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    西達本胺對利妥昔單抗耐藥B細胞淋巴瘤增殖的影響及作用機制

    2020-11-17 13:32:18柯晴羅瞾岑洪
    中國癌癥防治雜志 2020年5期
    關鍵詞:西達乙?;?/a>抑制率

    柯晴 羅瞾 岑洪

    作者單位:530021 南寧 廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院淋巴血液及兒童腫瘤內科

    B細胞淋巴瘤是一種起源于B淋巴細胞的淋巴瘤,臨床上常見的類型包括彌漫大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤及套細胞淋巴瘤[1]。利妥昔單抗聯(lián)合標準化療治療B細胞淋巴瘤取得了理想的療效,但仍有20%~30%的患者因腫瘤耐藥死亡[2]。利妥昔單抗是基因工程人鼠嵌合單克隆抗體,作用于淋巴細胞表面的CD20抗原,可顯著改善濾泡性淋巴瘤患者生存期,也使更多的侵襲性B細胞淋巴瘤患者得到根治機會。在臨床上雖然許多患者初始治療對利妥昔單抗敏感,但最終仍會復發(fā),因此利妥昔單抗獲得性耐藥已成為B細胞淋巴瘤治療面臨的最大挑戰(zhàn)之一。西達本胺是我國自主設計和制造的新一代酰胺類組蛋白去乙?;福℉DAC)抑制劑,通過表觀遺傳調控機制,恢復耐藥腫瘤細胞對藥物的敏感性[3]。臨床上觀察到西達本胺對復發(fā)/難治性B細胞淋巴瘤患者有效[4],但其作用機制仍不明確。本研究探討西達本胺在體外對利妥昔單抗耐藥的B細胞淋巴瘤細胞株Jeko-1/R增殖的影響及其可能的作用機制,為耐藥B細胞淋巴瘤的治療提供新的思路。

    1 材料與方法

    1.1 主要材料與儀器

    B細胞淋巴瘤細胞株Jeko-1購自中國科學院上海細胞庫,Jeko-1/R細胞由親本Jeko-1細胞經利妥昔單抗體外濃度梯度遞增方式培養(yǎng)誘導構建而成。細胞置于含100 U/mL青霉素-鏈霉素,10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基,在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。Jeko-1/R細胞培養(yǎng)于含50 μg/mL利妥昔單抗的培養(yǎng)基中維持耐藥表型[5]。

    RPMI 1640細胞培養(yǎng)液及胎牛血清購自美國Gibco公司。細胞增殖與毒性檢測試劑盒(CCK-8)購自上海七海復泰公司。RNA逆轉錄酶試劑盒購自日本TaKaRa公司??挂阴;疕3、H4抗體、內參β-actin及其相對應的二抗均購自Abcam公司。健康人血清作為人補體來源。利妥昔單抗(rituximab,美羅華,10mg/mL)為商品化的羅氏公司產品。西達本胺由深圳微芯公司贈送,溶于DMSO配置成10 mmol/L的儲存液,保存在-20℃冰箱。

    1.2 CCK-8法檢測藥物對細胞增殖的影響

    取對數生長期的Jeko-1和Jeko-1/R細胞,調整細胞密度為5×104/mL,以每孔100 μL接種于96孔板。實驗設置對照組和不同濃度用藥組,其中單藥組分別加入 25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL 和 200 μg/mL利妥昔單抗或 4 μmol/L、8 μmol/L 和 16 μmol/L西達本胺;兩藥聯(lián)合組加入100 μg/mL利妥昔單抗及8 μmol/L西達本胺,對照組接種細胞但只給予同體積的培養(yǎng)基而不加藥物,另設不含細胞只含培養(yǎng)基的空白對照組。分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后,每孔加入10 μL CCK-8試劑繼續(xù)培養(yǎng)2 h。用酶標儀測定450 nm波長處的吸光度(OD),計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=[(OD對照-OD實驗)/(OD對照-OD空白)]×100%。實驗重復3次。

