miR-572通過(guò)靶向調(diào)控WWOX影響肺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為

余園園 雷懷定 吳呈霖 趙蘇 王梅芳

作者單位：442000 十堰 1十堰市太和醫(yī)院（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院）呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科；430014 武漢 2武漢市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科

肺癌是世界范圍內(nèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤，確診時(shí)多數(shù)患者分期較晚，病情進(jìn)展迅速，總體預(yù)后較差［1］。但是目前肺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制尚未完全明確［2-4］。miR-572是一種高度保守的微小RNA（miRNAs），已被報(bào)道在卵巢癌［5］、結(jié)直腸癌［6］等中多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，且可促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)。氧化還原酶的WW結(jié)構(gòu)域（WW domain containing oxidoreductase，WWOX）是近年發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的候選抑癌基因，在包括肺癌等多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)其異常表達(dá)，其中在肺癌中上調(diào)其表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［7］。而本課題組前期通過(guò)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)Targetscan預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)WWOX可能是miR-572的靶基因，兩者互為靶向關(guān)系。本研究探討miR-572對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和凋亡的影響及其與WWOX的靶向關(guān)系，以期闡明miR-572在肺癌中的作用及其調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本、細(xì)胞系及主要試劑

收集2016年3月—2018年5月十堰市太和醫(yī)院手術(shù)切除的肺癌組織及其相應(yīng)的癌旁組織各50例，均經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)，患者知情同意。

肺癌細(xì)胞 A549、L9981和正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B均購(gòu)自上?？道噬锟萍加邢薰?。miR-572 inhibitor、miR-572 mimics及相應(yīng)陰性對(duì)照（inhibitor control、mimics control）、WWOX siRNA 及其陰性對(duì)照（siRNA control）均由生工生物工程（上海）股份有限公司構(gòu)建；WWOX野生型載體（WWOX-WT）和WWOX突變型載體（WWOX-MUT）由江蘇百奧邁科生物技術(shù)有限公司合成；miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；第一鏈cDNA合成試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；SYBR定量PCR試劑盒購(gòu)自上海欣百諾生物科技有限公司；WWOX抗體購(gòu)自武漢艾美捷科技有限公司；BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；熒光素酶活性測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó)GeneCopoeia。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

細(xì)胞置于含100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h備用。

按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書操作步 驟 將 miR-572 inhibitor、inhibitor control、miR-572 mimics、mimics control、WWOX siRNA 和 siRNA control分別轉(zhuǎn)染A549和L9981細(xì)胞，分別定義為和AntimiR-572組、Anti-NC組、miR-572組、miR-NC組、si-WWOX組和si-NC組；同時(shí)將miR-572 inhibitor與 WWOX siRNA、miR-572 inhibitor與 siRNA control分別共轉(zhuǎn)染至A549和L9981細(xì)胞，分別定義為和Anti-miR-572+si-WWOX組Anti-miR-572+si-NC組；以未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為正常對(duì)照組（Control組）。各組細(xì)胞培24 h后更換新的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 qRT-PCR法檢測(cè)肺癌組織和細(xì)胞系中miR-572和WWOX mRNA的表達(dá)

用Trizol試劑提取肺癌組織和細(xì)胞系中的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書的方法將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，根據(jù)熒光定量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作步驟進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系：2 mmol/L dNTP mixture 1 μL，Buffer 2.5 μL，Tag 酶 0.2 μL，引物 TGFβ1 KpnIF 0.5 μL，引物 TGFβ1 XhoIR 0.5 μL，ddH2O 19.3 μL，DNA 1 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性 10 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 10 s，共30個(gè)循環(huán)。PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)并合成，其中U6 Forward為5′-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3′，Reverse 為 5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3′；miR-572 Forward 為 5′-GGGCAAAGACATGGAGGAGG3′，Reverse 為 5′-CGCTGGCTTGGCTTCTGACT-3′；GAPDH Forward 為 5′-CGGATTTGGTCGTATTGGG-3′，Reverse 為 5′-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3′；WWOX Forward 為 5′-GACTGGCGTTTACTGTGGATGA-3′，Reverse 為 5′-CAAAAGACTTGGCGGTTTCG-3′。采用 2-△△Ct法，分別以U6、GAPDH為內(nèi)參計(jì)算miR-572 mRNA和WWOX mRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 MTT法檢測(cè)肺癌A549、L9981細(xì)胞的增殖能力

轉(zhuǎn)染48 h后將A549、L9981細(xì)胞分別接種至96孔板，設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h、48 h、72 h、96 h 后，每孔分別加入 10 μL MTT工作液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；加入150 μL的二甲基亞砜溶液，振蕩10 min，在酶標(biāo)儀上測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處的光密度（OD）值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)肺癌A549、L9981細(xì)胞周期

