艾灸對(duì)IBS-D模型大鼠海馬與結(jié)腸組織中TNF-α表達(dá)的影響

王宇,儲(chǔ)浩然

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院,合肥 230038;2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,合肥 230061;3.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院針灸臨床研究所,合肥 230038)

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome,IBS)是一種以腹痛或腹部不適為主,伴有排便習(xí)慣改變和(或)大便性狀異常的功能性腸病。腹瀉型腸易激綜合征(diarrhea predominant irritable bowel syndrome,IBS-D)是 IBS最主要的分型,癥狀以腹痛伴有排便次數(shù)增多(＞3次/d),大便性狀稀溏,或帶有黏液,甚至水樣便為主,嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1]。目前IBS常用的治療方法有解痙劑、止瀉藥、腸道動(dòng)力調(diào)節(jié)藥、益生菌、抗抑郁藥等,療效并不滿意[2-5],而針灸對(duì)功能性胃腸疾病的防治具有良好的療效,且不良反應(yīng)少[6]。

IBS發(fā)病機(jī)制尚未完全明確,其發(fā)病機(jī)制可能與腸道動(dòng)力及感覺(jué)異常、炎癥與免疫、精神與心理等有關(guān),所有這些發(fā)病因素均與腦-腸軸相關(guān),腦腸軸功能失調(diào)是IBS-D發(fā)病的重要病機(jī)[7-8]。炎癥和免疫反應(yīng)異常參與 IBS-D發(fā)病,且與腦-腸軸密切相關(guān)[9]。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)作為一種促炎細(xì)胞因子,是構(gòu)成機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要介質(zhì),在IBS-D免疫應(yīng)答、免疫調(diào)節(jié)及炎癥反應(yīng)中均具有十分重要的作用,影響IBS-D內(nèi)臟高敏感性[10],是IBS-D動(dòng)物模型的客觀評(píng)價(jià)指標(biāo)。TNF-α也是腦-腸互動(dòng)的一種重要介質(zhì),有研究發(fā)現(xiàn)TNF-α在IBS-D大鼠的海馬和結(jié)腸組織中均異常表達(dá),影響腦-腸軸功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)改變,進(jìn)而導(dǎo)致 IBS-D的發(fā)生和發(fā)展[9]。目前,腦腸軸是IBS-D研究的熱點(diǎn)[11-13]。近年來(lái),對(duì)針灸治療IBS-D調(diào)節(jié)腦腸軸和降低細(xì)胞因子表達(dá)的作用機(jī)制研究較多,但將細(xì)胞因子與腦-腸軸聯(lián)系的研究較少。所以艾灸治療 IBS-D是否是通過(guò)抑制腦-腸軸中細(xì)胞因子的表達(dá)需進(jìn)一步深入探討。本研究擬觀察艾灸對(duì)IBS-D大鼠海馬與結(jié)腸組織中TNF-α蛋白和mRNA表達(dá)的變化,探討艾灸治療 IBS-D是否與抑制腦-腸軸中細(xì)胞因子的表達(dá)有關(guān),此機(jī)制是否是通過(guò)腦-腸軸途徑調(diào)節(jié)腸道黏膜免疫功能。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用健康SD雄性大鼠24只,購(gòu)于安徽醫(yī)科大學(xué),體質(zhì)量(220±30)g,動(dòng)物許可證號(hào)為 SCXK(皖)2017-001。動(dòng)物在安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng),飼養(yǎng)條件為Ⅱ級(jí),光照周期 12 h/12 h,室溫 22℃～25℃,相對(duì)濕度 45%～60%,自由進(jìn)食、飲水。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中 SD大鼠的處理方法均遵照中華人民共和國(guó)科技部2006年頒布的有關(guān)動(dòng)物的使用及倫理學(xué)規(guī)定。

1.2 主要儀器和試劑

細(xì)艾條(直徑 0.5 cm,南陽(yáng)宛北艾絨廠),TNF-α的PCR引物(生工生物工程股份有限公司),反轉(zhuǎn)錄試劑盒(K1622,Thermo Scientific,美國(guó)),TNF-α抗體(bs-2081R,北京博奧森生物技術(shù)有限公司),通用型二抗試劑盒(PV-6000,北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),DAB顯色試劑盒(ZL1-9018,北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),熒光定量PCR儀(Thermo Scientific,美國(guó)),番瀉葉購(gòu)自安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中藥制劑室提供制劑。

