基于生物信息學(xué)分析結(jié)直腸癌STIM1高頻突變介導(dǎo)的免疫抵抗模式及其分子機(jī)制

袁浩 鐘華戈 嚴(yán)林海 唐衛(wèi)中

作者單位：530021 南寧 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院結(jié)直腸外科

免疫治療是結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）的治療方案之一［1］。結(jié)直腸癌的共識(shí)分子亞型（CMS）基于腫瘤屬性對(duì)患者進(jìn)行了分類(lèi)，其中CMS1（免疫型）亞型中大多數(shù)患者具有強(qiáng)烈的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，且該部分人群對(duì)免疫治療敏感［2］。但CMS顯示僅有14%的人群屬于免疫型［2］，而這一比例在中國(guó)人群中可能更低。而且與傳統(tǒng)的癌癥治療方法一樣，許多最初基于免疫治療效果良好的患者最終會(huì)耐藥和復(fù)發(fā)。因此，免疫抵抗成為CRC免疫治療中面臨的難題。有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織T細(xì)胞浸潤(rùn)增加是免疫抵抗的重要影響因素之一［3］。腫瘤微環(huán)境中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞浸潤(rùn)的預(yù)后價(jià)值和免疫抑制效能也已被廣泛認(rèn)可［4-6］。因此，如何解決CRC高T細(xì)胞浸潤(rùn)導(dǎo)致的免疫抵抗成為免疫治療的重大挑戰(zhàn)。STIM1蛋白是一個(gè)Ca2+傳感器，可感應(yīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ca2+負(fù)載并控制其儲(chǔ)存損耗。STIM1促進(jìn)Orai蛋白管控Ca2+流入鈣離子儲(chǔ)存庫(kù)（SCOE）已被報(bào)道與免疫細(xì)胞激活、成熟和運(yùn)動(dòng)有關(guān)［7-8］。STIM1過(guò)表達(dá)也與非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌和前列腺癌進(jìn)展及較差的預(yù)后相關(guān)［9-12］。以上研究提示STIM1可能參與免疫抵抗而導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展［13］，但此機(jī)制在CRC中未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在通過(guò)免疫浸潤(rùn)和單細(xì)胞測(cè)序探討STIM1促進(jìn)免疫抵抗的機(jī)制及其作為治療靶點(diǎn)和生物學(xué)標(biāo)志物的潛力。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本

收集2019年1月至2020年1月廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院收治的36例經(jīng)病理學(xué)檢查確診的CRC患者組織和血液樣本。使用Solarbio公司提取試劑盒提取基因組DNA，保存至-80℃冰箱備用。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員批準(zhǔn)，患者知情同意。

1.2 NGS突變檢測(cè)

采用illumina二代測(cè)序平臺(tái)檢測(cè)。將400 ng組織DNA、引物、接頭（adapter）和標(biāo)簽（barcode）、酶和緩沖液配成50 μL PCR體系后進(jìn)行PCR完成建庫(kù)，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量（每個(gè)文庫(kù)600 ng，按比例混合文庫(kù)）后通過(guò)雜交捕獲的方法結(jié)合目標(biāo)區(qū)域探針，雜交好的文庫(kù)進(jìn)行純化、定量（每個(gè)pool為4 nm），按照樣本需求的數(shù)據(jù)量上機(jī)測(cè)序（Nextseq 550），對(duì)樣本的中靶率、均一性、測(cè)序深度等參數(shù)進(jìn)行質(zhì)控判斷，滿足測(cè)序需求的樣本用Variant Caller進(jìn)行突變分析，并與Cosmic等數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，然后用IGV對(duì)結(jié)果進(jìn)行二次查閱。以突變豐度>5%作為STIM1基因檢測(cè)的豐度截?cái)嘀担?4-17］。

1.3 GSEA數(shù)據(jù)庫(kù)分析免疫特征

GSEA 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp）通過(guò)基因集探索分子機(jī)制。利用Explore the Molecular Signatures Database（MSigDB）中的 Search Gene Sets鍵輸入關(guān)鍵詞“STIM1”，選定人屬、免疫特征和所有數(shù)據(jù)來(lái)源進(jìn)行搜索。找到與研究基因最相關(guān)的兩個(gè)集合，然后進(jìn)行分子事件描述，并使用GraphPad Prism繪圖。

