網(wǎng)膜素-1調(diào)節(jié)JAK-2/STAT3防止關節(jié)軟骨破壞

李志剛 張耀 田豐德

【摘 要】 基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）在細胞外基質(zhì)的降解和骨關節(jié)炎（OA）的病理進展中起關鍵作用。網(wǎng)膜素-1是新近確定的抗炎脂肪因子，以前鮮有關于網(wǎng)膜素-1在OA中的保護作用的報道。在本研究中，我們的結果表明網(wǎng)膜素-1在人軟骨細胞的mRNA和蛋白水平上均抑制了促炎細胞因子白介素1β（IL-1β）誘導的MMP-1，MMP-3和MMP-13的表達。重要的是，網(wǎng)膜素-1的給藥以劑量依賴性方式消除了IL-1β誘導的II型膠原蛋白（Col II）和聚集蛋白聚糖（關節(jié)軟骨中兩個主要的細胞外基質(zhì)成分）的降解。從機理上講，是因為網(wǎng)膜素-1通過阻斷JAK-2 / STAT3通路改善了干擾素調(diào)節(jié)因子1（IRF-1）的表達。我們的結果表明網(wǎng)膜素-1具有防止關節(jié)軟骨破壞的能力。

【關鍵詞】 骨關節(jié)炎;網(wǎng)膜素-1;基質(zhì)金屬蛋白酶;Ⅱ型膠原

【中圖分類號】R684.3

【文獻標志碼】B

【文章編號】1005-0019（2020）22-196-01

1 前言

包括關節(jié)軟骨退化在內(nèi)的器質(zhì)性改變是骨關節(jié)炎（OA）的關鍵標志。在OA中，軟骨損傷是由于軟骨細胞的分解代謝能力和合成代謝能力之間的平衡失調(diào)引起的[1]。這可能導致膠原蛋白和蛋白聚糖的分解速率超過新基質(zhì)分子的合成速率，從而導致軟骨降解。導致OA軟骨破裂的另一個因素是由關節(jié)軟骨細胞產(chǎn)生的炎性細胞因子的增加，例如白介素1β（IL-1β）。IL-1β是炎性關節(jié)中滑膜細胞、軟骨細胞和侵入性巨噬細胞釋放的促炎細胞因子[2]。已有文獻證明，IL-1β在OA軟骨中顯著增加。最近大量研究表明，IL-1β在OA的發(fā)病機制中起著至關重要的作用。IL-1β的高表達與分解代謝因子的合成有關，例如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）[3]。已有學者在OA軟骨和滑膜組織中發(fā)現(xiàn)了MMP-1、MMP-3和MMP-13的表達增加。值得注意的是，MMP-1、MMP-3和MMP-13的高表達會導致Ⅱ型膠原蛋白（ColⅡ）和軟骨聚集蛋白聚糖的過度降解[4]。當前，沒有能夠延遲OA進展的治療或藥物。然而，干擾MMPs的表達及其隨后的ColⅡ和聚集蛋白聚糖的降解已經(jīng)成為治療OA的重要靶標。

脂肪因子是從脂肪組織中釋放出來的一系列激素，據(jù)報道它們可調(diào)節(jié)多種生物進程，例如能量穩(wěn)態(tài)、炎癥和骨代謝。網(wǎng)膜素-1是一種在內(nèi)臟脂肪中發(fā)現(xiàn)的新型34 kD脂肪因子，在血漿和細胞外液中大量存在。先前的研究表明，網(wǎng)膜素-1具有抗炎作用，并且可以調(diào)節(jié)生物體中的免疫反應[5]。網(wǎng)膜素-1通過抑制p38和JNK的失活并抑制TNF-α誘導的VCAM-1表達而發(fā)揮抗炎作用，并抑制血管平滑肌細胞中超氧化物的產(chǎn)生。另外，網(wǎng)膜素-1抑制了TNF-α介導的血管內(nèi)皮細胞中促炎性分子（如COX-2和eNOS）的誘導作用。這些結果表明網(wǎng)膜素-1可能在OA中發(fā)揮保護作用。我們目前的工作集中于網(wǎng)膜素-1調(diào)節(jié)人軟骨細胞中細胞外基質(zhì)降解中作用的研究。

