腥臭衛(wèi)矛花發(fā)育過程揮發(fā)性成分的SPME-GC-MS分析

劉志紅，解 慶

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，北方功能油料樹種培育與研發(fā)山西省重點實驗室，山西 太谷 030801)

腥臭衛(wèi)矛（Euonymus sanguineusLoes. var.paedidusL. M. Wang）是衛(wèi)矛屬（EuonymusL.）植物石棗子（E.sanguineusLoes.）的變種，落葉灌木，秋季葉色變紅，為彩色葉樹種。二歧聚傘花序，花基數(shù)4，花瓣卵形，淡黃色；花期4月底至6月，開花時植株周圍彌漫著強烈的腥臭味，是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一具刺激性氣味的衛(wèi)矛屬植物[1-2]，有些人近距離吸入會有頭痛、惡心等不良反應(yīng)，花凋謝后刺激性氣味隨之消失。衛(wèi)矛屬植物大多用于殺蟲消毒、治療跌打損傷、活血止血及抗腫瘤等作用。目前，已對衛(wèi)矛（E. alatus(Thunb.) Sieb.）[3-4]、扶芳藤（E. fortune(Turcz.) Hand.-Mazz.）[5]、冬青衛(wèi)矛（E. japonicasThunb.）[6]、白杜（E. maackiiRupr）[7]、刺果衛(wèi)矛（E. acanthocarpusFranch.）[8-9]、疏花衛(wèi)矛（E. laxiflorusChamp. ex Benth.）[10]、黃心衛(wèi)矛（E. macropterusRupr.）[11]、陜西衛(wèi)矛（E.schensianusMaxim.）[12]等多個樹種的化學(xué)成分進行了分析，主要成分有生物堿、萜類、黃酮類、甾體和強心苷等，如衛(wèi)矛堿、異衛(wèi)矛堿、雷公藤堿、衛(wèi)矛羰堿、新衛(wèi)矛羰堿、槲皮素、香橙素、兒茶素、無羈萜、熊果醇、β-谷甾醇、衛(wèi)矛酮、草酰乙酸鈉等，這些成分并未使植株在生命周期中產(chǎn)生不良?xì)馕丁?/p>

植物器官或組織隨著結(jié)構(gòu)的分化和成熟，所含揮發(fā)性成分的種類和相對含量會產(chǎn)生不同程度的差異[13-16]。那么，使腥臭衛(wèi)矛在開花時呈現(xiàn)刺激性氣味的主要揮發(fā)性成分是什么？由花的哪個結(jié)構(gòu)釋放？這些問題未見研究報道，制約了對腥臭衛(wèi)矛的認(rèn)知與應(yīng)用。

頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（SPMEGC-MS）是研究揮發(fā)性成分的有效手段[17-19]，為了探明與腥臭衛(wèi)矛開花時所釋放刺激性氣味相關(guān)的化合物和結(jié)構(gòu)來源，利用SPME-GC-MS法，對腥臭衛(wèi)矛花序中不同發(fā)育時期的花（苞）以及花綻開時的花瓣和花盤揮發(fā)性成分進行了分析鑒定，為腥臭衛(wèi)矛刺激性氣味的產(chǎn)生提供科學(xué)參考，為衛(wèi)矛屬植物的分類、演化與應(yīng)用提供化學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

供試材料為新鮮腥臭衛(wèi)矛二歧聚傘花序中不同發(fā)育時期的小花（苞），于2018年4—5月采于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物園。小花苞形成（V1），花苞膨大呈綠色（V2），花苞膨大頂端露出部分黃色花瓣（V3），花瓣完全露出花萼但聚攏未展開（V4），小花完全展開（V5），小花（苞）各時期V1、V2、V3、V4、V5寬度（最寬處）分別為1.43±0.24、1.88±0.11、2.84±0.06、3.16±0.10、8.25±0.13 mm。解剖處于V5期小花的花瓣（Y1）與花盤（Y2）兩部分亦作為試驗材料。

50/30 μm DVB/CAR/PDMS三相萃取頭，美國Supelco公司；Triplus RSH型多功能自動進樣器，美國Thermo Scientific公司；OM-5MS（30 m ×0.25 mm × 0.25 μm）色 譜 柱，美 國Omni Gene LLC公司；Trace 1300 ISQ氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Thermo Scientific公司。

