小型豬骨膜干細胞的分離與鑒定

王安鴻 史尉利 余慧鐳 傅欣 段小寧 胡曉青 郭秦煒

北京大學第三醫(yī)院運動醫(yī)學科，北京大學運動醫(yī)學研究所，運動醫(yī)學關(guān)節(jié)傷病北京市重點實驗室（北京100191）

關(guān)節(jié)軟骨是關(guān)節(jié)重要的組成部分，能承受和平衡應力負荷，在關(guān)節(jié)活動中起著重要作用，關(guān)節(jié)軟骨損傷后會造成疼痛等癥狀，影響關(guān)節(jié)活動，造成功能障礙，若得不到良好的治療，會逐漸進展為骨關(guān)節(jié)炎，甚至導致殘疾[1]。但軟骨缺乏血管、神經(jīng)、淋巴等組織，無法有效地進行自我修復，臨床上的傳統(tǒng)手術(shù)如微骨折術(shù)等又無法再生關(guān)節(jié)軟骨[2，3]。自體軟骨細胞移植需二次手術(shù)，操作復雜、耗時長，易造成移植物的增生肥大，且軟骨細胞體外擴增時經(jīng)常出現(xiàn)去分化和軟骨細胞的表型無法維持穩(wěn)定等問題[4-6]。因此，國內(nèi)外開展了眾多以多向潛能間充質(zhì)干細胞為基礎(chǔ)的組織工程技術(shù)用于修復關(guān)節(jié)軟骨損傷，應用較多的主要有骨髓、滑膜和脂肪起源的干細胞[7]，但現(xiàn)有的研究表明這些干細胞修復效果不佳[8-10]。因此，尋找更為有效的種子細胞是目前組織工程的一項重要任務(wù)。Reinholz 等將兔脛骨近端內(nèi)側(cè)骨膜經(jīng)轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth fac?tor，TGF-β）和胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）處理后體外培養(yǎng)，結(jié)果顯示骨膜生發(fā)層的厚度和細胞數(shù)都顯著增加，成軟骨的能力也增加了近12 倍[11]。在他們的后續(xù)實驗中，將兔骨膜經(jīng)TGF-β預處理后，再將骨膜移植物移植到骨軟骨缺損區(qū)，能促進缺損區(qū)的組織更新修復[12]。而在我們的前期研究中，在脛骨近端內(nèi)側(cè)骨膜下注射TGF-β后，骨膜的生發(fā)層可出現(xiàn)明顯的增殖反應[13]。結(jié)合文獻和我們的前期工作，推測動物骨膜的生發(fā)層可能存在骨膜祖細胞或骨膜起源的干細胞。鑒于此，本研究旨在從哺乳動物分離、鑒定骨膜干細胞，驗證動物骨膜中存在骨膜起源的干細胞，探索為軟骨損傷修復的組織工程技術(shù)提供細胞來源。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

貴州小香豬3 只，1月半（離乳，未成年），體重約15 kg。本實驗已通過北京大學生物醫(yī)學倫理審查委員會審批。

1.2 實驗材料

DMEM培養(yǎng)基（Thermo Fisher，31600034）、FITC標記的鼠抗豬單克隆抗體CD90（BD Pharmingen，555595）、PE 標記的鼠抗豬的單克隆抗體CD105（EX?BIO，1P-453-T100）、FITC標記的鼠抗豬的單克隆抗體CD45（INVITROGEN，MA5-28383）、APC標記的鼠抗豬的單克隆抗體CD44（EXBIO，1A-341-T100）、FITC 標記的鼠抗豬的單克隆抗體CD14（INVITROGEN，MA5-28286）、Ⅰ型膠原酶、Ⅱ型膠原酶、青霉素、鏈霉素、PBS、胎牛血清、成骨誘導分化培養(yǎng)基試劑盒（Cyagen，HUXMA-90021）、成軟骨誘導分化培養(yǎng)基試劑盒（Cya?gen，HUXMA-90041）、成脂肪誘導分化培養(yǎng)基試劑盒（Cyagen，HUXMA-90031）、離心機、流式細胞儀（Flow Cytometer，F(xiàn)CM）、倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)（LEICA）等。

1.3 骨膜來源的細胞分離培養(yǎng)