2 材料和方法

2.1 人軟骨細胞的細胞培養(yǎng)

軟骨樣品來自人股骨頸骨折進行髖關節(jié)置換的患者。將軟骨組織切成小塊，在濃度為0.15%的胰蛋白酶溶液中消化2 h，然后在37 mg的3mg/ml I型膠原酶中孵育，溫度為37°C。離心后，將細胞懸浮在含有10%FCS，2 mM L-谷氨酰胺和1%抗生素（青霉素/鏈霉素）的DMEM/Hams 12（Dulbeccos Modified Eagles Medium/Hams F-12）培養(yǎng)基中。以2×104個細胞/cm2的密度接種細胞，每3-4天更換一次培養(yǎng)基。將融合的原代軟骨細胞用人重組網(wǎng)膜素-1分別以100、200、300 ng/ml的濃度處理24小時，然后再用IL-1β（10 ng/mL）刺激24小時。

2.2 分離總RNA和實時PCR

從原代培養(yǎng)的軟骨細胞中提取細胞內(nèi)RNA。使用2μgRNA和Omniscript試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄。使用Go Taq QPCR預混液在LC480 LightCycler real-time PCR系統(tǒng)上進行了real-time PCR實驗。GAPDH用作內(nèi)標，使用ΔΔCt方法計算基因表達。

2.3 蛋白質(zhì)印跡分析

在行指定的處理后，使用含有蛋白酶抑制劑混合物的細胞裂解緩沖液裂解細胞樣品。使用二辛可寧酸（BCA）方法測定蛋白質(zhì)濃度。用8%～12%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離等量的提取蛋白（10μg），并通過電印跡轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上2 h。將印跡在5%脫脂奶粉中于室溫封閉1小時，然后在4°C抗孵育過夜。然后將膜用含0.05%Tween-20的TBS（TBS-T緩沖液）洗滌3次，然后與過氧化物酶結合的二抗在37°C下孵育1小時。最后，用增強的化學發(fā)光（ECL）試劑盒（顯影印跡。

2.4 免疫熒光顯微鏡

使用免疫熒光顯微鏡分析人軟骨細胞中IRF-1蛋白的表達水平。用DPBS洗滌3次后，將細胞在室溫下用4%甲醛固定10分鐘，然后在室溫下用2.5%BSA封閉1小時。然后，將細胞與抗IRF1抗體（1：500）在含有2.5%BSA和0.1% Tween-20的PBS中于4°C孵育過夜。接下來，將樣品用PBS洗滌3次，然后用Alexa進行探測 Fluor 488偶聯(lián)二抗（1：1000）在室溫下放置1小時。然后將細胞用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽（DAPI）復染，并使用熒光顯微鏡進行分析。

2.5 統(tǒng)計分析

所有實驗數(shù)據(jù)至少重復3次。結果以平均值±SD表示，并通過GraphPad Prism版本5.0軟件使用T檢驗或方差分析（ANOVA）進行了分析。P <0.05的差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 網(wǎng)膜素-1抑制MMP-1，MMP-3和MMP-13的表達

IL-1β誘導的軟骨基質(zhì)降解是由MMPs、軟骨聚集蛋白聚糖酶和其他分解代謝酶介導的。MMP-1，MMP-3和MMP-13裂解ColⅡ?qū)⒅苯踊蜷g接的影響細胞外基質(zhì)[16]。因此，我們分別通過實時熒光定量PCR和蛋白質(zhì)印跡分析評估了網(wǎng)膜素-1對MMP-1，MMP-3，MMP-13基因表達和蛋白質(zhì)表達的影響。我們的結果表明，IL-1β處理可顯著提高MMP-1，MMP-3和MMP-13的mRNA水平和蛋白表達，而網(wǎng)膜素-1處理可抑制這種表達。

