光遺傳操控D2-MSNs揭示跑臺訓(xùn)練改善帕金森病小鼠運(yùn)動行為障礙的可能機(jī)制

劉曉莉 張丹昱 趙剛 喬德才

北京師范大學(xué)體育與運(yùn)動學(xué)院（北京100875）

紋狀體（striatum，Str）是接受運(yùn)動皮質(zhì)信息傳入，參與基底神經(jīng)節(jié)直接/間接通路運(yùn)動調(diào)節(jié)的重要核團(tuán)。該核團(tuán)約95%的投射神經(jīng)元是γ-氨基丁酸（γaminobutyric acid，GABA）能中等多棘神經(jīng)元（medium spiny neurons，MSNs），根據(jù)其細(xì)胞膜上表達(dá)不同多巴胺（dopamine，DA）受體亞型分為多巴胺Ⅰ型受體（D1DR）的MSNs（D1-MSNs）和多巴胺Ⅱ型受體（D2DR）的MSNs（D2-MSNs）；激活D1DR，興奮直接通路，易化運(yùn)動；激活D2DR，興奮間接通路，抑制運(yùn)動的發(fā)起及多余動作的產(chǎn)生；直接與間接通路協(xié)同配合共同完成運(yùn)動信息整合、處理、優(yōu)化，精確調(diào)節(jié)運(yùn)動行為的執(zhí)行[1]。近些年來，有研究采用光遺傳學(xué)技術(shù)（optogenetics），通過光刺激興奮性（channelrhodopsin-2，ChR2）或抑制性（halorhodopsin，NpHR）光敏感蛋白，實(shí)現(xiàn)對MSNs 特定神經(jīng)元精確控制[2]，成功誘導(dǎo)并緩解了震顫等帕金森?。≒arkinson's disease，PD）癥狀[3]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究證實(shí)，運(yùn)動具有明顯改善PD模型大鼠行為功能障礙的效果[4]，并推測其可能機(jī)制與運(yùn)動促進(jìn)紋狀體MSNs 的功能可塑性有關(guān)，主要作用靶點(diǎn)是D2-MSNs[5]。本研究采用光遺傳學(xué)技術(shù)靶向操控紋狀體D2-MSNs，觀察PD模型小鼠自主活動行為的變化，為進(jìn)一步揭示D2-MSNs在改善PD動物運(yùn)動行為障礙中的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組

實(shí)驗(yàn)動物為雄性轉(zhuǎn)基因小鼠（D2-Cre小鼠，特異性表達(dá)多巴胺Ⅱ型受體重組酶，體重18～25 g，由北京師范大學(xué)認(rèn)知神經(jīng)科學(xué)與學(xué)習(xí)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供），分籠飼養(yǎng)，自由飲食飲水，動物房12 h 光照和12 h 黑暗交替，溫度與濕度保持恒定。實(shí)驗(yàn)過程按實(shí)驗(yàn)動物使用3R原則給予人道主義關(guān)懷。正式實(shí)驗(yàn)前先進(jìn)行1周環(huán)境及跑臺適應(yīng)性訓(xùn)練，剔除無法完成預(yù)設(shè)跑臺訓(xùn)練方案的小鼠，將所有剩余實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分成假手術(shù)安靜組（Control 組，n=6）和6羥基多巴胺（6-Hydroxydopa?mine，6-OHDA）注射模型組（n=28）；模型組隨機(jī)分為帕金森組（PD組）、帕金森運(yùn)動組（PD+Ex組）和帕金森光刺激組（PD+Laser 組），各組分批次進(jìn)行手術(shù)后剔除死亡和不符合模型標(biāo)準(zhǔn)的小鼠，最終保證每組樣本量一致（n=6）。

