沙門氏菌噬菌體的研究與應(yīng)用

(昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,云南昆明 650500)

沙門氏菌(Salmonella)是腸桿菌科、沙門氏菌屬中的一種典型革蘭氏陰性致病性菌，嚴重危害人體和動物的健康。根據(jù)動物感染沙門氏菌的方式可分為急性、慢性、隱性等多種感染[1]。據(jù)統(tǒng)計，中國每年約有1.6萬～3.6萬余次病例患者是由于感染沙門氏菌而引起的相關(guān)疾病，當人體和動物感染沙門氏菌后大多表現(xiàn)為無明顯癥狀，少部分表現(xiàn)出某些臨床癥狀，嚴重者可引起動物繁殖能力下降甚至造成死亡。因此如何有效預(yù)防和治療沙門氏菌引起的食源性疾病，已然變得迫在眉婕。目前，預(yù)防和控制沙門氏菌的主要方式為添加抗生素，然而隨著抗生素大量添加至食品中已出現(xiàn)明顯的抗生素濫用現(xiàn)象，使得沙門氏菌對抗生素的耐藥性也逐漸凸顯，致使食品中抗生素含量超標，嚴重影響食品的品質(zhì)。因此，未來亟需找到一種合適的抗生素替代品用以替代抗生素的使用。研究發(fā)現(xiàn)噬菌體具有來源廣泛、特異性強等多重優(yōu)點，或許可以利用沙門氏菌噬菌體來達到有效控制細菌性感染和治療細菌性炎癥，從而廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)療衛(wèi)生、工業(yè)等多個領(lǐng)域[2]。

1 噬菌體的生物學(xué)特性

噬菌體是指一類能夠賦予宿主菌生物學(xué)性狀的遺傳物質(zhì)，也是指侵襲細菌、放線菌、真菌等微生物的一類病毒總稱，廣泛存在于自然界中，大小通常在20～200nm之間。噬菌體大部分由有尾部的蛋白衣殼包裹的線性雙鏈DNA組成，少部分由無尾部的衣殼包裹的線性單鏈DNA、雙鏈DNA或環(huán)狀RNA組成。其中單鏈DNA噬菌體在宿主體內(nèi)進行DNA復(fù)制時可合成一種干擾細菌肽聚糖的酶，從而導(dǎo)致細菌細胞壁破裂死亡，而雙鏈DNA噬菌體則主要是通過在DNA復(fù)制末期合成有關(guān)蛋白類水解酶，使宿主細胞的細胞壁破碎死亡[3]。同時，根據(jù)噬菌體的生活周期又可分為裂解性噬菌體和溶原性噬菌體兩大類。其中裂解性噬菌體的繁殖主要依靠吸附于細菌的細胞膜表面識別相應(yīng)受體，向細胞內(nèi)注入遺傳物質(zhì)完成基因組的復(fù)制和病毒蛋白合成，進而在宿主體內(nèi)加工形成子代噬菌體。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的高速發(fā)展和深入探索，研究發(fā)現(xiàn)噬菌體基因組中存在著可編碼特定酶的相關(guān)基因，這種基因編碼產(chǎn)生的特定酶類物質(zhì)可使宿主細胞DNA與蛋白質(zhì)合成轉(zhuǎn)換為一種新的噬菌體顆粒，分泌產(chǎn)生一種穿孔素與細胞特定膜受體結(jié)合形成孔隙，致使細胞破裂，最終導(dǎo)致死亡[4]。因此，噬菌體療法作為殺滅細菌的新方法未來或許可能成為新的發(fā)展趨勢和研究熱點。

