壯醫(yī)桉楝雙蓮方治療小鼠ACD慢性瘙癢的止癢作用研究

莫嵩杰，謝祥官，黃振飛，韋麗珍，覃水云，黃海月，伍冠一，張 煜，溫海成

(廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧 530001)

瘙癢是一種令人不愉快、引起強烈搔抓欲望的皮膚感覺，是皮膚病最常見的癥狀之一，有超過1/3的就診者會發(fā)生這種癥狀，其中大部分屬于慢性[1-2]。瘙癢不僅可加重炎癥，而且還會導致睡眠嚴重缺失，嚴重影響患者及其家庭的生活質(zhì)量[3]。壯族地區(qū)常年氣候潮濕，常見痧、瘴、蠱毒引起的疾病。該地皮膚病大多夾濕，在長期與疾病作斗爭的過程中，壯族先民積累了許多治療皮膚瘙癢癥的經(jīng)驗[4]。

按照壯醫(yī)理論，瘙癢病常因毒邪入侵人體三道兩路(水道、氣道、谷道、龍路、火路)和皮膚，導致三道兩路功能失常而致病。在壯族民間常用壯醫(yī)桉楝雙蓮方治療日常生活中的各類皮膚瘙癢病，通過藥浴的方式，以達到改善或治愈皮膚瘙癢病的目的。壯醫(yī)桉楝雙蓮方治療瘙癢病以解毒、暢通龍路火路與疏通氣道水道為主，大葉桉、七葉蓮都有疏通氣道、祛風邪的作用，大葉桉具有消熱解毒、收斂生肌、祛風止癢之功效；七葉蓮具有除濕毒、活血行氣止痛之功效；苦楝皮具有強烈的殺蟲療癬的功效，可治療由皮膚受蟲毒而導致的瘙癢；兩面針，壯名又叫入地金牛，有疏通龍路火路的作用，可治療因邪郁閉于龍路火路，兩路受阻而導致皮膚瘙癢的病證；穿心蓮，可疏通水道，使導致皮膚瘙癢的毒邪從水道中排出，從而起到治療皮膚瘙癢的作用[5]。壯醫(yī)桉楝雙蓮方通過疏通龍路火路、暢通氣道水道，使人體之毒邪祛除于體外，從而發(fā)揮治療疾病的效果。雖然壯醫(yī)桉楝雙蓮方在民間使用范圍較廣，但是其對慢性瘙癢的治療機理和療效并不明晰。因此，本研究在壯醫(yī)基礎理論指導下，通過建立變態(tài)接觸性皮炎(Allergic contact dermatitis，ACD)模型，采用血液檢測技術來檢測桉楝雙蓮方干預前后小鼠血液(抗癢物質(zhì))成分表達水平變化及瘙癢導致的潰爛皮膚的愈合情況，研究不同劑量的壯醫(yī)桉楝雙蓮方對治療ACD模型小鼠慢性瘙癢的作用，探討其治療皮膚瘙癢病的療效，為桉楝雙蓮方進一步開發(fā)和利用，提供前期研究基礎，為今后其在臨床上治療皮膚瘙癢病提供重要的實驗依據(jù)和參考。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物

雄性ICR小白鼠45只，5～7周齡，體重為(29±4)g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，合格證號：SCXK(湘) 2016-0002。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度(24±2) ℃，相對濕度50%～70%(RH)，晝夜間歇光照，給予SPF級飼料和純凈水。