1.4 TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)分析免疫浸潤(rùn)

利用 TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//cistro.shinyapps.io/timer/）分析CRC的免疫浸潤(rùn)。使用Diff Exp模塊分析STIM1在癌組織及其鄰近正常組織中的表達(dá)差異；Correlation模塊分析STIM1與RELA、JUN的相關(guān)性；SCNA模塊分析STIM1拷貝數(shù)變異（CNVs）與免疫浸潤(rùn)水平的關(guān)系；Gene模塊分析STIM1與免疫細(xì)胞的相關(guān)性；Survival模塊分析免疫細(xì)胞（B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞）與CRC生存的相關(guān)性（Kaplan-Meier分析）。

1.5 CancerSEA數(shù)據(jù)庫(kù)分析基因功能

CancerSEA 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（http：//biocc.hrbmu.edu.cn/CancerSEA/）是一個(gè)旨在單細(xì)胞水平上全面探索癌細(xì)胞的不同功能狀態(tài)的多功能網(wǎng)站，涉及14個(gè)細(xì)胞功能狀態(tài)。利用Serach頁(yè)面搜索STIM1、RELA和JUN，選擇腫瘤類(lèi)型“CRC”，分析CRC中STIM1、RELA和JUN的功能，并對(duì)CRC單細(xì)胞數(shù)據(jù)集的詳細(xì)信息進(jìn)行挖掘。

1.6 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）的構(gòu)建

使用Cytoscape中的Universal Interaction Database Client鍵入關(guān)鍵詞“STIM1”，選中所有數(shù)據(jù)來(lái)源進(jìn)行基因關(guān)聯(lián)分析。獲得STIM1相關(guān)的PPI網(wǎng)絡(luò)，其結(jié)果經(jīng)篩選得出人屬相關(guān)基因。該簇基因使用Cytoscape內(nèi)置插件Reactome F1進(jìn)行功能聚類(lèi)分析，經(jīng)篩選獲得免疫相關(guān)分類(lèi)的基因并集。然后采用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//string-db.org/）將篩選的基因集進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。

2 結(jié)果

2.1 NGS突變頻譜描述

基于基因突變頻譜分析結(jié)果顯示，CRC患者特異性最高基因?yàn)?1號(hào)染色體上的STIM1，突變頻率為97.2%（35/36）。其中35例STIM1突變患者中introns堿基置換均突變（突變類(lèi)型為c.1138-52A>C），3′UTR堿基置換突變33例（突變類(lèi)型為c.*367G>A）。在GSEA數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索與STIM1相關(guān)的免疫基因集，結(jié)果顯示，基因集GSE360_L_DONOVANI_VS_L_MAJOR_MAC_UP 與目的基因重合的 STIM1、ABCB1、MSH2、YES1、CTNNB1突變占比分別為 97.22%、83.33%、8.33%、2.78%、0（圖 1A），基因集 GSE360_CTRL_VS_L_DONOVANI_MAC_UP與目的基因重合的STIM1、CDA、ESR1、GSTP1、ZFHX3、GNA11 突變占比分別為97.22%、72.22%、44.44%、30.56、2.78%、0（圖 1B）。

圖1 GSEA基因集中重合基因的突變頻率Fig.1 Mutation frequency of overlapping genes in GSEA gene set

2.2 STIM1與免疫浸潤(rùn)的相關(guān)性

基于TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)分析STIM1與免疫浸潤(rùn)程度的相關(guān)性，分別測(cè)定B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞的浸潤(rùn)水平，結(jié)果顯示，STIM1 mRNA在結(jié)腸癌患者中的表達(dá)與CD4+T 細(xì)胞（r=0.554，P<0.001）、巨噬細(xì)胞（r=0.417，P<0.001）、樹(shù)突狀細(xì)胞（r=0.360，P<0.001）、中性粒細(xì)胞（r=0.282，P<0.001）和 B 細(xì)胞（r=0.180，P<0.001）的浸潤(rùn)水平相關(guān)（圖2A）。Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示，CD4+T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)水平越高，患者預(yù)后越差，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖2B）。