1.3 造模方法

采用慢性束縛聯(lián)合番瀉葉灌胃方法造IBS-D大鼠模型。對(duì)模型組和艾灸組大鼠進(jìn)行番瀉葉灌胃(將番瀉葉置入100℃沸水中浸泡30 min,并經(jīng)雙層紗布過(guò)濾,最后將濾液減壓濃縮成生藥含量為 0.45 g/mL,在﹣4℃冰箱保存?zhèn)溆谩┝繛?1 mL/100 g)。灌胃后,用粗制棉繩束縛大鼠雙后肢,以限制大鼠活動(dòng),每日 1 h。對(duì)空白組大鼠以等體積蒸餾水灌胃,連續(xù)14 d[14-15]。以模型組大鼠稀便率升高至少 50%、腹部回縮反射的最小容量閾值降低至少 1 mL,與空白組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義為造模成功的標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 分組與干預(yù)

將24只SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、艾灸組,每組 8只?？瞻捉M不做任何干預(yù),模型組僅造模,不進(jìn)行其他干預(yù)。艾灸組取穴為雙側(cè)上巨虛、天樞[16],將大鼠置于特制大鼠艾灸架上,將直徑0.5 cm細(xì)艾條固定于艾灸支架上,懸于穴位上約2 cm處,每日1次,每次每穴灸30 min,共7次。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 稀便率

在治療結(jié)束后第1天,觀察6 h內(nèi)各組大鼠的稀便率。稀便率(%)=稀便數(shù)/總排便粒數(shù)×100%。干稀便的區(qū)分以濾紙上有無(wú)污跡為準(zhǔn)。

1.5.2 球囊擴(kuò)張反射(CRD)容量閾值

內(nèi)臟敏感性評(píng)估,即非傷害性結(jié)直腸球囊擴(kuò)張反射(CRD)容量閾值測(cè)定,是在稀便率檢測(cè)結(jié)束后,對(duì)各組大鼠 CRD誘發(fā)刺激下的腹部回縮反射(AWR)進(jìn)行容量閾值測(cè)定。實(shí)驗(yàn)前,各組大鼠禁食不禁水 12 h。輕度麻醉后,將經(jīng)甘油潤(rùn)滑后8F的導(dǎo)尿管緩慢插入肛門,將大鼠放于透明塑料盒中。待大鼠完全蘇醒后約20 min,經(jīng)球囊注入26℃～28℃的生理鹽水,觀察引起大鼠腹部回縮反射的最小容量閾值,重復(fù)3次,取3次均值作為直腸擴(kuò)張引起腹部回縮反射的最小容量閾值[17-18]。

1.5.3 海馬和結(jié)腸組織中TNF-α蛋白表達(dá)檢測(cè)

采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)海馬和結(jié)腸組織中TNF-α蛋白表達(dá)。海馬和結(jié)腸組織經(jīng)組織脫水,石蠟包埋,切片。依次過(guò)3道二甲苯,每道15 mim。依次過(guò)3道100%、95%、80%乙醇,每道5 min,自來(lái)水流水緩慢沖洗?？乖邏盒迯?fù)。在組織上滴加 3% H2O2,室溫孵育20 min。PBS沖洗3遍,滴加一抗(1:200),4℃冰箱過(guò)夜。PBS沖洗3遍,片子甩干,加二抗,孵育20 min。PBS沖洗 3遍,甩干,加 DAB顯色劑,顯微鏡下控制顯色。顯色完全后,蒸餾水沖洗。蘇木素染色 1 min,水沖洗。1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒,水沖洗。碳酸鋰藍(lán)化1 min,水沖洗。經(jīng)過(guò)脫水、透明、封片后,顯微鏡觀察。通過(guò)數(shù)字掃描儀掃描整張片子并保存,利用數(shù)字掃描的讀片軟件(CaseViewer)進(jìn)行選片,使用形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)軟件(JD801)分析,計(jì)算其平均光密度值(Average Optical Density,AOD)。

1.5.4 海馬和結(jié)腸組織中TNF-α mRNA表達(dá)檢測(cè)