2 沙門氏菌噬菌體的獲得方法及分類

沙門氏菌噬菌體一般可以直接從畜禽體內(nèi)或畜禽生活區(qū)周圍環(huán)境中獲得。不同學(xué)者報道的分離噬菌體方法略有差異，但目前仍主要通過采樣、富集、分離、純化四個步驟來分離獲得。采集樣品的方法主要分為兩種，一種是直接法，直接采集宿主菌生長的生物體作為樣品進行分離獲得；另一種是間接法，根據(jù)宿主菌的生長特性從它生長的周圍環(huán)境中采集樣品間接獲得。富集培養(yǎng)的目的在于提高噬菌體與其宿主菌懸液混合菌體的效價，使的噬菌體分離率大幅度提高。隨后可借助5000-8000r/min的高速離心機離心5-10min使得多于雜質(zhì)離心沉淀，再取上清液經(jīng)0.22um的微孔濾膜過濾，除去雜菌初步分離獲得噬菌體懸液。進一步分離獲得純化的噬菌體，可采用直接涂布法或瓊脂平板涂布法將噬菌體懸液與目的宿主在培養(yǎng)基上混合培養(yǎng)獲得噬菌斑，利用噬菌斑上的噬菌體與宿主進行多次感染，以達到進一步純化噬菌體，最后，可將獲得沙門氏菌噬菌體保存于無菌EP管中并加入1滴氯仿，于4℃冰箱保存[5]。

目前根據(jù)最新的命名系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)的兩種沙門氏菌，分別為邦戈沙門氏菌和腸炎沙門氏菌。其中大多為嚴格意義上的人類病原體，另一些則為與動物相關(guān)的特殊病原體，且以它們?yōu)樗拗鞣蛛x獲得的沙門氏菌噬菌體大多數(shù)為一種裂解性噬菌體。這種噬菌體為有尾的二十面體結(jié)構(gòu)，基因組序列大小多在16～86kb范圍內(nèi)，熱耐受性大多在60℃以下，酸堿耐受性大多介于5～10之間。據(jù)不完全統(tǒng)計，目前所獲得的沙門氏菌噬菌體在種屬分類上主要包括腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌兩種噬菌體，與此同時，研究發(fā)現(xiàn)某些家禽中存在著一些具有一定特異性的沙門氏菌噬菌體，例如傷寒沙門氏菌和雞白痢沙門氏菌噬菌體等[6]。

3 沙門氏菌噬菌體的研究及應(yīng)用

3.1 沙門氏菌噬菌體在食品中的應(yīng)用

沙門氏菌是目前最主要引起食源性疾病的致病菌之一，在食品中如何有效、安全殺滅沙門氏菌已成為一個全球化的熱點，而利用噬菌體療法或許可以解決這問題。早在1934年，美國科學(xué)家就曾利用噬菌體感染腸球菌發(fā)現(xiàn)對其治愈率高達90%。近年來，隨著噬菌體研究的深入推進，發(fā)現(xiàn)噬菌體作用于食品中的多種致病菌都有明顯殺菌的效果。有研究表明利用熒光標記噬菌體的特異位點基因跟蹤其侵染大腸桿菌，發(fā)現(xiàn)噬菌體可以識別并殺滅食品中大腸桿菌；或者也可將噬菌體制備成一種微囊，作用于鮮牛奶、蛋清和肉湯中對于病原菌的去除具有有顯著殺菌效果。因此，將高效安全沙門氏菌噬菌體的應(yīng)用于殺滅食品中的沙門氏菌將成為可能。

3.2 沙門氏菌噬菌體在工業(yè)中的應(yīng)用

不僅如此，噬菌體在工業(yè)中也有重要的應(yīng)用價值。目前，有研究發(fā)現(xiàn)添加具有特異性的噬菌體至待測培養(yǎng)基中可借助其用于觀察病原菌的裂解過程，從而用于食品宿主病原菌檢驗。噬菌體還可以作為工業(yè)產(chǎn)品化學(xué)防腐劑的替代品在生物防治中應(yīng)用，且許多研究均表明噬菌體在食品工業(yè)應(yīng)用中具有經(jīng)濟、高效、無副作用和可替代工業(yè)產(chǎn)品如抑菌劑、抗生素等多重優(yōu)勢。因此，隨著噬菌體的廣泛應(yīng)用和深入研究，噬菌體必將對人類生產(chǎn)生活產(chǎn)生巨大的影響。同時，沙門氏菌噬菌體作為噬菌體的一種，其可能也蘊含著一種或多種潛在應(yīng)用價值。