分離：取豬髂骨近端內(nèi)側(cè)骨膜，加入含I00 UI/ml青霉素G，100 UI/ml 鏈霉素的PBS 中，在濃度為500 UI/ml抗生素（雙抗）浸泡10 min，PBS沖洗3遍，眼科剪剪碎成勻漿。消化：準備含10%胎牛血清（FBS）和上述濃度抗生素的DMEM 培養(yǎng)基，加入0.125%Ⅰ型膠原酶+0.125%Ⅱ型膠原酶，37℃消化4.5 h 左右。6000 r離心，4 min，懸浮置于培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)：將上述培養(yǎng)皿放置于標準的細胞培養(yǎng)條件中（95%的潮濕空氣，5%的CO2）培養(yǎng)3 天，3 天后觀察細胞形態(tài)，見散在的具有干細胞形態(tài)的細胞，每周換液2 次。2 周后觀察，細胞增殖迅速。

1.4 流式細胞學表面標志鑒定

細胞培養(yǎng)至P3 代，4℃，PBS 清洗3 遍，調(diào)整密度約為2.5×106/mL，加入APC、FITC 或PE 標記的抗CD90，CD44，CD105，CD14，CD45的單克隆抗體4 μL，避光孵育30～45 min，流式細胞學分析。

1.5 三系分化

1.5.1 成骨分化

當細胞融合度達到80%～90%時，用0.25%Tryp?sin-0.04%EDTA進行消化。將消化下來的細胞按照2×104 cells/cm2的細胞密度接種在事先包被0.1%明膠的六孔板中，每孔加入2 mL 完全培養(yǎng)基。將細胞置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。當細胞融合度達到60%～70%時，小心地將孔內(nèi)完全培養(yǎng)基吸走，向六孔板中加入2 mL 干細胞成骨誘導分化完全培養(yǎng)基。每隔3天換用新鮮的干細胞成骨誘導分化完全培養(yǎng)基（使用前需預熱至37℃）誘導2～4周后，視細胞的形態(tài)變化及生長情況，用茜素紅進行染色。成骨誘導分化結(jié)束后，吸走六孔板中的成骨誘導分化完全培養(yǎng)基，用1×PBS 沖洗1～2 次。每孔加入2 mL 4%中性甲醛溶液，固定30 min。吸走中性甲醛溶液，用1×PBS 沖洗2次。每孔中加入1 mL 茜素紅染液染3～5 min。吸走茜素紅染液，用1×PBS 沖洗2～3 次。將培養(yǎng)板置于顯微鏡下觀察成骨染色效果。

1.5.2 成軟骨分化

進行成軟骨誘導分化實驗之前，需要對常規(guī)消化后的細胞進行計數(shù)。將3～4×105個細胞轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，250 g離心4 min。吸去上清。加入0.5 mL預混液，重懸上一步離心所得沉淀，以清洗細胞，室溫下150 g 離心5 min。重復步驟3，再次清洗細胞。將上一步所得沉淀用0.5 mL 干細胞成軟骨誘導分化完全培養(yǎng)基重懸。室溫下150 g 離心5 min。擰松離心管蓋以便于氣體交換，將其放置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。成軟骨誘導分化結(jié)束后，吸走六孔板中的成軟骨誘導分化完全培養(yǎng)基，用1×PBS 沖洗1～2次。每孔加入2 mL 4%中性甲醛溶液，固定30 min。吸走中性甲醛溶液，用1×PBS 沖洗2 次。每孔中加入1 mL阿利辛藍染液染3～5 min。吸走阿利辛藍染液，用1×PBS沖洗2～3次。將培養(yǎng)板置于顯微鏡下觀察成軟骨染色效果。

1.5.3 成脂分化

當細胞融合度達到80%～90%時，用0.25%Tryp?sin-0.04%EDTA 進行消化。消化下來的細胞按照2×104 cells/cm2的細胞密度接種在六孔板中，每孔加入2 mL 完全培養(yǎng)基。將細胞置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。每隔3 天換液，直到細胞融合度達到100%或者過融合。小心地將間質(zhì)干細胞完全培養(yǎng)基吸走，向六孔板中加入2 mL干細胞成脂誘導分化培養(yǎng)基A液。誘導3天后，吸走六孔板中的A液，加入2 mL干細胞成脂誘導分化培養(yǎng)基B液。24 h后，吸走B液，換回A 液進行誘導。 A 液和B 液交替作用3～5 次后（12～20天），繼續(xù)用B 液維持培養(yǎng)4～7天直到脂滴變得足夠大、圓。B液維持培養(yǎng)期間，每隔2～3天需要換用新鮮的B 液。成脂誘導分化結(jié)束后，吸走六孔板中的干細胞成脂誘導分化培養(yǎng)基，用1×PBS 沖洗1～2次。每孔加入2 mL 4%中性甲醛溶液，固定30 min。吸走中性甲醛溶液，用1×PBS 沖洗2 次。每孔中加入1 mL 油紅O 染料工作液染色30 min。吸走油紅O 染液，用1×PBS 沖洗2～3 次。將培養(yǎng)板置于顯微鏡下觀察成脂染色效果。