1.2 紋狀體病毒轉(zhuǎn)染

PD+Laser 組小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束后24 h禁食，自由飲水，腹腔注射5%水合氯醛麻醉（350 μg/g）后將小鼠固定于立體定位儀上，沿顱頂矢狀縫切開皮膚，于紋狀體處（AP：+ 0.5 mm，R：1.8 mm，DV：-3.0 mm）[6]鉆孔，注射含抑制性光敏感蛋白（rAAV- Ef1α- DIOeNpHR3.0-EYFP-WPRE-pA）的病毒（樞密科技，武漢），注射結(jié)束后殺菌縫皮（圖1）。

圖1 光敏感蛋白病毒注射及光纖埋置示意圖

1.3 PD小鼠模型建立及鑒定

PD+Laser 組小鼠病毒注射1周后，依據(jù)于燕等[7]紋狀體兩點(diǎn)注射6-OHDA藥物的方法對PD組、PD+Ex組和PD+Laser組建立PD小鼠模型。手術(shù)方案同前，小鼠麻醉后固定于立體定位儀上，沿顱頂矢狀縫切開皮膚，于紋狀體處（AP：+ 0.5 mm，R：1.8 mm）鉆孔[6]，在顱骨下-3.0 mm 和-2.0 mm 兩點(diǎn)分別注入6-OHDA 溶液（2 μg/μL，含0.02%抗壞血酸和0.9%生理鹽水），共4 μL，以0.5 μL/min 的速度注射完后留針3 min，勻速退出。10 min 后再將光纖頭和套管植入目標(biāo)靶區(qū)，牙科水泥和螺釘固定。Control組于相同位點(diǎn)注射等量含0.02%抗壞血酸的生理鹽水。

6-OHDA注射后第7天對實(shí)施PD造模的小鼠腹腔注射阿撲嗎啡（APO，0.125 g/L，0.5 μg/g）誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)，并記錄旋轉(zhuǎn)圈數(shù)；篩選凈旋轉(zhuǎn)圈數(shù)＞120 r/30 min作為PD小鼠模型制備成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)之一[7]。

1.4 運(yùn)動干預(yù)方案

PD+Ex 組在手術(shù)后一周開始運(yùn)動干預(yù)；非運(yùn)動組小鼠置于跑臺中相同時(shí)間，但不參與運(yùn)動。運(yùn)動干預(yù)方案[8]采用勻速跑臺運(yùn)動（18 m/min，40 min/d，5 d/w，4 w），運(yùn)動強(qiáng)度約為70%～76%VO2max[30]。

1.5 小鼠自主活動能力評價(jià)

運(yùn)動干預(yù)結(jié)束后24 h，通過曠場實(shí)驗(yàn)（open field test，OFT）測試各組小鼠的自主活動能力。將Control組、PD組和PD+Ex小鼠置于40×40×40 cm的無蓋立方體中，數(shù)碼攝像機(jī)位于箱體正上方80 cm處，待小鼠適應(yīng)性活動5 min 后，通過SMART 3.0 軟件記錄小鼠在曠場內(nèi)10 min自主活動情況，通過跟蹤小鼠質(zhì)心得到運(yùn)動軌跡，統(tǒng)計(jì)各組小鼠10 min 內(nèi)運(yùn)動總距離、平均運(yùn)動速度和活動模式占比等參數(shù)?；顒幽Ｊ絼澐郑核俣龋?5 m/s 定義為快速移動（fast movement），速度＜5 cm/s定義為靜止?fàn)顟B(tài)（resting），速度介于兩者之間為慢速移動（slow movement）。

PD+Laser 組小鼠的曠場實(shí)驗(yàn)中采用光遺傳設(shè)備（Shanghai Laser & Optics Century Co.，Ltd.）的光源控制器給予PD+Laser 組小鼠589 nm 波長、10 mW 的黃光刺激，刺激方案為30 s 光照、30 s 關(guān)閉，30 s 間隔的循環(huán)，重復(fù)7 組，共10 min[9]（圖2）。統(tǒng)計(jì)10 min 內(nèi)運(yùn)動總距離、平均運(yùn)動速度和活動模式占比等參數(shù)，并根據(jù)PD+Laser 組小鼠在30 s 刺激前（Pre）、30 s 光照（Laser）、30 s 關(guān)閉（Post）狀態(tài)的運(yùn)動軌跡統(tǒng)計(jì)各30 s內(nèi)運(yùn)動距離、平均運(yùn)動速度和活動模式占比等參數(shù)。