采用Rt-qPCR檢測(cè)海馬和結(jié)腸組織中TNF-α mRNA的表達(dá)。提取結(jié)腸組織中RNA,經(jīng)RT反應(yīng)后,最后熒光定量 PCR反應(yīng)獲得的數(shù)據(jù),根據(jù)擴(kuò)增效率和熔解曲線分析,記錄循環(huán)閾值(Ct),并經(jīng) Relative Quantification Study分析方法和2﹣△△Ct方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量,△△Ct計(jì)算公式為△△Ct=(Ct目的基因－Ct內(nèi)參基因)實(shí)驗(yàn)組－(Ct目的基因－Ct內(nèi)參基因)對(duì)照組。各基因片段擴(kuò)增引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCR引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS24.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,符合正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析比較,方差齊時(shí)用LSD法,方差不齊時(shí)用Tamhane’s法,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布采用Kruskal-Wallis H秩和檢驗(yàn),以P＜0.O5為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)性分析采用Pearson或Spearman相關(guān)系數(shù),若兩組均服從正態(tài)分布,則使用雙變量相關(guān)分析中的Pearson相關(guān)分析;若兩組不全部服從正態(tài)分布,則使用Spearman相關(guān)分析。若P＜0.05,為兩個(gè)變量存在相關(guān)性,若相關(guān)系數(shù)為0＜r＜1之間,為呈正相關(guān),在﹣1＜r＜0之間,為呈負(fù)相關(guān)。

2 結(jié)果

2.1 各組腹部回縮反射的最小容量閾值和稀便率比較

與空白組比較,模型組腹部回縮反射的最小容量閾值顯著下降(P＜0.01),稀便率顯著升高(P＜0.01);與模型組比較,艾灸組腹部回縮反射的最小容量閾值均顯著升高(P＜0.01),稀便率均顯著下降(P＜0.01)。詳見(jiàn)圖1。

2.2 各組海馬和結(jié)腸組織中TNF-α蛋白表達(dá)比較

與空白組比較,模型組大鼠海馬和結(jié)腸 TNF-α蛋白表達(dá)增高(P＜0.01);與模型組比較,艾灸組大鼠海馬和結(jié)腸TNF-α蛋白表達(dá)降低(P＜0.01)。詳見(jiàn)圖2-4。

圖1 各組大鼠腹部回縮反射的最小容量閾值和稀便率比較

圖2 各組大鼠結(jié)腸組織TNF-α的免疫組化(×200)

圖3 各組大鼠海馬組織TNF-α的免疫組化(×200)

圖4 各組大鼠海馬和結(jié)腸TNF-α蛋白表達(dá)比較

2.3 海馬和結(jié)腸組織中TNF-α蛋白表達(dá)相關(guān)性分析

根據(jù)散點(diǎn)圖初步判斷海馬和結(jié)腸組織中 TNF-α蛋白表達(dá)間存在線性關(guān)系;線性相關(guān)性分析表明,空白組、模型組和艾灸組海馬、結(jié)腸組織的 TNF-α蛋白表達(dá)量呈正相關(guān)(0＜r＜1,P＜0.05)。詳見(jiàn)圖5,表2。

圖5 各組大鼠海馬和結(jié)腸組織中TNF-α蛋白表達(dá)相關(guān)性的散點(diǎn)圖

表2 各組大鼠海馬和結(jié)腸組織中TNF-α蛋白表達(dá)相關(guān)性分析 (±s)

表2 各組大鼠海馬和結(jié)腸組織中TNF-α蛋白表達(dá)相關(guān)性分析 (±s)

組別 n 海馬組織 結(jié)腸組織 相關(guān)系數(shù) P空白組 8 0.100±0.009 0.162±0.008 0.976 0.001模型組 8 0.293±0.011 0.523±0.008 0.881 0.04艾灸組 8 0.178±0.006 0.312±0.007 0.880 0.04

2.4 各組海馬和結(jié)腸組織中TNF-α mRNA的表達(dá)比較

與空白組比較,模型組海馬和結(jié)腸組織中TNF-α mRNA的表達(dá)顯著增加(P＜0.01);與模型組比較,艾灸組海馬和結(jié)腸組織中 TNF-α mRNA的表達(dá)顯著降低(P＜0.01)。詳見(jiàn)圖6。