2 研究方法

2.1 腥臭衛(wèi)矛花SPME條件

根據(jù)Uekane等[20]的方法并做相應(yīng)修改，即取供試材料各0.5 g置入5 mL頂空瓶中，在50℃下萃取30 min后，萃取頭于氣相色譜進樣口250℃解吸5 min，進行GC-MS分析。

2.2 腥臭衛(wèi)矛花GC-MS條件

2.2.1 色譜條件 載氣為氦氣，進樣口溫度250℃，柱溫采用程序升溫，40℃初始溫度保持3 min，以4℃·min-1升至160℃，再以20℃·min-1升至240℃，保持5 min不分流進樣。

2.2.2 質(zhì)譜條件 離子源為EI源；離子源溫度為280℃；質(zhì)譜傳輸線280℃；電子能量為70 eV；質(zhì)核比掃描范圍30～500 amu。

2.3 數(shù)據(jù)分析

圖 1 腥臭衛(wèi)矛花不同發(fā)育時期及部位揮發(fā)性成分總離子流程圖Fig. 1 The total ion chromatogram of chemical constituents of E. sanguineus var. paedidus flowers

GC-MS分析所得總離子流色譜圖（圖1），不同階段分離出的化合物，試驗出報告時根據(jù)含量多少取前100種進行后續(xù)分析。各組分經(jīng)NIST（MS Search 2.0）標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫檢索比對，并參考已發(fā)表文獻[21]進行初步確認(rèn)，再與Adams[22]所述各化合物出峰順序進行核對，按峰面積歸一化法確定成分含量。運用Excel 2016軟件對所得的成分進行統(tǒng)計分析，并用XLSTAT2018軟件進行主成分分析（PCA），利用SPSS21.0軟件進行多重比較（MC）和聚類分析（HCA）。

3 結(jié)果與分析

3.1 腥臭衛(wèi)矛花揮發(fā)性成分分析

采用SPME-GC-MS法對腥臭衛(wèi)矛花的揮發(fā)性成分進行分析，共鑒定出58個化合物（表1），總含量范圍從96.51%（V2期）到98.56%（V5期），相對含量較高的化合物包括芳樟醇（0.15%～70.79%）、葉醇（0.41%～65.51%）、苯乙腈（0.04%～62.20%）、2-乙烯基-1,1-二甲基-3-亞甲基 環(huán) 己 烷（0.02%～32.99%）、(E)-β-羅 勒 烯（0.25%～21.26%）、α-蒎烯（0.02%～20.41%）、D-檸檬烯（1.01%～11.74%）、水楊酸甲酯（0.14%～6.14%）。

不同發(fā)育時期的腥臭衛(wèi)矛花揮發(fā)性成分差異較大，V1期共鑒定出44種成分，其含量合計達(dá)97.08%，主要成分為葉醇（65.51%）、水楊酸甲酯（5.79%）、D-檸檬烯（5.21%），占全部成分的76.51%；V2期共鑒定出43種成分，其含量合計達(dá)96.51%，主要成分為葉醇（62.26%）、D-檸檬烯（11.74%）、水楊酸甲酯（6.14%）、2-乙烯基-1,1-二甲基-3-亞甲基環(huán)己烷（5.30%），占全部成分的85.44%；V3期共鑒定出48種成分，其含量合計達(dá)97.57%，主要成分為2-乙烯基-1,1-二甲基-3-亞甲基環(huán)己烷（32.99%）、葉醇（26.56%）、(E)-β-羅勒烯（21.26%）、芳樟醇（5.17%），占全部成分的85.98%；V4期共鑒定出48種成分，其含量合計達(dá)98.41%，主要成分為芳樟醇（30.17%）、2-乙烯基-1,1-二甲基-3-亞甲基環(huán)己烷（19.69%）、葉醇（17.14%）、苯乙腈（15.00%）、(E)-β-羅勒烯（5.96%），占全部成分的87.96%；V5期共鑒定出47種成分，其含量合計達(dá)98.56%，主要成分為芳樟醇（51.21%）、α-蒎烯（10.90%）、苯乙腈（10.30%）、葉醇（9.86%）、2-乙烯基-1,1-二甲基-3-亞甲基環(huán)己烷（8.08%），占全部成分的90.35%。由花苞分化到開花，葉醇顯著減少，芳樟醇顯著增多，苯乙腈激增。