圖2 STIM1與免疫浸潤(rùn)及預(yù)后的相關(guān)性Fig.2 Correlation of STIM1 with immune infiltration and prognosis

2.3 基于單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)的CRC中STIM1、RELA和JUN分析

EXP0051是一個(gè)結(jié)直腸癌單細(xì)胞數(shù)據(jù)集，包含CancerSEA中的290個(gè)細(xì)胞，分析STIM1在EXP0051中的功能，結(jié)果顯示，干細(xì)胞特性、轉(zhuǎn)移、分化和侵襲與 STIM1 高度相關(guān)（r=-0.76，-0.61，0.57，-0.66；均P＜0.05）（圖 3A）。

將RELA和JUN納入EXP0051單細(xì)胞數(shù)據(jù)集中分析。在CRC單細(xì)胞中，相關(guān)分析顯示RELA功能與缺氧（r=0.32，P＜0.05）和炎癥（r=0.30，P＜0.05）有關(guān)；JUN功能與靜止（r=0.42，P＜0.05）、炎癥（r=0.41，P＜0.05）、缺氧（r=0.39，P＜0.05）和分化（r=0.31，P＜0.05）有關(guān)（圖3B～C）。

2.4 STIM1與RELA、JUN相互作用在免疫通路中發(fā)揮作用

為進(jìn)一步探索STIM1在CRC中的調(diào)控機(jī)制，對(duì)STIM1進(jìn)行基因關(guān)聯(lián)性分析，在Cytoscape中得到與STIM1相關(guān)的85個(gè)人屬基因。通過(guò)Reactome數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)STIM1相關(guān)的85個(gè)人屬基因進(jìn)行功能聚類(lèi)分析，結(jié)果顯示STIM1與免疫系統(tǒng)高度相關(guān)（適應(yīng)性免疫系統(tǒng)、固有免疫系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)中的細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫反應(yīng)蛋白類(lèi)泛素化修飾）。對(duì)4種免疫功能分類(lèi)取并集后利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示RELA、JUN與STIM1相關(guān)（圖4A），RELA、JUN與 CD4+T 細(xì)胞均呈正相關(guān)（r=0.565，0.319；均 P＜0.05）（圖4B）。

基于TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)STIM1、RELA和JUN進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，RELA、JUN均與STIM1呈正相關(guān)（r=0.579，0.223；均 P＜0.05），RELA 與 JUN 亦呈正相關(guān)（r=0.286，P＜0.05）（圖4C）。以上結(jié)果提示，STIM1可通過(guò)RELA和JUN在免疫系統(tǒng)尤其在炎癥中發(fā)揮作用。

圖3 CRC中STIM1、RELA、JUN與功能狀態(tài)之間的相關(guān)性Fig.3 Correlation between STIM1,RELA,JUN and functional states in CRC

圖4 STIM1與RELA、JUN的相關(guān)性Fig.4 Correlation between STIM1 and RELA,and JUN

3 討論

手術(shù)、放療、化療及分子靶向治療是CRC主要的治療手段。作為一種免疫源性腫瘤，CRC的免疫治療亦逐漸引起關(guān)注。但是免疫治療并不是所有腫瘤、所有患者均適用，如何富集有效人群是面臨的難題，免疫抵抗也成為研究熱點(diǎn)之一。為探討CRC基因突變頻譜及其介導(dǎo)的CRC免疫抵抗，本研究首先采用NGS技術(shù)檢測(cè)CRC患者組織和血液樣本中的基因突變情況，經(jīng)篩選發(fā)現(xiàn)STIM1為高頻突變基因，進(jìn)一步在GSEA數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索與STIM1相關(guān)的免疫基因集也發(fā)現(xiàn)與目的基因重合的STIM1突變頻率較高，說(shuō)明STIM1可能在免疫通路中占據(jù)更多關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，在免疫系統(tǒng)中起重要作用。