圖2 曠場及光遺傳實(shí)驗(yàn)裝置示意圖

1.6 紋狀體酪氨酸羥化酶檢測

所有實(shí)驗(yàn)結(jié)束24 h 后，選擇PD 組和Control 組小鼠各6只，腹腔注射5%水合氯醛麻醉（350 μg/g），用生理鹽水（30 mL）和4%多聚甲醛溶液（30 mL）經(jīng)左心室-升主動脈插管灌流，并迅速取出腦組織置于30%蔗糖的多聚甲醛溶液中固定保存24 h。將腦組織取出后進(jìn)行脫水、修塊、包埋，連續(xù)冠狀切片。從每只小鼠紋狀體的連續(xù)切片中每隔5張選取1張，每個(gè)腦組織平均選擇6 張切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色、脫水、透明、封片，用Olympus-DP72 型顯微鏡對紋狀體區(qū)域拍照；采用Image-Pro Plus 6.0軟件對紋狀體酪氨酸羥化酶（ty?rosine hydroxylase，TH）免疫陽性纖維光密度（optical density，OD）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.7 紋狀體D2-MSNs動作電位記錄及光敏蛋白表達(dá)

所有實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對PD+Laser 組D2-Cre 轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行離體腦片（300 μm）制備，在全細(xì)胞膜片鉗Iclamp模式下，通過記錄電極注入電流（40 pA，0.1 Hz，500 ms）使D2-MSNs 爆發(fā)動作電位，統(tǒng)計(jì)光刺激前后D2-MSNs 動作電位發(fā)放個(gè)數(shù)；并對腦片固定、脫水、包埋，在激光共聚焦顯微鏡下觀察病毒轉(zhuǎn)染情況。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以（±s）表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析Control組與PD組小鼠TH免疫陽性纖維光密度比值的組間差異，配對樣本t檢驗(yàn)分析光刺激前后小鼠運(yùn)動距離、速度的組內(nèi)差異，one-way ANOVA 分析Control組，PD組和PD+Ex組及光刺激前、中、后小鼠運(yùn)動距離、速度的組間差異，卡方檢驗(yàn)分析不同模式活動占比的組間差異；P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PD小鼠模型及光敏蛋白表達(dá)的驗(yàn)證

APO 誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)行為試驗(yàn)是評價(jià)偏側(cè)損傷PD 動物模型可靠性的經(jīng)典方法之一[10]。旋轉(zhuǎn)行為試驗(yàn)結(jié)果顯示，Control組均無異常旋轉(zhuǎn)行為，注射6-OHDA組小鼠（n=28）中向健側(cè)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)與損毀側(cè)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)差值＞120 r/30 min共18只，PD成模率約為64.3%，剔除其余未達(dá)標(biāo)小鼠。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，Control 組小鼠雙側(cè)紋狀體TH陽性纖維表達(dá)均勻、對稱，PD組小鼠損毀側(cè)（右側(cè)）紋狀體DA合成限速酶TH陽性纖維出現(xiàn)大量丟失，呈現(xiàn)明顯不對稱性（圖3A、B），表明紋狀體DA投射大量減少，PD小鼠模型復(fù)制成功。

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察光刺激前后D2-Cre 轉(zhuǎn)基因小鼠D2-MSNs 對注入電流的反應(yīng)；當(dāng)給予30 s 波長為589 nm 光刺激后D2-MSNs 動作電位發(fā)放個(gè)數(shù)減少（如圖3C）。通過激光共聚焦顯微鏡在綠色激發(fā)光下觀察到光敏蛋白eN?pHR3.0 在D2-MSNs 表達(dá)（圖3D），表明病毒轉(zhuǎn)染成功，為下一步激光精準(zhǔn)操控紋狀體D2-MSNs奠定了基礎(chǔ)。