3.3 沙門氏菌噬菌體在醫(yī)療、農(nóng)業(yè)以及其他方面的應(yīng)用

沙門氏菌噬菌體不僅可以食品中作為預(yù)防和控制沙門氏菌引起的食源性疾病和作為抗生素替代品替代品之一，它還在醫(yī)療、農(nóng)業(yè)及其他方面得到廣泛應(yīng)用。例如從家禽養(yǎng)殖場的糞便樣本中分離到的一個廣譜沙門氏菌噬菌體SaFB14，利用該噬菌體對感染的小鼠進行治療，發(fā)現(xiàn)較高菌體濃度的小鼠沙門氏菌感染小鼠時，可以保護40%的小鼠不受感染且使用同樣劑量的噬菌體連續(xù)喂給小鼠3天后發(fā)現(xiàn)存活率提高到了60%。這一結(jié)果表明：噬菌體SaFB14在小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出了廣泛的宿主范圍和良好的活性，可以用來對抗沙門氏菌引起的相關(guān)疾病。同時有學(xué)者曾綜述過噬菌體對于鮭鱒魚體內(nèi)的嗜水氣單胞菌、殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種中的嗜冷黃桿菌、柱狀黃桿菌、魯氏耶爾森菌等致病菌引起的疾病治療有較為明顯的效果。這些結(jié)果均表明，將沙門氏菌噬菌體有關(guān)的噬菌體作用于農(nóng)業(yè)養(yǎng)殖中治療細菌性疾病具有巨大的應(yīng)用潛能[7]。

4 沙門氏菌噬菌體在應(yīng)用中的挑戰(zhàn)與未來展望

噬菌體擁有殺滅治療細菌性疾病和替代抗生素的獨特優(yōu)勢，還具有強大的特異性對除致病菌以外的其他細菌并無殺傷作用且對于機體正常菌群基本不會產(chǎn)生影響。同時，將噬菌體應(yīng)用于治療細菌性疾病時主要通過感染-繁殖-裂解等一系列的循環(huán)殺滅機制致使細菌死亡，這種方式表現(xiàn)為低毒性對機體而言也不會引起強烈的免疫反應(yīng)。不僅如此，研究發(fā)現(xiàn)將噬菌體作用于醫(yī)療、農(nóng)業(yè)、工業(yè)等方面時具有良好的經(jīng)濟效應(yīng)，因其分布廣泛與常見宿主菌相伴存在。同時，可借助宿主菌為誘餌在污水、土壤和動物體內(nèi)快速分離獲得相關(guān)的目標噬菌體。因此，不難發(fā)現(xiàn)噬菌體來源廣泛，成本低廉，這對于實際生產(chǎn)在經(jīng)濟成本中占據(jù)極大優(yōu)勢。與此同時，隨著沙門氏菌噬菌體的研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)其對于食源性疾病的預(yù)防和控制能夠起到很多好的效果且還能應(yīng)用于相關(guān)畜產(chǎn)品在飼養(yǎng)中有關(guān)細菌性疾病的預(yù)防。

噬菌體在治療由沙門氏菌引起的食源性疾病、代替抗生素、甚至用于可以用于細胞的檢驗與檢測等多個方面，但它也面臨著許多挑戰(zhàn)與不足。經(jīng)初步總結(jié)發(fā)現(xiàn)其存在著以下問題：（1）噬菌體具有高度的專一性，但其分離獲得的來源往往與宿主菌同源。因此，自然環(huán)境或動物體內(nèi)分離獲得的噬菌體常出現(xiàn)只能夠感染一種或幾種類似的宿主，作用范圍極為狹窄。（2）噬菌體在應(yīng)用于田間時還受到環(huán)境氣候變化、環(huán)境因子等的影響。（3）它自身還具有很強的免疫原性，可作為一種異源物質(zhì)。（4）研究沙門氏菌噬菌體的主要目的是用于食源性疾病預(yù)防與控制，但在這些方面也存在著許多問題，需要未來進一步的深入探討。最后，盡管噬菌體療具有很好的應(yīng)用前景，但利用噬菌體生產(chǎn)的產(chǎn)品作為一種生物制品，目前，中國還尚未頒布詳細的法律法規(guī)指導(dǎo)應(yīng)用。因此，噬菌體療法在我國如需進一步推動應(yīng)用于實際生產(chǎn)中不僅需要取得產(chǎn)品技術(shù)上創(chuàng)新，而且還需要進一步完善相應(yīng)的政策法規(guī)。