    1.3 RT-PCR檢測細胞CD20mRNA的表達水平

    取培養(yǎng)48h后的各組細胞,按TRIzol試劑說明書提取細胞總RNA,按逆轉錄試劑盒說明書制備cDNA。取1 μL cDNA配制RT-PCR體系進行PCR檢測。引物序列由上海生工生物公司設計和合成,以GAPDH為內參。引物序列:GAPDH上游為 5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′,下游為 5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′;CD20 上游為 5′-ATGAAAGGCCCTATTGCTATG-3′,下游為 5′-GCTGGTTCACAGTTGTATATG-3′。PCR反應條件:95℃預變性2 min,95℃變性15 s,60℃退火延伸1 min,擴增40個循環(huán)。擴增結束后制作融解曲線。采用2-△△Ct法計算mRNA的相對表達量。每個樣本獨立重復實驗3次。

    1.4 Western blot法檢測組蛋白H3、H4乙酰化水平

    取Jeko-1/R細胞,加入不同濃度(0μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L)西達本胺,48 h 后收集細胞并提取細胞總蛋白,BCA法檢測蛋白濃度。取40~60 μg蛋白上樣,SDS-PAGE電泳后轉移至硝酸纖維素膜,5%脫脂奶粉封閉1 h后,分別加入相應一抗(稀釋比例1∶1 000),4℃孵育過夜。次日加入二抗(稀釋比例 1∶8 000),室溫孵育60 min,用顯色劑顯色成像。用Image Lab軟件對目的條帶和內參條帶測量灰度值,以目的條帶與內參條帶的灰度值比值表示對應蛋白的表達水平。

    1.5 統(tǒng)計學方法

    采用SPSS 20.0軟件進行數據分析。計量數據以均數±標準差(±s)表示,兩組均數比較采用獨立樣本t檢驗;多組均數比較采用單因素方差分析,若組間差異有統(tǒng)計學意義,進一步的多重比較采用Dunnett′s t檢驗。本研究以雙側P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1 單藥利妥昔單抗和西達本胺對Jeko-1和Jeko-1/R細胞增殖的影響

    CCK-8實驗結果顯示,不同濃度(25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL)利妥昔單抗和(4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L)西達本胺分別單獨處理Jeko-1細胞48 h后均呈劑量依賴式抑制細胞增殖,組間差異均有統(tǒng)計學意義(F=38.533,P<0.001;F=17.968,P=0.003)。進一步多重比較顯示,25 μg/mL利妥昔單抗和4 μmol/L西達本胺處理后的細胞增殖抑制率均低于其余相應藥物作用組(均P<0.001)。

    不同濃度西達本胺作用48 h后呈劑量依賴式抑制Jeko-1/R細胞增殖,組間差異有統(tǒng)計學意義(F=51.456,P<0.001),且4 μmol/L西達本胺處理后的細胞增殖抑制率均低于其余相應藥物作用組(均P<0.001)。但不同濃度西達本胺處理Jeko-1和Jeko-1/R細胞的增殖抑制率差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05);而不同濃度利妥昔單抗處理Jeko-1/R細胞的增殖抑制率均低于Jeko-1細胞(均P<0.001),其中當利妥昔單抗作用濃度為 100 μg/mL 時,Jeko-1、Jeko-1/R 細胞增殖抑制率均最高,選擇100 μg/mL濃度利妥昔單抗進行后續(xù)實驗。見圖1、圖2。

    2.2 西達本胺聯(lián)合利妥昔單抗對Jeko-1和Jeko-1/R細胞增殖的影響

    CCK-8實驗結果顯示,西達本胺聯(lián)合利妥昔單抗呈時間依賴式抑制Jeko-1和Jeko-1/R細胞增殖,組間差異有統(tǒng)計學意義(F=25.272,P=0.001;F=76.105,P<0.001),多重比較顯示,48 h、72 h細胞增殖抑制率均高于24 h(均P<0.01);各時間點兩者聯(lián)合處理Jeko-1和Jeko-1/R細胞的增殖抑制率差異均無統(tǒng)計學意義(均 P>0.05),見表 1、圖 3。48 h時,兩者聯(lián)合處理Jeko-1、Jeko-1/R細胞的增殖抑制率均高于單藥西達本胺[(79.57±7.27)%vs(66.49±6.33)%,t=-2.800,P=0.049;(74.35±9.65)%vs(64.15±5.09)%,t=-3.815,P=0.019]。