3.2 Omentin-1改善人原代軟骨細胞中ColⅡ和聚集蛋白聚糖（Aggrecan）的降解

Aggrecan和ColⅡ是OA病理過程中MMP降解的兩種最重要的蛋白質(zhì)類型。因此，我們通過蛋白質(zhì)印跡分析研究了網(wǎng)膜素-1在蛋白水平上對Aggrecan和ColⅡ表達的影響。用不同濃度（100、200、300ng / ml）的網(wǎng)膜素-1預處理人原代軟骨細胞24小時，然后再用IL-1β（10 ng / mL）刺激24小時。結果表明，IL-1β顯著降低了Aggrecan和ColⅡ蛋白的表達水平，這通過用網(wǎng)膜素-1以濃度依賴性的方式來防止。

3.3 Omentin-1抑制IRF-1表達

干擾素調(diào)節(jié)因子1（IRF-1）是重要的轉(zhuǎn)錄因子，與IL-1β誘導的炎癥反應相關，并參與MMPs的表達。此外，IRF-1在OA的生理過程中也起著重要作用[17]。我們通過real-time PCR和免疫熒光染色分別在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平上檢測了IRF-1的表達。結果表明，網(wǎng)膜素-1在IL-1β誘導的mRNA和蛋白水平上均顯著降低IRF-1的水平。

3.4 omentin-1對JAK2 / STAT3途徑激活的影響

JAK2/STAT3通路已被證明參與調(diào)節(jié)OA中的IRF-1和MMP表達。我們的研究表明，IL-1β治療可顯著提高軟骨細胞中STAT3的酪氨酸磷酸化水平。通過以劑量依賴的方式施用網(wǎng)膜素-1可以改善STAT3的激活。此外，JAK2抑制劑AG490成功阻斷了IL-1β誘導的STAT3磷酸化，從而抑制了IL-1β對IRF-1的誘導，表明JAK2和STAT3參與了這一作用。

4 討論

網(wǎng)膜素-1是一種必需的新型脂肪因子，主要在內(nèi)臟脂肪組織中產(chǎn)生。網(wǎng)膜素-1以其慢性抗炎能力而聞名。網(wǎng)膜素-1抑制腫瘤壞死因子（TNF）-α誘導的環(huán)氧合酶（COX）-2表達。據(jù)報道，脂肪因子在軟骨細胞和滑膜細胞中均有表達。另外，在OA的病理生理過程中，脂肪因子表達的改變與炎癥反應和分解/合成代謝的作用有關[7]。但是，關于網(wǎng)膜素-1的軟骨保護作用的信息鮮有報道。因此，本研究首次探討了網(wǎng)膜素-1抑制IL-1β誘導的MMPs表達以及隨后軟骨中Aggrecan和ColⅡ降解的濃度依賴性。

MMPs在維持ECM的代謝平衡中起著至關重要的作用[8]。然而，已證明MMP的上調(diào)與OA的進展有關。IL-1β處理誘導了分解代謝基因的表達，包括MMP-1，MMP-3，MMP-9和MMP-13 [9]。值得注意的是，在低水平炎癥條件下，MMP-1，MMP-3和MMP-13在軟骨細胞中的ColⅡ和Aggrecan的降解中起關鍵作用。因此，MMP-1，MMP-3和MMP-13被認為是軟骨降解的關鍵調(diào)節(jié)劑，并已成為關節(jié)炎治療的有效靶標。在這項研究中，我們發(fā)現(xiàn)網(wǎng)膜素-1可以抑制這三種蛋白水解酶，在OA治療中具有重要作用。MMP基因表達的上調(diào)受JAK / STAT通路的激活控制。MMP-1和MMP-3的誘導是通過JAK /STAT3途徑介導的[10]。此外，白介素6（IL-6）及其可溶性受體（sIL-6R）通過聚集蛋白聚糖降解酶ADAMTS-4，ADAMTS-5 / 11和MMP-3和膠原降解酶的誘導誘導軟骨降解。MMP-1和MMP-13由STAT1/3激活介導因此可見，促炎性細胞因子（如IL-1β）激活JAK2 / STAT3在OA的慢性炎癥驅(qū)動中起關鍵作用[11]。

