蕨中總黃酮量;有部分研究采用高效液相色譜(HPLC)法同時測定其1~2種活性成分,但同時測定烏蕨中原兒茶酸、原兒茶醛、葒草苷、牡荊素、牡荊素鼠李糖苷、木犀草苷6種活性成分含量的方法筆者未見報道。本研究建立了HPLC同時測定烏蕨中原兒茶酸、原兒茶醛、葒草苷、牡荊素、牡荊素鼠李糖苷、木犀草苷6種活性成分含量的方法,并采集了24個烏蕨樣本進行檢測。報道如下。
1.1儀器 Agilent 1260 DAD VL高效液相色譜儀,DAD紫外檢測器,美國安捷倫科技有限公司;Ultimate 3000高效液相色譜儀,DAD紫外檢測器,美國賽默飛世爾科技公司;賽默飛(Thermo)A型C18(5.0 mm×250 mm,5 μm)色譜柱; Mettler AG 135(感量:0.01 mg)、AL204電子天平(感量:0.1 mg),瑞士梅特勒-托利多公司;SK250LHC超聲波清洗器,上??茖?dǎo)儀器有限公司。
1.2試藥 原兒茶酸對照品(批號:110809-201205,含量99.9%),原兒茶醛對照品(批號:110810-200205,含量100.0%),葒草苷對照品(批號:111777-201302,含量97.9%),牡荊素鼠李糖苷對照品(批號:111668-200602,含量100.0%),牡荊素對照品(批號:111687-201603,含量95.7%),木犀草苷對照品(批號:111720-201106,含量99.3%),均購于中國食品藥品檢定研究院;乙腈(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司色譜純、分析純);娃哈哈純凈水;其他試劑均為分析純。
本實驗采集到不同批次的烏蕨24批,經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院何順志教授鑒定為鱗始蕨科烏蕨屬Stenolomachusanum(L.)Ching.的干燥品。采割地上部分晾干,粉碎,過三號篩,置干燥器中保存,備用。
2.1溶液的制備
2.1.1對照品溶液制備 精密稱取葒草苷21.33 mg、牡荊素鼠李糖苷24.84 mg、木犀草苷16.53 mg分別置50 mL量瓶中,原兒茶醛10.62 mg、牡荊素20.33 mg分別置100 mL量瓶中,原兒茶酸10.13 mg置25 mL量瓶中,分別加65%乙醇超聲溶解,放冷,加65%乙醇至刻度,搖勻,作為對照品儲備液。分別精密量取儲備液加65%乙醇制成每毫升含原兒茶酸0.080 96 mg、原兒茶醛0.031 86 mg、葒草苷0.041 76 mg、牡荊素鼠李糖苷 0.119 2 mg、木犀草苷 0.013 13 mg、牡荊素0.038 91 mg的溶液,作為對照品溶液。
2.1.2供試品溶液的制備[11]烏蕨粉末約2.0 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入65%乙醇50 mL,稱定重量,超聲30 min(53 kHz)后,水浴加熱回流1 h,放冷,再稱定質(zhì)量,用65%乙醇補足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。
2.2色譜條件[12-14]采用賽默飛A型C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱;以乙腈(A)-0.4%磷酸溶液(B)為流動相,梯度洗脫:0~5 min(8%A),5~15 min(8%A→10%A),15~30 min(10%A→27%A),30~31 min(27%A→8%A),31~40 min(8%A),同時設(shè)定兩個檢測波長,原兒茶酸、原兒茶醛檢測波長為280 nm,葒草苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、木犀草苷檢測波長為350 nm。柱溫30 ℃,流速1.0 mL·min-1,精密量取5 μL注入液相色譜儀。
2.3方法學(xué)考察
2.3.1專屬性實驗 精密量取混合對照品溶液和供試品溶液各5 μL注入液相色譜儀,記錄色譜圖,各色譜峰分離度均符合要求(大于1.5)。色譜圖見圖1。
