菊科植物環(huán)肽研究進(jìn)展

楊勇勛，顏 瑜

(1.西昌學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，四川 西昌 615000；2.西昌學(xué)院 圖書(shū)館，四川 西昌 615000)

植物環(huán)肽(Plant cyclopeptides)一般是指高等植物中由非環(huán)肽(直鏈肽)通過(guò)酰胺鍵、醚鍵、二硫鍵，或通過(guò)一個(gè)新的C-C、C-N、N-O或C-S鍵形成的一類環(huán)狀含氮化合物。目前發(fā)現(xiàn)的植物環(huán)肽主要是由2～37個(gè)編碼或非編碼氨基酸，且主要是L-構(gòu)型的氨基酸組成。到2005年，已從分屬26個(gè)科、65個(gè)屬、120個(gè)種的高等植物中分離鑒定出約455個(gè)植物環(huán)肽，其中大部分的植物環(huán)肽來(lái)自于石竹科Caryophyllaceae和鼠李科 Rhamnaceae植物[1-2]。

菊科為植物界第一大科，廣布全世界，約有1 000屬，25 000～30 000種，熱帶較少。我國(guó)約有200余屬，2 000多種，分布于全國(guó)各地[3]。此前一直認(rèn)為菊科植物環(huán)肽只涉及紫菀中的氯化環(huán)五肽類，但近期又從菊科其他植物中發(fā)現(xiàn)了環(huán)肽生物堿以及數(shù)十個(gè)基因編碼的均環(huán)肽，即兩大類環(huán)肽：①均環(huán)肽：紫菀氯化環(huán)五環(huán)肽[1，4-6]，基因編碼的PDP(PawS-derived Peptides)[7]和PLP(PawL-derived Peptides)環(huán)肽[8-9]；②雜環(huán)肽：絨毛戴星草中的環(huán)肽生物堿subfractions Ⅰ和Ⅱ[10-12]。

目前，菊科植物環(huán)肽的生物活性、作用機(jī)制、生源合成途徑等研究方面取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，如最具有代表性的紫菀環(huán)肽astins類化合物具有顯著的細(xì)胞毒性，而且其中的astin B活性最強(qiáng)[5]。構(gòu)效關(guān)系研究顯示其細(xì)胞毒性與肽鏈?zhǔn)欠癯森h(huán)、氯代，環(huán)的構(gòu)象以及肽脯酰胺鍵的順/反式(cis/trans)構(gòu)象等因素有關(guān)[13-15]。研究還顯示astin C具有免疫調(diào)節(jié)活性，紫菀的止咳、祛痰活性與紫菀環(huán)肽類化合物有關(guān)[16]，PDP環(huán)肽SFTI-1(27)具有蛋白酶抑制活性等[7]。

鑒于菊科植物廣布于全世界，且種類較多，因此從中發(fā)現(xiàn)種類繁多的新穎結(jié)構(gòu)的生物活性環(huán)肽還存有巨大的潛力。此外，近期研究還在菊科植物中環(huán)肽的抗腫瘤活性、免疫抑制的作用機(jī)制與作用靶點(diǎn)、生源合成途徑、生物技術(shù)培養(yǎng)生產(chǎn)等方面取得積極進(jìn)展。因此，本文對(duì)當(dāng)前菊科植物環(huán)肽的來(lái)源、分類、合成途徑、化學(xué)結(jié)構(gòu)、生物活性、作用機(jī)制及構(gòu)效關(guān)系等進(jìn)行全面的綜述，以期為菊科植物環(huán)肽的深入研究與開(kāi)發(fā)提供參考。

1 化學(xué)結(jié)構(gòu)

1.1 第Ⅰ類：均環(huán)肽

1.1.1 亞類Ⅰ：紫菀環(huán)肽 目前，從紫菀根和根莖中共分離得三類環(huán)肽類化合物：第1類為氯化環(huán)五肽[5，17-20]、astins A-I(1-9)、K-P(10-15)；第2類為第1類紫菀氯化環(huán)五肽的水解開(kāi)環(huán)直鏈肽[21-23]、aster J(16)和asterinins A-F(17-22)；第3類為一類結(jié)構(gòu)新穎的具一個(gè)Δ2，4脯氨酸側(cè)鏈的環(huán)四肽化合物tataricins A-B[6](23-24)，氨基酸組成與第Ⅰ類類似。結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

圖1 紫菀環(huán)肽astins A-I (1-9)，K-P (10-15)，astin J，asterins A-F(17-22)和tataricin A-B(23-24)的結(jié)構(gòu)(以脯氨酸為第1氨基酸編號(hào))