圖3 紋狀體TH染色及光敏感蛋白表達(dá)

2.2 運(yùn)動干預(yù)對小鼠自主活動能力的影響

10min 曠場實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，PD 組小鼠自主活動總距離和平均運(yùn)動速度較Control 組小鼠顯著減少（P＜0.05）；PD+Ex 組小鼠自主活動總距離和平均運(yùn)動速度均較PD組小鼠顯著增加，但仍低于Control組小鼠（圖4A、B，P＜0.05）。與Control 組相比，PD 組小鼠靜止?fàn)顟B(tài)占比顯著增加（P＜0.05），慢速和快速移動占比顯著減少（P＜0.05）；PD+Ex 組小鼠靜止?fàn)顟B(tài)占比顯著增加（P＜0.05），快速移動占比顯著減少（P＜0.05），慢速移動無顯著變化（P＞0.05）；與PD 組小鼠相比，PD+Ex 組小鼠靜止?fàn)顟B(tài)占比顯著減少（P＜0.05），慢速和快速移動占比顯著增加（P＜0.05，圖4C）。

圖4 運(yùn)動干預(yù)對小鼠自主活動能力的影響（n=6）

2.3 光刺激對PD小鼠自主活動能力的影響

給予PD+Laser組小鼠10 min間歇、重復(fù)的黃光刺激后，其在曠場中運(yùn)動總距離和平均運(yùn)動速度較PD組顯著增加（P＜0.05）；靜止?fàn)顟B(tài)占比較PD 組顯著降低（P＜0.05），慢速和快速移動占比較PD 組顯著增加（P＜0.05，圖5A、B、C）。

與光刺激前相比，給予30 s黃光刺激PD+Laser 組小鼠活動總距離、平均運(yùn)動速度均顯著增加（P＜0.05），且快速移動占比顯著增加（P＜0.05），靜止?fàn)顟B(tài)占比顯著減少（P＜0.05，圖5D、E、F）。

圖5 光刺激對PD小鼠自主活動能力的影響（n=6）

2.4 運(yùn)動與光刺激后PD 小鼠自主活動能力變化情況對比

運(yùn)動與光刺激兩種干預(yù)方式對PD 小鼠自主活動行為影響的對比分析如圖6所示。與干預(yù)前相比，運(yùn)動和光刺激后小鼠總運(yùn)動距離及平均運(yùn)動速度均顯著增加（P＜0.05，P＜0.05，圖6B、C）；靜止?fàn)顟B(tài)占比顯著減少（P＜0.05），快速移動占比與慢速移動占比顯著增加（P＜0.05，P＜0.05，圖6D）；可見運(yùn)動與光刺激兩種干預(yù)方式對PD小鼠自主活動行為的改善作用基本相似。

圖6 運(yùn)動與光刺激后PD小鼠自主活動能力及活動模式占比情況比較（n=6）

3 討論

紋狀體神經(jīng)元主要由兩類表達(dá)不同DA 受體的MSNs 組成，D1-MSNs 接受來自皮層和黑質(zhì)致密部（SNc）投射，再將信息投射至下游蒼白球內(nèi)側(cè)部/黑質(zhì)網(wǎng)狀部復(fù)合體（GPi/SNr），構(gòu)成運(yùn)動調(diào)節(jié)的直接通路（Str-SNc-GPi/SNr）；來自黑質(zhì)致密部的DA神經(jīng)元釋放DA 至紋狀體后，通過作用于D1DR 引起Gs 蛋白偶聯(lián)反應(yīng)，并介導(dǎo)P 物質(zhì)（substance P，SP）和強(qiáng)啡肽（dynor?phin，DYN）表達(dá)，興奮直接通路。D2-MSNs 接受的信息經(jīng)蒼白球外側(cè)部（GPe）投射至丘腦底核（STN），最終到達(dá)GPi/SNr 復(fù)合體，構(gòu)成運(yùn)動調(diào)節(jié)的間接通路（Str-GPe-STN-GPi/SNr）；DA 釋放至紋狀體后作用于D2DR主要引起Gi/o 蛋白偶聯(lián)反應(yīng)，并介導(dǎo)腦啡肽（enkepha?lin，ENK）表達(dá)，抑制間接通路[1]。因此，紋狀體是基底神經(jīng)節(jié)直接/間接通路的起始核團(tuán)，分別通過D1-MSNs和D2-MSNs 調(diào)控直接與間接通路之間的平衡，實(shí)現(xiàn)對運(yùn)動行為的精確調(diào)控。