收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞，設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，以0.25%的胰蛋白酶消化后，離心，棄上清液，以預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞2次，75%的乙醇固定18 h，再用預(yù)冷的 PBS洗滌 2次，加入 10 μL RNA 酶、300 μL PI染色液，充分混勻，于室溫、避光孵育30 min后，用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)肺癌A549、L9981細(xì)胞凋亡情況

收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞，設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，以0.25%的胰蛋白酶消化后，離心，棄上清液，以預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞2次，加入結(jié)合緩沖溶液調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×106/mL。取1 mL的細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至EP管中，加入體積為5 μL的PI、Annexin V-FITC溶液，吹打混合，于室溫、避光孵育15 min，再加入400 μL結(jié)合緩沖溶液，混勻后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.7 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-572和WWOX的靶向關(guān)系

采用生物信息學(xué)軟件Targetscan分析miR-572和WWOX的3′UTR端的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。將WWOX-WT和 WWOX-MUT分別與 miR-572 inhibitor、inhibitor control、miR-572 mimics、mimics control共轉(zhuǎn)染至肺癌A549、L9981細(xì)胞中，設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后，采用熒光素酶活性測(cè)定試劑盒測(cè)定細(xì)胞的熒光素酶活性。

1.8 Western blot檢測(cè)肺癌A549、L9981細(xì)胞WWOX蛋白表達(dá)水平

收集培養(yǎng)48 h后的各組細(xì)胞，設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，用含有PMSF的RIPA蛋白裂解試劑提取細(xì)胞總蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白濃度定量，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至NC膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；加入一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜；加入二抗（1∶2 000）室溫孵育2 h，在避光條件下用ECL發(fā)光試劑盒進(jìn)行凝膠成像。采用Image J軟件測(cè)定蛋白條帶的灰度值，以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行目的蛋白相對(duì)定量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0和GraphPad Prism 7.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，肺癌組織和正常癌旁組織中miR-572的表達(dá)水平比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；多組間比較用單因素方差分析，若組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。采用Pearson相關(guān)性分析法分析miR-572與WWOX的關(guān)系。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-572在肺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，肺癌組織中miR-572表達(dá)水平高于癌旁組織（t=43.601，P=0.004），見(jiàn)圖 1A。A549、L9981細(xì)胞中miR-572的表達(dá)水平高于正常肺上皮細(xì)胞 BEAS-2B（F=6.125，P=0.004），見(jiàn)圖 1B。

圖1 qRT-PCR檢測(cè)miR-572在肺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)Fig.1 Expression of miR-572 in lung cancer tissues and cells detected by qRT-PCR

2.2 miR-572對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、周期和凋亡的影響

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-572 inhibitor后，A549、L9981細(xì)胞中miR-572的表達(dá)水平均降低（t=5.247，P＜0.001；t=5.749，P＜0.001）；轉(zhuǎn)染 miR-572 mimics后，A549和L9981細(xì)胞中miR-572的表達(dá)水平均升高（t=5.414，P＜0.001；t=6.116，P＜0.001）。見(jiàn)圖 2。

MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，與Anti-NC組相比，下調(diào)miR-572后A549、L9981細(xì)胞增殖能力降低（t=3.249，P=0.002；t=3.171，P=0.004）；與 miR-NC 組相比，上調(diào)miR-572后A549、L9981細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)（t=4.051，P=0.001；t=4.118，P=0.001），見(jiàn)圖 3A。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，與Anti-NC組相比，下調(diào)miR-572明顯增加 A549、L9981細(xì)胞 G0/G1期比例（t=4.419，P=0.001；t=4.888，P＜0.001）和凋亡率（t=22.112，P＜0.001；t=32.068，P＜0.001）；與miR-NC組相比，上調(diào)miR-572明顯降低肺癌細(xì)胞A549、L9981的G0/G1期比例（t=-4.342，P=0.001；t=-3.931，P=0.002）和凋亡率（t=-13.554，P＜0.001；t=-22.272，P＜0.001）。見(jiàn)圖 3B～C。

2.3 miR-572靶向調(diào)控WWOX

qRT-PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，肺癌組織中WWOX mRNA和蛋白的表達(dá)水平均低于正常癌旁組織（t=7.621，P＜0.001；t=6.457，P＜0.001）；細(xì)胞A549、L9981中WWOX mRNA和蛋白的表達(dá)水平均低于正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B（F=7.584，P=0.020；F=5.661，P=0.005）。見(jiàn)圖 4A～D。

生物信息學(xué)軟件Targetscan分析發(fā)現(xiàn)miR-572和WWOX的3′UTR端存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖4E。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，miR-572和WWOX互為靶向關(guān)系，miR-572能特異結(jié)合WWOX3′UTR并在轉(zhuǎn)錄后水平下調(diào)WWOX基因表達(dá)，見(jiàn)圖4F。