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài)學觀察

從骨膜分離的細胞體外培養(yǎng)約3 周后，在倒差顯微鏡下觀察，可見大量細胞，細胞胞體較大，細胞呈梭形或不規(guī)則三角形生長，胞質(zhì)向外伸出長短不同的突起，排列整齊。見圖1。

圖1 骨膜分離的細胞體外培養(yǎng)3周的細胞形態(tài)（×10）

2.2 流式細胞學鑒定結(jié)果

本研究選用CD44、CD90、CD105、CD14 和CD45 進行流式細胞學檢測，結(jié)果顯示，從骨膜分離的細胞表達CD44、CD90 和CD105，而CD14 和CD45 呈陰性表達。見圖2。這表明從骨膜分離的細胞能表達間充質(zhì)干細胞特異的表面抗原。

圖2 流式細胞學檢測結(jié)果

2.3 三系分化

骨膜分離的細胞經(jīng)成骨、成軟骨、成脂誘導試劑盒誘導分化2 周后，分別經(jīng)茜素紅、阿利辛藍和油紅O 染色。經(jīng)茜素紅染色后，鈣化的細胞外基質(zhì)呈紅色（圖3A），證明其向成骨分化；成軟骨培養(yǎng)基誘導蛋白多糖沉積，可見大量被阿利辛藍染為藍色的細胞（圖3B）；而油紅O 將脂滴或脂肪空泡染為紅色，表明其向脂肪組織分化（圖3C）。結(jié)果顯示骨膜分離的細胞具有干細胞特性，可向三系分化，即成骨、成軟骨和成脂肪分化。

圖3 三系分化結(jié)果

3 討論

為修復關(guān)節(jié)軟骨缺損，研究者開展了大量的研究工作，其中比較有代表性的是自體軟骨細胞移植技術(shù)和組織工程技術(shù)。自體軟骨細胞移植技術(shù)及其迭代技術(shù)是從關(guān)節(jié)的非負重區(qū)獲取軟骨組織、體外分離軟骨細胞，經(jīng)3～8 周的擴增，再通過二次手術(shù)將擴增的軟骨細胞植入軟骨缺損區(qū)，覆蓋以骨膜移植物或Ⅰ/Ⅲ型膠原膜。自體軟骨細胞移植雖可產(chǎn)生透明軟骨樣的修復，但移植物的增生肥大是限制其應用的最大挑戰(zhàn)。Bartlett 等[14]利用基質(zhì)誘導的自體軟骨細胞移植術(shù)修復膝關(guān)節(jié)股骨內(nèi)側(cè)髁和髕骨骨軟骨損傷，在術(shù)后6月接受關(guān)節(jié)鏡評估的4位患者中，有1位發(fā)生了移植物的肥大，而需進一步刮除。他們進一步比較了自體軟骨細胞移植術(shù)和基質(zhì)誘導的軟骨細胞移植術(shù)的效果，發(fā)現(xiàn)術(shù)后1年自體軟骨細胞移植術(shù)（autologous chondrocyteimplantation，ACI）的移植物肥大率為9%（4/44），而基質(zhì)誘導的自體軟骨細胞移植術(shù)（matix -autologouschondrocyte implantation，MACI）的移植物肥大率為6%（3/47），并且每組的再手術(shù)率都達9%[15]。Gomoll 等[16]在一項隊列研究中對比了骨膜移植的ACI和基質(zhì)膜移植的ACI的術(shù)后移植物肥大發(fā)生率，在術(shù)后1年通過移植物位置的疼痛癥狀和核磁共振檢查，發(fā)現(xiàn)25.7%的用骨膜作移植物的ACI 患者因移植物肥大而需再手術(shù)，而以基質(zhì)膜覆蓋的ACI 患者5%因移植物肥大而需再手術(shù)。這表明移植物的增生肥大仍然是ACI類技術(shù)的主要問題。