PD 是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，黑質(zhì)致密部DA 能神經(jīng)元變性缺失及紋狀體DA 水平明顯減少是PD的主要病理特征。PD發(fā)病機(jī)制尚未明確，但目前認(rèn)為基底神經(jīng)節(jié)直接/間接通路功能失衡是導(dǎo)致PD 患者運(yùn)動行為障礙的主要原因[11]。研究發(fā)現(xiàn)，隨著黑質(zhì)致密部DA 神經(jīng)元的漸進(jìn)性丟失，PD 大鼠紋狀體D1-MSNs 和D2-MSNs 樹突棘出現(xiàn)脫落現(xiàn)象，進(jìn)而引起黑質(zhì)-紋狀體微環(huán)路功能異常[12]；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，紋狀體DA水平減少會導(dǎo)致皮層-紋狀體通路Glu投射的代償性增強(qiáng)，紋狀體D2DR 敏感性增高，間接通路過度興奮并引發(fā)PD 患者的行為功能障礙[13]；給予適量左旋多巴胺（levodopa，L-DOPA）或D2DR 激動劑治療后D2-MSNs興奮性降低，PD患者的行為功能異常減輕[14]。由此推測，D2-MSNs 的過度興奮可能是導(dǎo)致基底神經(jīng)節(jié)直接/間接通路功能失衡，引發(fā)PD 患者行為功能障礙的重要原因。

運(yùn)動的神經(jīng)性保護(hù)作用可調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能[15]，促進(jìn)突觸可塑性[16]。規(guī)律的體育活動明顯降低了PD的患病風(fēng)險(xiǎn)[17]，不同方式運(yùn)動干預(yù)對PD模型動物運(yùn)動行為和黑質(zhì)-紋狀體DA系統(tǒng)產(chǎn)生有益的影響。Chen等[18]研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動改善了PD 大鼠的步速及步態(tài)，且延長在轉(zhuǎn)棒上停留的時(shí)間。Zhou 等[19]研究也發(fā)現(xiàn)，自主運(yùn)動或強(qiáng)迫性運(yùn)動均可以改善PD 大鼠在轉(zhuǎn)棒和水迷宮測試中的運(yùn)動表現(xiàn)。Forouzan等[20]研究顯示，運(yùn)動可顯著提高PD大鼠的四肢力量和平衡能力。此外，運(yùn)動還可以減輕PD大鼠D2-MSNs 樹突棘脫落[21]，下調(diào)紋狀體多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體（DAT）表達(dá)[22]，并上調(diào)D2DR表達(dá)[23]，逆轉(zhuǎn)D2DR超敏現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)室前期研究也已經(jīng)證實(shí)，跑臺運(yùn)動干預(yù)可以改善PD 大鼠的步態(tài)異常[24]及四肢協(xié)調(diào)性[25]；增加紋狀體D2DR 表達(dá)及其功能，促進(jìn)紋狀體MSNs樹突棘重塑，進(jìn)而改善基底神經(jīng)節(jié)直接與間接通路的失衡[26]；推測紋狀體D2DR 可能是運(yùn)動改善PD模型動物行為功能障礙的重要細(xì)胞分子靶點(diǎn)。