1.1.2 亞類Ⅱ：菊科PawS基因編碼的PDPs環(huán)肽 此類環(huán)肽由12～21個(gè)編碼氨基酸頭尾環(huán)合而成，含2個(gè)半胱氨酸，具有1個(gè)二硫鍵。此類環(huán)肽首先從向日葵種子中分離得到，如SFTI-1(27)[7，24-26]和SFT-L1 (SFTI-Like1)[27]，結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2。隨后，從菊科多種植物中通過(guò)LC/MS/MS技術(shù)發(fā)現(xiàn)多個(gè)與SFTI-1(27)、SFTI-L1(28)結(jié)構(gòu)類似的PDPs環(huán)肽，部分結(jié)構(gòu)還通過(guò)化學(xué)合成途徑證實(shí)，其具體的名稱、氨基酸序列及來(lái)源見(jiàn)表1[28]，其中，PDP-10、PDP-11為直鏈肽。

注：文中的編碼氨基酸縮寫表示如下(下同)：A=alanine；C =cysteine；D =aspartic acid；E = glutamic acid；F = phenylalanine；G =glycine；H =hystidine；I= isoleucine；K =lysine；L =leucine；M =methionine；N =asparagine；P = proline；Q =glutamine；R =arginine；S =serine；T = threonine；V = valine；W =tryptophan；Y =tyrosine

圖2 環(huán)肽化合物SFTI-1(27)和SFTI-L1(28)的化學(xué)結(jié)構(gòu)(粗實(shí)線代表二硫鍵；以甘氨酸為第1氨基酸)

1.1.3 亞類Ⅲ：菊科PawL基因編碼的PLPs環(huán)肽 此類環(huán)肽由5～12個(gè)編碼氨基酸頭尾環(huán)合而成，很少含有半胱氨酸(cys)，無(wú)二硫鍵，如小百日菊(Zinniahaageana)植物中的 PLP-1 (cyclo-AIIPGLID)(48)和千里光屬(Seneciopinnatifoliusvar.maritimus)植物中的PLP-2 (cyclo-DLFVPPID)(49)[8-9]。

到目前為止，共從17種菊科植物中鑒定出46個(gè)PLPs型環(huán)肽[9]。其具體名稱、氨基酸序列、來(lái)源見(jiàn)表2，部分結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖3。

圖3 菊科植物中的部分PLPs型環(huán)肽結(jié)構(gòu)

表2 菊科植物中的PLPs環(huán)肽

1.2 第Ⅱ類：雜環(huán)肽、環(huán)肽生物堿、絨毛戴星草環(huán)肽

從絨毛戴星草(S.indicus)花[12]中分離得兩個(gè)生物堿subfractions Ⅰ和Ⅱ(25-26)[29-30]，結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖4。

圖4 絨毛戴星草環(huán)肽subfractions Ⅰ 和Ⅱ(25-26)的化學(xué)結(jié)構(gòu)

2 生物活性

2.1 抗腫瘤活性、構(gòu)效關(guān)系及作用機(jī)制

Morita H等[5]通過(guò)細(xì)胞壓積法(total packed cell volume method)，以小鼠腹水肉瘤180(sarcoma 180 ascites)為模型，以腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)比GR(%)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)紫菀環(huán)肽astins A-C(1-3)的抗腫瘤活性進(jìn)行了研究。研究揭示了astins A和B具有顯著的抗腫瘤活性，而且其活性是astinC的10倍。

隨后，更多的研究將目光集中于其構(gòu)效關(guān)系上。研究結(jié)果顯示，環(huán)肽的細(xì)胞毒活性與肽鏈?zhǔn)欠癯森h(huán)、環(huán)的構(gòu)象，尤其是1，2-肽脯酰胺鍵的順、反式結(jié)構(gòu)、氯代、硫?；⒘u基數(shù)目多少等有關(guān)[20，22，31-36]。

紫菀環(huán)肽astins的抗腫瘤活性是通過(guò)caspase介導(dǎo)的凋亡機(jī)制實(shí)現(xiàn)，即astins連續(xù)地激活caspases 8和 9信號(hào)通路，進(jìn)而相應(yīng)地激活caspase 3效應(yīng)器[37]。

圖5 astin B的結(jié)構(gòu)以及關(guān)鍵的NOE相關(guān)和分子內(nèi)氫鍵

2.2 免疫抑制活性、構(gòu)效關(guān)系及作用機(jī)制

1990年，Smirnov等[38]首先報(bào)道了astin C (原名asterin 3)具有免疫調(diào)節(jié)作用，其作用機(jī)制與T-細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)和T-依賴免疫反應(yīng)相關(guān)。