花瓣與花盤的揮發(fā)性成分也存在較大差異，花瓣（Y1）共鑒定出37種成分，其含量合計達(dá)98.44%，主要為芳樟醇（70.79%）和α-蒎烯（20.41%），占全部成分的91.20%；花盤（Y2）共鑒定出46種成分，其含量合計達(dá)98.48%，主要為苯乙腈（62.20%）、2-乙烯基-1,1-二甲基-3-亞甲基環(huán)己烷（10.89%）、葉醇（7.37%）、α-蒎烯（6.28%），占全部成分的86.74%。

3.2 腥臭衛(wèi)矛花揮發(fā)性化合成分PCA和HCA分析

以58種腥臭衛(wèi)矛花揮發(fā)性成分均值構(gòu)成7 ×58的矩陣，運用XLSTAT 2018軟件進行PCA分析，結(jié)果（圖2）表明：第1主成分（F1）方差貢獻率為58.89%，第2主成分（F2）方差貢獻率為30.53%，累計貢獻率達(dá)89.42%，說明前2個主成分可代表樣品主要揮發(fā)性成分的組成。因此，提取前2個主成分進行腥臭衛(wèi)矛花的特征揮發(fā)性成分分析。第1主成分中異戊醇、己醛、1-戊烯-3-醇、芳樟醇、葉醇、α-蒎烯和2-莰烯的貢獻率最大，對應(yīng)的特征向量均大于0.80；第2主成分中苯乙腈、苯甲醛、檜烯和順-2-己烯醇貢獻最大，對應(yīng)的特征向量分別為0.923、0.866、0.866、0.806。

腥臭衛(wèi)矛花發(fā)育的5個時期與開花期不同部位在PCA雙標(biāo)圖中被聚成4大類（化學(xué)型），其中，V1和V2期聚為1類，屬于葉醇型；V3與V4期聚為1類，此類成分復(fù)雜，化學(xué)型不明顯；V5期和Y1（花瓣）聚為1類，為芳樟醇型；Y2（花盤）獨自為1類，屬于苯乙腈型。聚類分析結(jié)果（圖3）與主成分分析結(jié)果完全一致，亦可將其分為4大類。可見葉醇、芳樟醇和苯乙腈3種成分在腥臭衛(wèi)矛花發(fā)育的不同時期及部位中相對含量差異顯著，可以用于區(qū)分花發(fā)育的時期及花瓣和花盤。

3.3 腥臭衛(wèi)矛開花期刺激性氣味分析

腥臭衛(wèi)矛開花期的刺激性氣味為強烈的魚腥草氣味，起初推測該氣味主要來源于魚腥草素（癸酰乙醛），在腥臭衛(wèi)矛花中并未檢出魚腥草素，腥臭衛(wèi)矛開花期的刺激性氣味與魚腥草素?zé)o關(guān)。

在腥臭衛(wèi)矛開花時含量激增的成分可能與刺激性氣味有關(guān)，主要是苯乙腈。苯乙腈俗名氰化芐，具刺激性，吸入后出現(xiàn)頭痛頭暈、惡心、嘔吐、倦睡、上呼吸道刺激、神志喪失等，可引起死亡。苯乙腈在V5期的花瓣中未檢出，在花盤中相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)62.20%，說明苯乙腈主要由花盤中釋放。

表 1 腥臭衛(wèi)矛花不同發(fā)育時期及部位揮發(fā)性成分及其相對含量Table 1 Relative content of essential oil compositions in different development stages and parts of E. sanguineus var. paedidus flowers

續(xù)表 1

圖 2 腥臭衛(wèi)矛花不同發(fā)育時期及部位揮發(fā)性成分PCA分析所得biplot雙標(biāo)圖Fig. 2 Biplot obtained by PCA of chemical constituents of E. sanguineus Loes. var. paedidus L. M. Wang flowers

圖 3 腥臭衛(wèi)矛花不同發(fā)育時期及部位揮發(fā)性成分的聚類分析Fig. 3 HCA analysis based on chemical constituents of E. sanguineus Loes. var. paedidus L. M. Wang flowers

雖然V5期存在大量香氣成分，如芳樟醇（51.21%）、α-蒎烯（10.90%）、葉醇（9.86%）、D-檸檬烯（2.00%）、(E)-β-羅勒烯（1.28%）等，但是花盤釋放高含量的苯乙腈掩蓋了美好的氣味，使植株呈現(xiàn)刺激性氣味。另外，V5期的花瓣和花盤中分別含有微量的2-莰醇（0.45%和0.01%），也可能是刺激性氣味的來源成分。2-莰醇，吸收后有微毒，可能引起過敏反應(yīng)，接觸后可引起頭痛、惡心、嘔吐及驚厥[23]。