當前的研究表明網(wǎng)膜素-1抑制了JAK-2/STAT3通路的激活，表明網(wǎng)膜素-1在炎癥中具有新的抑制作用。綜上所述，我們的發(fā)現(xiàn)首次表明網(wǎng)膜素-1阻止了IL-1β誘導的人軟骨細胞中Aggrecan和ColⅡ的降解。網(wǎng)膜素-1通過抑制JAK-2/STAT3途徑改善了MMP的表達。這些結果表明網(wǎng)膜素-1可能是潛在的軟骨保護性治療劑。

參考文獻

[1] M.B. Goldring， S.R. Goldring Osteoarthritis[J].J Cell Physiol，213（2007）626–634.

[2] Bradley Axelrod，Robert Heilbronner，Jeffrey Barth，Glenn Larrabee，David Faust，Neil Pliskin，Jerid Fisher，Cheryl Silver. Official Position Statement of the National Academy of Neuropsychology[J]. Archives of Clinical Neuropsychology，2000，15（5）.

[3] Rose K Davidson，Jasmine G Waters，Lara Kevorkian，Clare Darrah，Adele Cooper，Simon T Donell，Ian M Clark. Expression profiling of metalloproteinases and their inhibitors in synovium and cartilage[J]. Rose K Davidson;Jasmine G Waters;Lara Kevorkian;Clare Darrah;Adele Cooper;Simon T Donell;Ian M Clark，2006，8（4）.

[4] Tan Bee K，Adya Raghu，F(xiàn)arhatullah Syed，Chen Jing，Lehnert Hendrik，Randeva Harpal S. Metformin treatment may increase omentin-1 levels in women with polycystic ovary syndrome.[J]. Diabetes，2010，59（12）.

[5] Bee K. Tan，Raghu Adya，Harpal S. Randeva. Omentin： A Novel Link Between Inflammation， Diabesity， and Cardiovascular Disease[J]. Trends in Cardiovascular Medicine，2010，20（5）.

[6] Peng-fei Hu，Jia-peng Bao，Li-dong Wu. The emerging role of adipokines in osteoarthritis： a narrative review[J]. Molecular Biology Reports，2011，38（2）.

[7] Peng-fei Hu，Jia-peng Bao，Li-dong Wu. The emerging role of adipokines in osteoarthritis： a narrative review[J]. Molecular Biology Reports，2011，38（2）.

[8] Tung Jayne T，Arnold Carolyn E，Alexander Lee H，Yuzbasiyan-Gurkan Vilma，Venta Patrick J，Richardson Dean W，Caron John P. Evaluation of the influence of prostaglandin E2 on recombinant equine interleukin-1beta-stimulated matrix metalloproteinases 1， 3， and 13 and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1 expression in equine chondrocyte cultures.[J]. American journal of veterinary research，2002，63（7）.

[9] Behera Aruna K，Thorpe Cheleste M，Kidder J Michael，Smith Wendy，Hildebrand Ethan，Hu Linden T. Borrelia burgdorferi-induced expression of matrix metalloproteinases from human chondrocytes requires mitogen-activated protein kinase and Janus kinase/signal transducer and activator of transcription signaling pathways.[J]. Infection and immunity，2004，72（5）.

[10] Saara Aittomki，Marko Pesu. Therapeutic Targeting of the JAK / STAT Pathway[J]. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology，2014，114（1）.