2011年，Shen等[39]報(bào)道astin C在體內(nèi)、體外的免疫活性研究成果：在來(lái)自于Fas-mutated MRLlpr/lpr小鼠的激活T細(xì)胞中觀察到astin C通過(guò)線粒體依賴途徑介導(dǎo)T細(xì)胞凋亡；在激活的T細(xì)胞中，astin C導(dǎo)致caspase 9和caspase 3裂解，下調(diào)Bad蛋白的表達(dá)以及細(xì)胞色素c的釋放。此外，給小鼠飼喂astin C對(duì)抗TNBS-介導(dǎo)的結(jié)腸炎體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)astin C能有效降低血清中TNF-α、IL-4、IL-7水平，誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)證明了astin C能有效抑制激活T細(xì)胞的增殖，提示其具有治療結(jié)腸炎的潛力。

構(gòu)效關(guān)系研究結(jié)果顯示：含D-型氨基酸、親脂長(zhǎng)鏈烷基取代、芳基取代的衍生物比具有親水氨基酸和短鏈烷基取代的衍生物活性強(qiáng)。此外，研究結(jié)果[40]也顯示，3，4-二氯脯氨酸殘基對(duì)astin C發(fā)揮免疫抑制作用起到了關(guān)鍵作用。

進(jìn)一步的astin C免疫抑制活性的作用機(jī)制研究[41]則顯示，astin C的作用機(jī)制是抑制CGAS-STING信號(hào)通路，因此astin C可作為調(diào)控STING信號(hào)通路介導(dǎo)的臨床疾病，如腫瘤、自身免疫性及自身炎癥疾病。

2.3 祛痰、止咳與抗炎活性

YU P等[16]將紫菀根的70%乙醇提取物分為3個(gè)流分：Fr-0、Fr-50和Fr-95，采用氣管酚紅分泌法對(duì)以上3個(gè)流分進(jìn)行祛痰活性測(cè)試，活性最強(qiáng)的部位再采用小鼠酚紅分泌、氨水誘發(fā)的咳嗽、二甲苯致耳腫脹實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)其祛痰、止咳及抗炎活性。其還采用HPLC-Q-TOF/MS法對(duì)活性部位的化學(xué)成分進(jìn)行分析，研究結(jié)果顯示紫菀具有止咳、祛痰及抗炎活性，同時(shí)也證實(shí)了這些活性與紫菀環(huán)肽相關(guān)。

2.4 蛋白酶抑制活性

SFTI-1(27)具有多種酶抑制活性，其中抑制小牛β-胰蛋白酶的活性最強(qiáng)，為亞納摩爾級(jí)別的抑制活性，即其化學(xué)計(jì)量比為1∶1，解離常數(shù)Ki值為 0.1 nmol/L (100 pmol/L)。SFTI-1(27)還具有抑制組織蛋白酶G(cathepsin G) (Ki～<0.15 nmol/L)、彈性蛋白酶(elastase) [Ki～(105±12)μmol/L]、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)[Ki～(7.4±1.5)μmol/L]，以及凝血酶(thrombin) [Ki～(136±21)μmol/L]的活性，但未觀察到對(duì)凝血因子X(jué)a (Ki>1 mmol/L)的抑制活性[7]。

2.5 肝毒性

紫菀環(huán)肽astins為二氯代脯氨酸環(huán)五肽化合物，其與源自于島青霉菌penicilliumislandicum的代謝產(chǎn)物環(huán)氯霉毒素cyclochlorotine(94)的結(jié)構(gòu)非常相似，但目前僅報(bào)道asterin (astin C，3)具有肝毒性[4]。而研究認(rèn)為astin B(2)不具有肝毒性的原因是其結(jié)構(gòu)中的肽脯酰胺鍵是順式(cis)構(gòu)象，而環(huán)氯霉毒素(94)中的肽脯酰胺鍵是反式(trans)構(gòu)象[13](圖5)。但是近年研究證實(shí)紫菀環(huán)肽，尤其是astin B也具有肝毒性[16-17]，因此，紫菀環(huán)肽astins的肝毒性應(yīng)引起重視。

3 紫菀環(huán)肽astins的生物合成途徑與生物技術(shù)生產(chǎn)