1.2 藥品與試劑

大葉桉200 g、七葉蓮200 g、兩面針200 g、穿心蓮200 g、苦丁茶200 g、金銀花藤200 g、龍膽木200 g、苦楝皮200 g(購置于普通藥材鋪)；醋酸地塞米松片(浙江仙琚制藥股份有限公司，生產(chǎn)批號：160444)；丙酮、歐麗薇蘭特級初榨橄欖油(生產(chǎn)批號：F20170609)；氯化鈉溶液(石家莊四藥有限公司，生產(chǎn)批號：1611221902)；2，4-二硝基氟苯(SIGMA-ALDRICH，生產(chǎn)批號：BCBR8143V)；小鼠免疫球蛋白E(IgE)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(伊萊瑞特，生產(chǎn)批號：E-EL-M0691c)；小鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(伊萊瑞特，生產(chǎn)批號：E-EL-M0049c)；小鼠白介素6(IL-6)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(伊萊瑞特，生產(chǎn)批號：E-EL-M0044c)；小鼠白介素1β(IL-1β)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(伊萊瑞特，生產(chǎn)批號：E-EL-M0037c)；小鼠白介素4(IL-4)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(伊萊瑞特，生產(chǎn)批號：E-EL-M0043c)；小鼠白介素13(IL-13)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(伊萊瑞特，生產(chǎn)批號：E-EL-M0727c)組胺(HIS)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(伊萊瑞特，生產(chǎn)批號：E-EL-0032c)；小鼠白介素31(IL-31)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(優(yōu)爾生，生產(chǎn)批號：SEB179Mu)。

1.3 實驗儀器與設備

HDR-CX405型數(shù)碼HD攝錄一體機(上海索尼電子有限公司)；SQP型電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)；YE3B16062移液槍(1 000～5 000 μL )、YE3K149048移液槍(100～1 000 μL)、YE3K145273移液槍(5～50 μL)(大龍興創(chuàng)儀器(北京)有限公司)；BCD-290W型冰箱(青島海爾股份有限公司)；C2500-R-230V型微型高速離心機(美國Labnet)；ICV-450型電熱恒溫培養(yǎng)箱(日本ASONE)；MuLtiskan MK3型全自動酶標儀(Thermo scientific)。

1.4 小鼠ACD模型建立

參照文獻[6]的方法建立小鼠ACD模型。48只ICR小鼠適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為6組，分別為空白對照組、造模組(0.2% DNFB)、壯醫(yī)桉楝雙蓮方低劑量組、壯醫(yī)桉楝雙蓮方中劑量組(20 mg/kg)、壯醫(yī)桉楝雙蓮方高劑量組(50 mg/kg)、陽性對照組(地塞米松，5 mg/mL)，每組各8只。除空白對照組外，其他組實驗前5天剃除頸背部毛發(fā)(面積約為3 cm×3 cm)，剃除小鼠腹部毛發(fā)(面積約為4 cm×4 cm)，使皮膚完全暴露出來。提前3天對小鼠腹部皮膚給予0.5%DNFB(丙酮∶橄欖油4∶1稀釋)，給藥量為100 μL/只。第0天對小鼠頸部剃毛部位給予0.2%DNFB(丙酮∶橄欖油按4∶1稀釋)，給藥量為100 μL/只，之后每周用0.2%DNFB進行3次頸部皮膚的敏化(具體敏化時間見圖1)給藥量為100 μL/只?？瞻捉M不予用藥，造模組僅致敏給藥，給藥量為100 μL/只，每周3次進行皮膚敏化；其余4組在需要進行敏化的當天，上午7點進行相應的藥物治療，下午5點進行0.2% DNFB皮膚敏化，除開致敏的天數(shù)，其余每天均按時進行相應的藥物治療給藥，直至實驗結束，實驗共進行25天。

1.5 檢測指標和方法

1.5.1 小鼠瘙癢行為學觀察 通過小鼠的搔抓行為對比來評價瘙癢的嚴重程度。小鼠瘙癢行為學錄制在給予小鼠腹部0.5%DNFB敏化后1天開始進行(即實驗的第1、4、11、19、24天)(實驗進程見圖1)提前5 min將小鼠放進亞克力板方形的透明盒子里適應環(huán)境，15 min后在安靜、無干擾的環(huán)境中持續(xù)拍攝小鼠1 h，由不知情人員對回放錄像中每只小鼠的搔抓次數(shù)進行統(tǒng)計。一次搔抓是指小鼠的后爪抓撓頸部藥物的部位的一次或多次動作，當后爪落在地上或被舔和咬，就代表一次搔抓的結束。小鼠前肢運動和前爪、耳、腹劃傷均無統(tǒng)計學差異。

圖1 實驗進程

1.5.2 瘙癢相關細胞因子檢測 通過眼球提取獲得小鼠全血，離心保存，按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測小鼠血清中IgE、TFNα、IL13、IL31濃度水平的變化。