2.3.2線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.1”項下對照品溶液2,5,8,10,15 μL,注入液相色譜儀,按“2.2”項下的色譜條件測定,記錄色譜圖,以峰面積為縱坐標(biāo),質(zhì)量數(shù)(μg)為橫坐標(biāo)進行線性回歸計算。原兒茶酸、原兒茶醛、葒草苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、木犀草苷含量均與峰面積線性關(guān)系良好。見表1。
2.3.3精密度考察 取“2.1.1”項下的對照品溶液,按“2.2”項下色譜方法,重復(fù)進樣6次,測定峰面積。原兒茶酸、原兒茶醛、葒草苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、木犀草苷峰面積的RSD分別為0.18%,0.26%,0.31%,2.09%,1.11%,2.09%,結(jié)果表明儀器精密度良好。
2.3.4穩(wěn)定性考察 取供試品溶液(批號:20140728),分別于0,2,8,12,24 h進樣,進樣量5 μL,測定峰面積。原兒茶酸、原兒茶醛、葒草苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、木犀草苷的RSD分別為2.13%,1.87%,1.67%,1.03%,2.56%,2.22%。說明供試液在24 h內(nèi)均很穩(wěn)定。
2.3.5重復(fù)性考察 取烏蕨樣品(批號:20140728)按“2.1.2”項下方法平行配制6份供試品溶液,取“2.1.1”項下的對照品溶液,按“2.2”項下方法測定峰面積。原兒茶酸、原兒茶醛、葒草苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、木犀草苷的平均含量分別為0.9689,0.6552,1.1995,2.4594,1.1587,0.5745 mg·g-1,RSD分別為 1.83%,1.48%,1.53%,1.36%,1.39%,2.04%。
A.混合對照品溶液 B.供試品溶液 1.原兒茶酸;2.原兒茶醛;3.葒草苷;4.牡荊素鼠李糖苷;5.牡荊素;6.木犀草苷。
表1 原兒茶酸等6種成分線性關(guān)系結(jié)果
2.3.6加樣回收率實驗 精密稱取已測定含量的樣品(批號:20140728)約1.0 g,共6份,分別置具塞錐形瓶中,精密加入原兒茶酸(15.36 mg→500 mL)、原兒茶醛(6.30 mg→500 mL)、葒草苷(13.77 mg→500 mL)、牡荊素鼠李糖苷(12.00 mg→500 mL)、牡荊素(11.68 mg→500 mL)、木犀草苷(16.53 mg→50 mL,取20.00 mL→500 mL)(濃度分別為0.030 69,0.012 60,0.026 96,0.024 00,0.022 36,0.013 13 mg·g-1)的混合對照品溶液50 mL,按“2.1.2”項下方法配制供試品溶液,按“2.2”項下方法測定峰面積。6種活性成分的加樣回收率結(jié)果見表2。
2.3.7樣品測定 取24批樣品按“2.1.2”項下方法配制供試品溶液,取“2.1.1”項下的對照品溶液,按“2.2”項下方法測定上述6種活性成分的含量。測定結(jié)果見表3。
烏蕨活性成分較多,通過紫外掃描,酚酸類主要成分原兒茶酸、原兒茶醛在280 nm有最大吸收或較大吸收;而黃酮類主要活性成分葒草苷、牡荊素、牡荊素鼠李糖苷、木犀草苷在350 nm有較大或最大吸收。在280 nm能夠檢測出6個指標(biāo)成分,但在此波長檢測黃酮類主要活性成分,干擾峰較多,峰純度較低。本實驗條件下其他干擾峰吸收減小或無吸收,能夠排除干擾,達到峰純度檢測要求,因此同時設(shè)定兩個檢測波長測定6個活性成分,方法簡單,結(jié)果準(zhǔn)確。
嘗試選擇乙腈-水、甲醇-0.1%醋酸及乙腈-0.4%磷酸3種流動相進行HPLC梯度洗脫,結(jié)果顯示,乙腈-水、甲醇-0.1%醋酸作流動相,所得部分色譜峰的峰形拖尾,分離度較差;乙腈-0.4%磷酸作流動相,各成分分離度符合要求,所得峰形較好,故選擇乙腈-0.4%磷酸作為烏蕨HPLC分析測定的流動相。
通過測定多批次不同季節(jié)、不同地區(qū)的烏蕨中6種活性成分的含量,可為篩選黃酮含量高的優(yōu)良種源提供參考,也可為今后人工栽培選取優(yōu)良品種。
本方法簡單,結(jié)果準(zhǔn)確,重復(fù)性、穩(wěn)定性較好,有助于烏蕨質(zhì)量控制水平的提高。
表2 原兒茶酸等6種成分回收率實驗結(jié)果
表3 烏蕨樣品測定結(jié)果