紫菀astins環(huán)肽的生物合成途徑尚未闡明，一般認(rèn)為其是由紫菀植物代謝產(chǎn)生，通過(guò)非核糖體肽合成酶(NRPs)合成，因?yàn)閍stins結(jié)構(gòu)中含有非編碼的氨基酸，且NRPSs能夠利用大量非蛋白源(非基因編碼氨基酸)氨基酸底物合成非核糖體肽[42]。然而，源自島青霉菌penicillium islandicum的代謝產(chǎn)物環(huán)氯霉毒素cyclochlorotine(94)的結(jié)構(gòu)與astins的結(jié)構(gòu)相似性[43]卻提示astins可能是源自于真菌的代謝產(chǎn)物。

近期有一項(xiàng)研究[44]顯示astins可能源自于真菌：從一株紫菀A.tataricus花序中分離的植物內(nèi)生真菌Cyanodermellaasteris代謝產(chǎn)生了多個(gè)astins類化合物，如asin C(3)，但不產(chǎn)生astin A、astin D、astin H等。在未感染植物內(nèi)生真菌C.asteris的紫菀植物中不會(huì)產(chǎn)生astins環(huán)肽，而如果紫菀植物再次被感染植物內(nèi)生真菌C.asteris時(shí)又會(huì)產(chǎn)生astins環(huán)肽，其中包括astin A(1)等，即植物內(nèi)生真菌C.asteris單獨(dú)發(fā)酵不產(chǎn)生代謝產(chǎn)物。因此，研究結(jié)果提示astin A等astins類環(huán)肽既不是單獨(dú)由紫菀植物也不是單獨(dú)由植物內(nèi)生真菌產(chǎn)生，而是由植物-真菌二者復(fù)合共生交叉代謝產(chǎn)生[45-46]。

鑒于astins環(huán)肽在紫菀植物中的含量很低，即astins A-C在植物中的含量分別僅有5.02、2.96和1.03 mg/g[47]。如果采用全合成的方法來(lái)合成astins步驟多，合成前體價(jià)格昂貴，尤其是二氯脯氨酸不常見(jiàn)，從而阻礙了astins環(huán)肽的全合成工業(yè)發(fā)展。然而，植物內(nèi)生真菌C.asteris的分離及其代謝產(chǎn)物的分離鑒定使利用生物技術(shù)方法大規(guī)模生產(chǎn)astins展現(xiàn)出光明的前景。VASSAUX A等[48]采用細(xì)胞固定培養(yǎng)技術(shù)，在優(yōu)化的培養(yǎng)條件下，astin C的產(chǎn)量可達(dá)植物提取量的5倍(真菌：0.89 mg/g；植物：0.16 mg/g)，因此，該生物技術(shù)方法生產(chǎn)astin C的效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)工業(yè)生產(chǎn)的要求。而且由于采用的是固定化培養(yǎng)技術(shù)，下游的分離與純化工藝更加便利，成本更低。

4 結(jié)語(yǔ)

在2006年以前，紫菀中的astins環(huán)肽被歸類為雜環(huán)肽類下的菊科型環(huán)肽(Compositae-type cyclopeptides)，這是由于當(dāng)時(shí)僅從紫菀中發(fā)現(xiàn)了氯化環(huán)五肽。而現(xiàn)在，其他植物中也發(fā)現(xiàn)了環(huán)肽生物堿以及幾十個(gè)基因編碼的PDPs與PLPs環(huán)蛋白(均環(huán)肽)，因此，繼續(xù)將紫菀植物中的astins類氯化環(huán)五肽繼續(xù)歸類為菊科環(huán)肽已似有不妥。

紫菀環(huán)肽中的astin B具有顯著的抗腫瘤活性，astin C具有顯著的免疫抑制活性，但不能因?yàn)槠潆母０锋I的cis構(gòu)象與結(jié)構(gòu)類似的真菌代謝產(chǎn)物環(huán)氯霉毒素cyclochlorotine(94)的肽脯酰胺鍵的trans構(gòu)象不同而認(rèn)為它們不具有肝毒性。具有顯著活性的astin B和C的構(gòu)效關(guān)系、構(gòu)毒關(guān)系以及作用機(jī)制研究應(yīng)得到重視。

此外，基因編碼的PDPs與PLPs環(huán)肽在菊科植物中的分布還顯示出分類學(xué)上的特征[9，28]，因此，它們可能在解決菊科分類的困難上發(fā)揮作用。

菊科植物眾多，且大多數(shù)為常用中藥，具有廣泛的臨床應(yīng)用。因此，繼續(xù)從中發(fā)掘結(jié)構(gòu)新穎的生物活性環(huán)肽，并闡明其生物活性、協(xié)同增效關(guān)系、生物合成途徑等，將會(huì)是未來(lái)研究的熱點(diǎn)。