    圖1 利妥昔單抗抑制Jeko-1和Jeko-1/R細胞增殖Fig.1 Rituximab inhibited the proliferation of Jeko-1 and Jeko-1/R cells

    圖2 西達本胺抑制Jeko-1和Jeko-1/R細胞增殖Fig.2 Chidamide inhibited the proliferation of Jeko-1 and Jeko-1/R cells

    表1 西達本胺聯(lián)合利妥昔單抗對Jeko-1和Jeko-1/R細胞增殖的影響(%)Tab.1 Effects of chidamide combined with rituximab on the proliferation of Jeko-1 and Jeko-1/R cells(%)

    圖3 西達本胺聯(lián)合利妥昔單抗對Jeko-1和Jeko-1/R細胞增殖的影響Fig.3 Effect of chidamide combined with rituximab on the proliferation of Jeko-1 and Jeko-1/R cells

    2.3 西達本胺對Jeko-1和Jeko-1/R細胞CD20 mRNA表達的影響

    RT-PCR實驗結果顯示,西達本胺在48 h呈劑量依賴式上調Jeko-1/R細胞CD20 mRNA的表達,組間差異有統(tǒng)計學意義(F=346.123,P<0.001),多重比較顯示,4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L 西達本胺作用時Jeko-1/R細胞CD20 mRNA的表達水平均高于0 μmol/L(均 P<0.01)。見圖 4。

    圖4 西達本胺對Jeko-1和Jeko-1/R細胞CD20 mRNA表達的影響Fig.4 Effect of chidamide on the expression of CD20 mRNA in Jeko-1 and Jeko-1/R cells

    2.4 西達本胺對Jeko-1/R細胞組蛋白H3、H4乙?;降挠绊?/h3>

    Western blot實驗結果顯示,西達本胺在48 h可以劑量依賴式上調Jeko-1/R細胞的H3和H4的乙?;剑医M間差異有統(tǒng)計學意義(F=690.077,P<0.001;F=847.194,P<0.001),多重比較顯示,4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L西達本胺作用時H3和H4的乙?;骄哂?0 μmol/L(均 P<0.01)。見圖 5。

    3 討論

    圖5 西達本胺對Jeko-1/R細胞組蛋白H3、H4乙?;降挠绊慒ig.5 Effect of chidamide on the acetylation levels of histone H3 and H4 in Jeko-1/R cells

    B細胞淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤最常見的類型,利妥昔單抗聯(lián)合化療是有效的治療方案,但仍有部分患者不敏感,逆轉利妥昔單抗耐藥成為B細胞淋巴瘤臨床治療中亟待解決的問題之一。HDAC抑制劑作為新一代靶向抗腫瘤藥物,在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中顯示了良好療效[6-7]。其中 Vorinostat、Romidepsin、Panobinostat等HDAC抑制劑在國外已獲批用于皮膚T細胞淋巴瘤治療[8]。一項Ⅱ期臨床試驗結果顯示利妥昔單抗聯(lián)合Vorinostat能抑制惰性B細胞淋巴瘤疾病進展[9]。西達本胺也是一種新型的口服酰胺類HDAC抑制劑,可選擇性抑制 HDAC1、2、3 和 10 的活性[10]。西達本胺還可以提高組蛋白H3、H4乙?;剑l(fā)染色質重塑,并由此產生表觀遺傳改變,進而抑制腫瘤細胞增殖和誘導細胞凋亡。此外,西達本胺還具有誘導腫瘤干細胞分化、逆轉腫瘤細胞的上皮間充質表型轉化等功能,在恢復耐藥腫瘤細胞對藥物敏感性和抑制腫瘤轉移、復發(fā)等方面發(fā)揮作用[11]。目前在肝癌、白血病以及膀胱癌中西達本胺也顯示出一定療效[12-14]。2015年西達本胺被批準用于復發(fā)/難治性外周T細胞淋巴瘤的治療[10,15-16]。但HDAC抑制劑在B細胞淋巴瘤治療中的價值仍不明確。為探索西達本胺在B細胞淋巴瘤耐藥中的作用,本研究分別采用不同濃度利妥昔單抗和西達本胺處理B細胞淋巴瘤細胞株Jeko-1和耐藥細胞株Jeko-1/R,CCK-8實驗結果發(fā)現,不同濃度利妥昔單抗和西達本胺在48 h時均呈劑量依賴式抑制Jeko-1細胞增殖,但對于耐藥Jeko-1/R細胞,利妥昔單抗并未觀察到明顯的增殖抑制作用,提示Jeko-1/R對利妥昔單抗耐藥;而西達本胺作用Jeko-1/R細胞卻同樣表現出劑量依賴式增殖抑制作用,且與Jeko-1細胞的增殖抑制率比較差異未見統(tǒng)計學意義,說明西達本胺對利妥昔單抗耐藥細胞發(fā)揮了同效的增殖抑制作用,提示西達本胺可能成為B細胞淋巴瘤耐藥患者的治療選擇。