光遺傳學(xué)又稱光刺激基因工程（optical stimulate plus genetic engineering），是基因遺傳與光控操作相結(jié)合的一種新興技術(shù)，利用光刺激光敏感蛋白實(shí)現(xiàn)對生物體內(nèi)某一特定神經(jīng)元活動及功能的精準(zhǔn)控制。轉(zhuǎn)染視紫紅質(zhì)通道蛋白ChR2 的神經(jīng)細(xì)胞，350～550 nm 的藍(lán)光刺激使通道打開，Na+、Ca2+等陽離子進(jìn)入胞內(nèi)，引起細(xì)胞去極化，從而興奮神經(jīng)元。轉(zhuǎn)染鹽系菌視紫紅質(zhì)蛋白NpHR 的神經(jīng)細(xì)胞，425～650 nm 的黃光刺激使通道打開，Cl-等陰離子進(jìn)入胞內(nèi)，引起細(xì)胞超極化，從而抑制神經(jīng)元的興奮性。近些年來，光遺傳技術(shù)應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)的研究領(lǐng)域，彌補(bǔ)了電生理學(xué)方法對神經(jīng)元操控缺乏特異性和藥理學(xué)方法對神經(jīng)元操控缺乏時(shí)間準(zhǔn)確性等方面的不足，將PD病理機(jī)制的研究逐漸深入到細(xì)胞及分子水平[27]。Kravitz 等[9]利用光遺傳學(xué)手段藍(lán)光激活紋狀體中轉(zhuǎn)染ChR2的D2-MSNs，誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)運(yùn)動遲緩行為。Gradinaru等[28]利用黃光抑制間接通路中丘腦底核傳入神經(jīng)元的興奮性，震顫等PD癥狀得到緩解。Dobbs等[29]用光遺傳技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，紋狀體相鄰D1-MSNs 與D2-MSNs 之間還存在側(cè)抑制效應(yīng)，激活表達(dá)ChR2的D2-MSNs可對D1-MSNs產(chǎn)生抑制作用，參與直接/間接通路之間的信號調(diào)控。本研究對D2-Cre 小鼠紋狀體轉(zhuǎn)染抑制性光敏感蛋白病毒（rAAVEf1α-DIO- eNpHR3.0-EYFP-WPRE-pA），并采用589nm 黃光刺激抑制D2-MSNs 興奮性，試圖通過光遺傳方法精準(zhǔn)操控D2-MSNs 興奮性，進(jìn)一步揭示跑臺運(yùn)動改善PD 模型小鼠運(yùn)動行為障礙的可能機(jī)制。當(dāng)給予黃光刺激后，PD小鼠總運(yùn)動距離與平均運(yùn)動速度均明顯增加，靜止?fàn)顟B(tài)占比降低，快速移動占比增加；且上述結(jié)果與跑臺運(yùn)動干預(yù)對PD 小鼠自主活動行為影響的結(jié)果基本相似；提示紋狀體D2-MSNs 可能在運(yùn)動改善PD小鼠運(yùn)動行為障礙中具有重要作用。

4 小結(jié)

PD小鼠出現(xiàn)明顯自主活動障礙與紋狀體DA水平減少，引起D2-MSNs興奮性改變有關(guān)。4周跑臺運(yùn)動干預(yù)有效改善了PD模型小鼠自主活動障礙，這一結(jié)果與光遺傳操控D2-MSNs 興奮性對PD 小鼠自主活動行為的影響基本相似。這提示紋狀體D2-MSNs可能是運(yùn)動改善PD 小鼠運(yùn)動行為障礙的重要細(xì)胞分子靶點(diǎn)。后續(xù)研究工作擬采用光遺傳與全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)相結(jié)合的手段，精準(zhǔn)識別并操控D2-MSNs胞體，觀察跑臺運(yùn)動是否能夠抑制PD小鼠紋狀體D2-MSNs的興奮性，從細(xì)胞水平進(jìn)一步揭示D2-MSNs 在運(yùn)動改善PD 小鼠運(yùn)動行為障礙中的具體調(diào)控機(jī)制。