有研究發(fā)現(xiàn)STIM1可通過(guò)SOCE介導(dǎo)Ca2+進(jìn)入免疫受體細(xì)胞（包括T細(xì)胞、B細(xì)胞和肥大細(xì)胞），而Ca2+進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是免疫細(xì)胞激活的關(guān)鍵因素［16-17］。為探討STIM1與免疫浸潤(rùn)程度的相關(guān)性，本研究基于TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)STIM1與結(jié)腸癌中的B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)水平均呈正相關(guān)，且CD4+T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)水平越高，提示患者預(yù)后越差，說(shuō)明STIM1可能具有促進(jìn)CRC免疫抵抗的作用。癌癥的免疫反應(yīng)較為復(fù)雜，一般從巨噬細(xì)胞獲得腫瘤細(xì)胞抗原，然后樹(shù)突狀細(xì)胞將該抗原呈遞至CD8+T細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞進(jìn)一步激活CD4+T細(xì)胞并產(chǎn)生記憶細(xì)胞，被激活的CD4+T細(xì)胞最后完成對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷。而這一系列過(guò)程中任何一處微小錯(cuò)誤都將導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的免疫抵抗。腫瘤細(xì)胞分泌趨化因子等細(xì)胞因子吸引免疫細(xì)胞在腫瘤及微環(huán)境浸潤(rùn)，但浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞未能對(duì)腫瘤細(xì)胞造成有效殺傷，主要原因在于腫瘤的低免疫原性、腫瘤抗原封閉、腫瘤細(xì)胞低表達(dá)MHC分子和缺乏共刺激分子，甚至包括腫瘤微環(huán)境的細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能變化等，以上因素均可導(dǎo)致免疫呈遞和CD4+T細(xì)胞識(shí)別過(guò)程受阻。因此，STIM1與CD4+T細(xì)胞浸潤(rùn)具有相關(guān)性，可能是由于STIM1控制CD4+T細(xì)胞的Ca2+流入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，使CD4+T細(xì)胞興奮性和運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，從而導(dǎo)致更多的CD4+T細(xì)胞浸潤(rùn)。

也有研究報(bào)道與STIM1相關(guān)的RELA和JUN可產(chǎn)生炎癥和免疫抑制基質(zhì)從而促進(jìn)癌癥進(jìn)展［18-19］。本研究基于EXP0051單細(xì)胞數(shù)據(jù)集分析發(fā)現(xiàn)RELA與JUN主要通過(guò)缺氧、炎癥、分化和靜止相關(guān)途徑發(fā)揮作用，STIM1、RELA和JUN之間的相關(guān)性以及三者與CD4+T細(xì)胞免疫浸潤(rùn)的顯著相關(guān)表明STIM1可能通過(guò)RELA、JUN和CD4+T細(xì)胞影響CRC預(yù)后。RELA、JUN與STIM1啟動(dòng)子存在時(shí)間依賴性，其共表達(dá)有助于STIM1表達(dá)［18-19］。同時(shí)，RELA和JUN也可以進(jìn)一步誘導(dǎo)炎癥發(fā)生，致使更多的CD4+T細(xì)胞向腫瘤匯集。當(dāng)CD4+T細(xì)胞浸潤(rùn)于腫瘤及其微環(huán)境但并未殺傷腫瘤細(xì)胞時(shí)，CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和分泌的某些細(xì)胞因子將有助于腫瘤進(jìn)展。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞一種亞型，該亞型亦可通過(guò)抑制抗腫瘤免疫細(xì)胞功能促進(jìn)癌癥進(jìn)展。而RELA、JUN和STIM1也可能促進(jìn)CD4+T細(xì)胞該亞型的表達(dá)，從而顯示為總CD4+T細(xì)胞浸潤(rùn)水平升高，而升高的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可抑制其他免疫細(xì)胞活性從而達(dá)到免疫抵抗的目的。

綜上所述，STIM1可促進(jìn)CRC免疫抵抗，STIM1、RELA和JUN兩兩顯著相關(guān)，且與CD4+T細(xì)胞高度相關(guān)，而高CD4+T細(xì)胞浸潤(rùn)水平與較差預(yù)后有關(guān)，STIM1與JUN、RELA共同參與的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能是CRC免疫抵抗發(fā)生的機(jī)制。STIM1可能作為CRC免疫抵抗中的治療靶點(diǎn)和預(yù)后生物標(biāo)志物，STIM1與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)聯(lián)合有望更精確地評(píng)估預(yù)后。