2.5 海馬和結(jié)腸組織中TNF-α mRNA相關(guān)性分析

根據(jù)散點(diǎn)圖初步判斷海馬和結(jié)腸組織中TNF-α mRNA間存在線性關(guān)系;線性相關(guān)性分析表明,空白組、模型組和艾灸組海馬、結(jié)腸組織的TNF-α mRNA表達(dá)量呈正相關(guān)(0＜r＜1,P＜0.05)。詳見(jiàn)圖7,表3。

圖6 各組大鼠海馬和結(jié)腸TNF-α mRNA的表達(dá)比較

圖7 各組大鼠海馬和結(jié)腸組織中TNF-α mRNA相關(guān)性的散點(diǎn)圖

2.6 海馬和結(jié)腸組織中TNF-α mRNA與內(nèi)臟敏感度和稀便率相關(guān)性分析

根據(jù)散點(diǎn)圖初步判斷海馬和結(jié)腸組織中TNF-α mRNA與內(nèi)臟敏感度和稀便率間存在線性關(guān)系;線性相關(guān)性分析表明,空白組、模型組和艾灸組海馬、結(jié)腸組織的 TNF-α mRNA表達(dá)量與內(nèi)臟敏感度呈負(fù)相關(guān)(﹣1＜r＜0,P＜0.01),空白組、模型組和艾灸組海馬、結(jié)腸組織的 TNF-α mRNA表達(dá)量與稀便率呈正相關(guān)(0＜r＜1,P＜0.01)。詳見(jiàn)圖8。

表3 各組大鼠海馬和結(jié)腸組織中TNF-α mRNA相關(guān)性分析 (±s)

表3 各組大鼠海馬和結(jié)腸組織中TNF-α mRNA相關(guān)性分析 (±s)

組別 n 海馬組織 結(jié)腸組織 相關(guān)系數(shù) P空白組 8 0.99±0.10 0.98±0.11 0.7950 0.0184模型組 8 6.49±0.85 4.23±0.65 0.9262 0.0009艾灸組 8 2.69±0.26 1.41±0.24 0.8347 0.0099

圖8 大鼠海馬和結(jié)腸組織中TNF-α mRNA與內(nèi)臟敏感度和稀便率相關(guān)性的散點(diǎn)圖(24只/組)

3 討論

腸道黏膜低度炎癥等免疫功能失調(diào)在IBS-D的致病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。胃腸道是人體最大的免疫系統(tǒng),全身近70%的淋巴組織附于腸道黏膜。淋巴系統(tǒng)內(nèi)含有大量免疫細(xì)胞,將外在的病原體與人體內(nèi)環(huán)境隔開(kāi),起到黏膜免疫的作用[19]。IBS患者腸腔中的食物抗原、細(xì)菌等穿過(guò)腸黏膜,激活黏膜下的免疫系統(tǒng),促進(jìn)炎癥因子TNF-α釋放,TNF-α作用于腸道神經(jīng)元和平滑肌細(xì)胞,導(dǎo)致腸黏膜化學(xué)感受器和機(jī)械感受器對(duì)各種刺激敏感性增加,參與腸黏膜炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展［10],引起或維持腸道持續(xù)低度炎癥反應(yīng),從而引發(fā)IBS癥狀。有研究顯示,TNF-α等炎癥因子的高表達(dá)在IBS-D疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用,它們通過(guò)神經(jīng)、內(nèi)分泌等途徑影響腸道動(dòng)力作用于腸道黏膜層和平滑肌層的神經(jīng)纖維,從而產(chǎn)生腹痛、腹脹及大便性狀的改變等癥狀[20]。本研究發(fā)現(xiàn)空白組、模型組和艾灸組海馬、結(jié)腸組織的 TNF-α mRNA表達(dá)量與內(nèi)臟敏感度呈負(fù)相關(guān),與稀便率呈正相關(guān),提示 TNF-α的表達(dá)增加與腹痛及稀便相關(guān)。IBS-D大鼠海馬和結(jié)腸組織中TNF-α mRNA表達(dá)升高,艾灸治療后,IBS-D大鼠稀便率降低、腹部回縮反射的最小容量閾值升高,海馬和結(jié)腸組織中TNF-α mRNA表達(dá)降低,提示艾灸能調(diào)節(jié)免疫反應(yīng),有效地減輕IBS-D大鼠腸道低度炎癥。