    利妥昔單抗是針對B細胞CD20抗原的一種人鼠嵌合性單克隆抗體,能特異性地與B細胞表面的CD20抗原結合,通過多種機制清除體內的B淋巴細胞。有研究發(fā)現CD20表達丟失可導致利妥昔單抗耐藥,在利妥昔單抗治療后復發(fā)的淋巴瘤患者及利妥昔單抗耐藥患者中均發(fā)現CD20表達降低或丟失[17-22];甚至部分初治患者也觀察到CD20低表達,且與不良預后有關[19],因此認為CD20低表達或缺失可能是導致利妥昔單抗治療失敗的原因。而關于CD20表達下調,有研究認為可能是由HDAC使組蛋白脫乙?;?,也有研究發(fā)現HDAC抑制劑可上調CD20表達,克服不同類型B細胞淋巴瘤患者先天性和獲得性的利妥昔單抗耐藥性,增強利妥昔單抗的細胞毒作用[3-4,21]。此外,去甲基化藥物可恢復CD20 mRNA和蛋白表達,提示表觀遺傳機制有可能是利妥昔單抗治療后CD20下調的基礎。也有研究認為HDAC抑制劑聯(lián)合利妥昔單抗可能具有協(xié)同作用,且與上調B淋巴瘤細胞 CD20表達有關[3,23-24]。以上研究結果提示聯(lián)合應用HDAC抑制劑可能是克服利妥昔單抗耐藥B細胞淋巴瘤的有效策略。本研究采用西達本胺聯(lián)合利妥昔單抗分別處理Jeko-1細胞和耐藥細胞株Jeko-1/R,結果發(fā)現與西達本胺單藥相比,兩者聯(lián)合應用時耐藥Jeko-1/R細胞增殖抑制率明顯提高,且與非耐藥Jeko-1細胞增殖抑制率相當,提示西達本胺能恢復Jeko-1/R細胞對利妥昔單抗的敏感性。進一步觀察西達本胺對耐藥Jeko-1/R細胞CD20 mRNA表達及組蛋白H3、H4乙?;降挠绊懀l(fā)現西達本胺以劑量依賴的方式上調Jeko-1/R細胞CD20 mRNA的表達,說明西達本胺可恢復耐藥細胞對利妥昔單抗的敏感性,達到逆轉耐藥的目的,且可能是通過上調組蛋白H3、H4的乙?;侥孓D耐藥。

    綜上所述,本研究發(fā)現西達本胺可逆轉利妥昔單抗耐藥性,與利妥昔單抗聯(lián)合應用可抑制利妥昔單抗耐藥淋巴瘤細胞增殖,其作用機制可能與西達本胺上調利妥昔單抗耐藥細胞組蛋白H3、H4乙?;接嘘P。兩者聯(lián)合用藥為治療復發(fā)/難治性B細胞淋巴瘤提供了新的思路。

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