4 討論

本研究利用SPME-GC-MS技術(shù)，對腥臭衛(wèi)矛花序中不同發(fā)育時期的花（苞）及花綻開時的花瓣和花盤中的揮發(fā)性成分進行了分析鑒定，從中鑒定出了絕大多數(shù)（96.51%～98.56%）成分。研究表明，腥臭衛(wèi)矛花的揮發(fā)性成分主要為芳樟醇、葉醇、苯乙腈、2-乙烯基-1,1-二甲基-3-亞甲基環(huán)己烷、(E)-β-羅勒烯、α-蒎烯、D-檸檬烯和水楊酸甲酯，且腥臭衛(wèi)矛花不同發(fā)育時期或開花期花瓣和花盤中的揮發(fā)性成分差異較大。從腥臭衛(wèi)矛開花期（V5）鑒定出了47種成分，未檢出53種成分，其中，未檢出成分含量占比極少，僅1.13%，未檢出成分種類龐雜且占比極少，對腥臭衛(wèi)矛花的風(fēng)味影響不大。腥臭衛(wèi)矛開花時激增的刺激性成分主要為苯乙腈，且僅存在于花盤中，占總成分的62.20%。

苯乙腈屬芳香性烴類物質(zhì)，在瑪咖（Lepidium meyeniiWalp.）根[24]、日本枇杷（Eriobotrya japonica(Thunb.) Lindl.）花[25]以及某些柑橘屬植物品種（Citrus unshiuBlanco ‘Chahara’、C. unshiuBlanco‘Okitsu’、C. unshiuBlanco ‘Zorica’）的蜜腺[21]等植物器官中均有發(fā)現(xiàn)，但并未使植物本身產(chǎn)生不良?xì)馕?。腥臭衛(wèi)矛在花開時苯乙腈急劇釋放，濃度激增，可能苯乙腈達(dá)到一定濃度時，便由芳香性氣味變?yōu)榱钊瞬挥鋹偟奈兜馈?/p>

苯乙腈存在于腥臭衛(wèi)矛的花苞分化到開花的整個過程中，V1和V2期含量極少，隨著花瓣和花盤的分化，在V4期含量大量增加，但V4期的花并未呈現(xiàn)刺激性，說明此時苯乙腈仍未釋放，直到V5期才經(jīng)花盤中的外分泌結(jié)構(gòu)釋放出來。Konarska[26]發(fā)現(xiàn)，扶芳藤和歐洲衛(wèi)矛（E. europaeusLinnaeus）的特化花托中都存在缺乏維管組織的光合蜜腺，花蜜通過蜜腺氣孔（扶芳藤）或蜜腺氣孔和分泌細(xì)胞壁（歐洲衛(wèi)矛）流出。腥臭衛(wèi)矛可能也存在類似的結(jié)構(gòu)，苯乙腈隨花蜜一起釋放。

巨型虎杖（Fallopia sachalinensisHoutt.）、蘋果（Malus pumilaMill.）等葉器官受到食草動物侵害時，會釋放包括苯乙腈在內(nèi)的揮發(fā)性混合物[27-28]。Yamaguchi等[29]證實，日本弧麗金龜（Popillia japonicaNewman）侵染或茉莉酸甲酯（MeJA）處理巨型虎杖葉片時，由L-苯丙氨酸（L-phenylalanine）合成苯乙腈，細(xì)胞色素P450催化合成前體(E/Z)-苯乙醛肟（PAOx）向苯乙腈轉(zhuǎn)化，CYP71AT96基因可能參與了苯乙腈的生物合成。與原變種石棗子相比，腥臭衛(wèi)矛在開花期釋放腥臭味的現(xiàn)象可能與調(diào)控苯乙腈合成的基因序列發(fā)生變異有關(guān)。

5 結(jié)論

腥臭衛(wèi)矛花序中不同發(fā)育時期的花及開花時花瓣和花盤揮發(fā)成分差異顯著。PCA和HCA分析將腥臭衛(wèi)矛花發(fā)育的5個時期與開花時（V5期）不同部位的揮發(fā)性成分被聚成4大類，V1和V2期屬于葉醇型；V3與V4期聚為1類，成分復(fù)雜，化學(xué)型不明顯；V5期和Y1為芳樟醇型；Y2屬于苯乙腈型。腥臭衛(wèi)矛開花期的刺激性氣味主要來源于花綻開時（V5期）花盤釋放的大量苯乙腈，與魚腥草素?zé)o關(guān)。