1.5.3 統(tǒng)計學方法 所有實驗數(shù)據(jù)均采用柱狀圖和折線圖的形式，以(mean±SEM，N=x)表示，采用GraphPad Prism軟件進行相關數(shù)據(jù)分析，根據(jù)數(shù)據(jù)類型分別采用單因素方差分析，組間比較行t檢驗。

2 實驗結果

2.1 ACD模型小鼠的皮膚觀察

在每次給予小鼠DNFB刺激前，按照評分標準(評分標準見表 1)，對小鼠的皮膚情況一一進行評分。實驗第14天進行皮膚評分(評分標準見圖2)，結果顯示：不同劑量的壯醫(yī)桉楝雙蓮方對ACD模型小鼠皮膚的影響程度不同?？瞻捉M小鼠皮膚光滑平整毛順，造模組小鼠皮膚潰爛明顯(圖4.B/圖3.B)，高劑量壯醫(yī)桉楝雙蓮方組小鼠皮膚基本無損傷(圖4.F/圖3.F)，高劑量壯醫(yī)桉楝雙蓮方減輕皮膚潰爛效果相對較好；而低(圖4.D/圖3.D )、中(圖4.E/圖3.E)劑量組和陽性對照組小鼠(圖4.C/圖3.C)基本已經(jīng)有了結痂，但小鼠皮膚受損及潰爛程度相對造模組小鼠來說較輕；壯醫(yī)桉楝雙蓮方高劑量組小鼠皮膚受損及潰爛程度與陽性對照組相比較(參考圖3/圖4，圖4為圖3完整圖)，皮膚受損情況無明顯差異。造模組(0.000±0.000，N=7)，壯醫(yī)桉楝雙蓮方低劑量組(1.125±0.109，N=8)，壯醫(yī)桉楝雙蓮中劑量組(1.857±0.484，N=7)，壯醫(yī)桉楝雙蓮方高劑量組(1.500±0.490，N=6)，及陽性對照組(0.188±0.333，N=6)，造模組與壯醫(yī)桉楝雙蓮方中、高劑量組，有顯著差異(P<0.01)；造模組與陽性對照組比較，無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；壯醫(yī)桉楝雙蓮方低、中、高劑量組與陽性對照組比較，均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(見圖5、圖6)。

表1 評分標準

圖2 評分標準

圖3 不同組別小鼠皮膚損傷情況

圖4 不同組別小鼠皮膚損傷情況(為圖3完整圖)

圖5 不同小組小鼠皮膚潰爛程度評分

圖6 實驗室第14天各組小鼠皮膚評分

2.2 ACD模型小鼠的行為學觀察

接觸性皮炎的一個重要臨床癥狀是自發(fā)慢性瘙癢，為了對皮膚的瘙癢程度進行量化，我們使用小鼠的后爪刮擦剃毛部位的次數(shù)作為判斷瘙癢程度的指標。觀察ACD模型小鼠慢性瘙癢行為，我們發(fā)現(xiàn)與空白對照組相比，造模組小鼠瘙癢行為的數(shù)量顯著增加(P<0.01)。壯醫(yī)桉楝雙蓮方中、高劑量組分別與造模組比較，有顯著性差異(P<0.05)；壯醫(yī)桉楝雙蓮方低劑量組與造模組相比較，結果無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。實驗結果表明：壯醫(yī)桉楝雙蓮方可以減輕受到藥物刺激的小鼠的慢性瘙癢行為，但是不明顯，僅有壯醫(yī)桉楝雙蓮方低劑量組的效果較為明顯，而壯醫(yī)桉楝雙蓮方中、高劑量組無明顯效果，壯醫(yī)桉楝雙蓮方組與陽性對照組相比較，低劑量組抑制瘙癢的效果比地塞米松作用強。見表2。