腦-腸軸是指胃腸道和大腦間相互作用的雙向調(diào)節(jié)系統(tǒng),其有機(jī)地把胃腸功能和腦功能聯(lián)系起來(lái),是維持腸管正常生理功能的基礎(chǔ),對(duì)腸道疾病發(fā)生的機(jī)制及治療方法的選擇有著重要的指導(dǎo)意義[21-22]。腦-腸軸可通過(guò)“腦腸互動(dòng)”體現(xiàn),即胃腸道活動(dòng)的信息傳入到中樞神經(jīng)系統(tǒng),并由中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)信息進(jìn)行整合,將調(diào)控信息傳送到腸神經(jīng)系統(tǒng),或直接作用于胃腸效應(yīng)細(xì)胞[7]。功能磁共振成像(FMRI)顯示 IBS患者存在腦部功能的變化,大腦皮層的活動(dòng)性與內(nèi)臟感覺(jué)以及癥狀呈現(xiàn)同步改變的現(xiàn)象,且目前 IBS患者中海馬功能的紊亂已經(jīng)是很多研究達(dá)成的共識(shí)[23]。

免疫系統(tǒng)活化的標(biāo)志之一是細(xì)胞因子的分泌,結(jié)腸中局部產(chǎn)生的細(xì)胞因子參與了 IBS腦腸軸的互動(dòng),通過(guò)傳入神經(jīng)將炎癥信號(hào)傳遞入腦。腦中存在著一個(gè)由神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞組成的免疫反應(yīng)網(wǎng)絡(luò),對(duì)外周傳入的信號(hào)做出反應(yīng)。外周炎癥因子傳遞至腦內(nèi)后可引起小膠質(zhì)細(xì)胞的活化,進(jìn)一步分泌促炎性細(xì)胞因子[24]。Zhang G等[25]研究發(fā)現(xiàn),CRD可增加海馬小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)外周疼痛傳入信號(hào)的敏感性,促使已致敏的小膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎性細(xì)胞因子,作用于周圍的神經(jīng)元細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)痛,加重內(nèi)臟高敏感性的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn),IBS-D大鼠海馬和結(jié)腸組織中TNF-α mRNA表達(dá)明顯升高,且呈正相關(guān)。艾灸治療后,IBS-D大鼠海馬和結(jié)腸組織中TNF-α mRNA表達(dá)水平明顯降低,呈正相關(guān),提示艾灸治療 IBS-D可能與降低腦-腸軸中細(xì)胞因子TNF-α有關(guān)。

艾灸具有溫陽(yáng)通脈、活血化瘀、舒經(jīng)活絡(luò)之功效。天樞穴乃大腸募穴,在調(diào)理中焦、調(diào)暢氣機(jī)等方面十分有效。上巨虛為大腸下合穴,《外臺(tái)秘要》:“巨虛上廉,足陽(yáng)明與大腸合,在三里下三寸,灸三壯,主飧泄大腸痛?！惫拾纳暇尢撗軌蛘{(diào)理氣血、疏通經(jīng)絡(luò),治療胃腸疾病,且能提高痛閾,抑制中樞神經(jīng)和外周神經(jīng)的痛覺(jué)傳導(dǎo),有明顯的鎮(zhèn)痛作用[26]。合募配穴治療腑病,升清降濁,止瀉止痛。此為艾灸對(duì)IBS-D腦-腸軸過(guò)程的干預(yù)作用提供了理論依據(jù)。所以艾灸治療 IBS-D與降低腦-腸軸中細(xì)胞因子TNF-α mRNA有關(guān)。

綜上,艾灸天樞、上巨虛改善IBS-D大鼠腹瀉癥狀和內(nèi)臟高敏感性,可能與艾灸抑制海馬和結(jié)腸組織中細(xì)胞因子 TNF-α的表達(dá),調(diào)節(jié)腸道黏膜免疫功能有關(guān),此機(jī)制可能是通過(guò)腦-腸軸實(shí)現(xiàn),但具體作用機(jī)制尚未明確,還需進(jìn)一步研究。