利用組織工程技術(shù)修復關(guān)節(jié)軟骨是當前研究的熱點，通過體外培養(yǎng)、擴增種子細胞，并將擴增的種子細胞植于具有良好生物組織相容性和降解性的支架材料中，然后植入軟骨缺損的部位，在一定的調(diào)控狀態(tài)下完成關(guān)節(jié)軟骨的修復和重建。組織工程中目前最常用的種子細胞是骨髓干細胞，研究表明[17]將骨髓干細胞移植到軟骨缺損區(qū)后，可產(chǎn)生透明軟骨樣的組織；但也有研究者將骨髓干細胞移植于裸鼠皮下后，產(chǎn)生了軟骨內(nèi)鈣化[8]。并且，隨著體外的擴增傳代，骨髓干細胞的成軟骨分化潛能會逐漸降低，而鈣化（成骨分化）增加，且獲取這些細胞會造成患者的疼痛和供區(qū)并發(fā)癥[7]。這表明骨髓干細胞移植可能會造成移植區(qū)鈣化等問題。關(guān)節(jié)滑膜起源的干細胞獲取方便，體外擴增速度快，體外成軟骨分化可較骨髓干細胞產(chǎn)生更多軟骨細胞[18]，但將其移植到體內(nèi)分化時，其膠原含量會逐漸下降[8]，不利于軟骨修復。骨膜干細胞體外擴增速度較快，具有更好的體外成軟骨分化的能力[19，20]，研究者將骨膜干細胞連續(xù)三代移植于小鼠脂肪墊后，骨膜干細胞仍能保持自我更新的潛能[21]。Wakitani 等[17]將骨髓干細胞和骨膜干細胞分別移植于兔股骨內(nèi)側(cè)髁軟骨缺損模型后，發(fā)現(xiàn)缺損區(qū)均可產(chǎn)生透明軟骨樣的修復，而骨膜干細胞修復的軟骨表面更加規(guī)整，與周圍正常的關(guān)節(jié)軟骨整合更好。這表明相較于其他組織來源的干細胞，骨膜干細胞具有更穩(wěn)定、更持久的軟骨分化潛能。

骨膜在關(guān)節(jié)置換術(shù)中可能作為廢物而被丟棄，但它可能是自體干細胞的重要來源[22]。在本次研究中，從骨膜分離的細胞在P3 代時鏡下觀察呈現(xiàn)長梭形或纖維狀，這與文獻報道骨膜分離的細胞形態(tài)相似[22，23]。表面抗原可用來鑒定骨膜來源的前體細胞，其中CD105 是TGF-β受體的重要組分，在成軟骨分化中具有重要作用，Lim等研究者分離、體外培養(yǎng)人PDPCs時，CD105 表型能保持至P15[24]。CD90 和CD44 也是間充質(zhì)干細胞鑒定常用的表面標志，能在間充質(zhì)干細胞和骨膜來源的前體細胞中高表達[25-27]。CD45 和CD14 是造血細胞系的表面標志，不會在間充質(zhì)干細胞中表達[23，25，28]。本實驗結(jié)果顯示從骨膜分離的細胞能表達CD44、CD90 和CD105，而CD14 和CD45 表面標記呈陰性表達；這說明從骨膜分離的細胞具有間充質(zhì)干細胞的表型特征。

能向骨、軟骨、脂肪分化是鑒定間充質(zhì)干細胞的標準[7，29]。Lim等研究者的實驗證明從人骨膜分離的細胞在體外培養(yǎng)至P15 時仍能保持成軟骨的能力[24]。Yoon等的研究結(jié)果也表明人骨膜分離的細胞可向骨、軟骨和脂肪進行分化[30]。Jaquiery等比較了人下頜骨骨膜來源的細胞和骨髓的間充質(zhì)干細胞，發(fā)現(xiàn)骨膜來源的細胞成骨能力不如骨髓來源的間充質(zhì)干細胞[31]。而Wakitani 等的研究表明兔骨膜來源的細胞成軟骨的能力較骨髓來源的間充質(zhì)干細胞強[17]。Choi 等在誘導人骨膜來源的細胞成脂分化時，發(fā)現(xiàn)形成的脂肪空泡小且多，都在核的周圍，且空泡隨著成脂分化的過程而不斷增大[27]。在本次實驗中，從骨膜分離的細胞能向骨、軟骨和脂肪進行分化。我們觀察到，從骨膜分離的細胞在成骨誘導分化2周后，經(jīng)茜素紅染色，在鏡下可見典型紅染的鈣化結(jié)節(jié)；經(jīng)成軟骨誘導分化14 天后，可見大量藍染的細胞；而在成脂誘導分化14 天左右，可見部分紅染的脂滴，且隨成脂誘導分化的時間延長，脂滴并無明顯增加。這可能表明成骨分化和成軟骨分化的染色較成脂分化更強。我們推測可能骨膜分離的細胞更傾向于向骨和軟骨細胞系分化，可能有更好的成骨和成軟骨分化的能力，而成脂分化的能力較差；但這尚需進一步研究驗證。

從骨膜分離的細胞能表達間充質(zhì)干細胞特異性的表面標志，還能誘導向成骨、成軟骨和成脂分化。因此，本研究從小型豬骨膜分離的細胞可被認為是間充質(zhì)干細胞。

4 結(jié)論

本研究成功分離并鑒定了小型豬的骨膜來源的干細胞，為軟骨缺損修復的組織工程技術(shù)提供了種子細胞來源。