表2 不同劑量壯醫(yī)桉楝雙蓮方對ACD模型小鼠慢性瘙癢的影響

2.3 小鼠血清瘙癢相關因子濃度水平變化

本研究將壯醫(yī)桉楝雙蓮方低、中、高劑量組與造模組進行比較，結果發(fā)現(xiàn)，小鼠血清中抗炎癥因子IgE、TFN-α、IL-13、IL-31表達量無明顯降低(P>0.05)，陽性對照組與壯醫(yī)桉楝雙蓮方低劑量組比較，表達量無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，陽性對照組與壯醫(yī)桉楝雙蓮方中、高劑量組比較，表達量無統(tǒng)計學差異(P<0.05)。表明壯醫(yī)桉楝雙蓮方不能明顯降低ACD模型小鼠血清中IgE、TFN-α、IL-13、IL-31濃度。見圖7-圖10。

圖7 壯醫(yī)桉楝雙蓮方對ACD模型小鼠IgE濃 度水平變化的影響

圖8 壯醫(yī)桉楝雙蓮方對ACD模型小鼠TNF-α濃 度水平變化的影響

圖9 壯醫(yī)桉楝雙蓮方對ACD模型小鼠 IL-13濃 度水平變化的影響

圖10 壯醫(yī)桉楝雙蓮方對ACD模型小鼠 IL-31濃 度水平變化的影響

3 討論

慢性瘙癢是常見的皮膚病，影響著人們的工作和生活，壯醫(yī)桉楝雙蓮方在民間的臨床使用范圍較廣，但是其對慢性瘙癢的治療機理和療效并不明晰。本實驗對經(jīng)DNFB敏化以及藥物治療的ACD模型小鼠進行了行為學觀察，通過對行為學數(shù)據(jù)、實驗小鼠血清檢測數(shù)據(jù)、小鼠皮損評分數(shù)據(jù)以及小鼠體重變化等數(shù)據(jù)的分析，探討壯醫(yī)桉楝雙蓮方治療小鼠ACD慢性瘙癢的治療機理和療效研究。

通過對血液中各種炎性細胞因子檢測結果的統(tǒng)計學分析﹙兩組間t檢驗﹚，結果發(fā)現(xiàn)：本實驗中壯醫(yī)桉楝雙蓮方對ACD模型小鼠的慢性瘙癢無明顯抑制作用。實驗結果誤差分析表明：①在實驗初期，因?qū)嶒灹鞒膛c具體用藥不夠熟悉，導致空白對照組多只小鼠因?qū)嶒灢僮魇д`而被處死，使空白組小鼠的實驗數(shù)據(jù)缺失，最終實驗缺少了標準對照數(shù)據(jù)的分析；②治療藥物的提取，采用傳統(tǒng)的水煎濃縮法提取實驗藥物，提取到的藥液含雜質(zhì)較多，藥液純度低。當藥物用于實驗小鼠局部皮膚時，藥物就會附著在小鼠局部皮膚，這就變成了一種促進局部炎癥發(fā)生的因素，且藥物的附著也會使小鼠局部皮膚不能保持干燥，從而影響小鼠炎癥的愈合，再者附著的藥物影響了后續(xù)小鼠的給藥治療和局部藥物的吸收，進一步影響了壯醫(yī)桉楝雙蓮方對ACD模型小鼠慢性瘙癢的治療；③在后續(xù)對小鼠給藥治療時，由于濃縮藥物黏度過大，有部分藥物不可避免地黏附在儀器槍上，導致給藥量偏低，從而影響壯醫(yī)桉楝雙蓮方的治療效果；④在實驗后期，對小鼠眼部取血樣時，由于操作不當和部分小鼠體重過低、所采集的血液太少，達不到血清檢測的最低標準，減少了實驗部分血清檢測數(shù)據(jù)，導致組與組之間組數(shù)差別過大，對后面實驗數(shù)據(jù)的分析產(chǎn)生了較大影響。

雖然實驗結果表明壯醫(yī)桉楝雙蓮方對ACD模型小鼠瘙癢無明顯抑制作用，但通過改變壯醫(yī)桉楝雙蓮方藥液的提取方式，提高提取純度，減少人為因素的影響，可以進一步驗證壯醫(yī)桉楝雙蓮方對ACD模型小鼠慢性瘙癢的抑制作用。本研究在一定程度上可對將來深入開展壯醫(yī)桉楝雙蓮方抗慢性瘙癢的相關研究提供參考。