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與Anti-NC組相比，下調(diào)miR-572可上調(diào)A549、L9981細(xì)胞WWOX蛋白表達(dá)水平（t=2.147，P=0.011；t=3.092，P=0.007）；與miR-NC相比，上調(diào)miR-572可下調(diào)A549、L9981細(xì)胞中 WWOX 蛋白表達(dá)水平（t=5.223，P＜0.001；t=4.597，P＜0.001），見(jiàn)圖4G。Pearson相關(guān)分析顯示，肺癌組織中WWOX和miR-572表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.669，P＜0.001），見(jiàn)圖4H。提示miR-572可靶向負(fù)調(diào)控WWOX表達(dá)。

2.4 WWOX逆轉(zhuǎn)miR-572對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、周期和凋亡的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染W(wǎng)WOX siRNA后A549、L9981細(xì)胞中WWOX蛋白水平降低（t=6.334，P＜0.001；t=5.327，P＜0.001），見(jiàn)圖 5。MTT 法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，與si-NC組相比，轉(zhuǎn)染W(wǎng)WOX siRNA后A549、L9981細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)（t=8.125，P＜0.001；t=7.641，P＜0.001），G0/G1 期細(xì)胞比例降低（t=5.967，P＜0.001；t=4.988，P＜0.001），細(xì)胞凋亡率降低（t=7.246，P＜0.001；t=7.144，P＜0.001），見(jiàn)圖 6。與Anti-miR-572+si-NC組相比，共轉(zhuǎn)染W(wǎng)WOX siRNA與miR-572 inhibitor后A549、L9981細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)（F=3.839，P=0.024；F=4.122，P=0.018），G0/G1 期細(xì)胞比例降低（F=4.325，P=0.016；F=4.264，P=0.016），細(xì)胞凋亡率降低（F=6.352，P=0.003；F=5.477，P=0.006），見(jiàn)圖7。

圖2 qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后肺癌A549和L9981細(xì)胞中miR-572的表達(dá)水平Fig.2 Expression of miR-572 in lung cancer A549 and L9981 cells after transfection detected by qRT-PCR

圖3 miR-572對(duì)肺癌A549和L9981細(xì)胞增殖、周期和凋亡影響Fig.3 Effect of miR-572 on proliferation，cycle and apoptosis of lung cancer A549 and L9981 cells

圖4 WWOX在肺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)及其與miR-572的關(guān)系Fig.4 WWOX expression in lung cancer and its correlation with miR-572 expression

圖5 Western blot檢測(cè)WWOX siRNA轉(zhuǎn)染后肺癌A549、L9981細(xì)胞中WWOX蛋白的表達(dá)Fig.5 WWOX protein expression in lung cancer A549 and L9981 cells after WWOX siRNA transfection detected by Western blot

圖6 WWOX對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、周期和凋亡的影響Fig.6 Effects of WWOX on proliferation,cycle and apoptosis of lung cancer cells

3 討論

圖7 WWOX逆轉(zhuǎn)miR-572對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、周期和凋亡的影響Fig.7 Effects of WWOX reversal miR-572 on proliferation,cycle and apoptosis of lung cancer cells

miRNAs是一類小分子非編碼RNA，其異常表達(dá)已被證實(shí)與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［8-10］，在細(xì)胞分化、增殖、凋亡等生物學(xué)進(jìn)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用［11］，有望成為腫瘤治療的理想靶標(biāo)。miR-572作為一種高度保守的miRNA，在人體組織中普遍表達(dá)，也與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)且可能發(fā)揮促癌作用。PAN等［12］研究發(fā)現(xiàn)，miR-572在腎癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，且上調(diào)miR-572后腎癌細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡水平下降。本研究同樣發(fā)現(xiàn)miR-572在肺癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，下調(diào)miR-572后肺癌細(xì)胞增殖能力下降，細(xì)胞G0/G1期比例升高，而細(xì)胞凋亡增多，提示miR-572在肺癌中發(fā)揮促癌作用。

既往研究報(bào)道m(xù)iRNA發(fā)揮作用往往通過(guò)調(diào)控下游靶基因?qū)崿F(xiàn)［13-17］。WWOX定位在16q23.3染色體上，由1個(gè)內(nèi)含子和9個(gè)外顯子組成，在乳腺癌、食管鱗狀細(xì)胞癌及肝細(xì)胞癌等表達(dá)下調(diào)，且發(fā)揮抑癌基因作用［18-21］。DONATI等［22］在肺癌研究中發(fā)現(xiàn)，上調(diào)WWOX表達(dá)可以降低細(xì)胞增殖能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究首先利用生物信息學(xué)軟件Targetscan預(yù)測(cè)miR-572與WWOX的結(jié)合位點(diǎn)，然后通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)證實(shí)miR-572與WWOX的靶向關(guān)系，且相關(guān)性分析顯示兩者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，推測(cè)miR-572可能通過(guò)靶向WWOX影響肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)。進(jìn)一步檢測(cè)WWOX在肺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)及進(jìn)行細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)均呈低表達(dá)，下調(diào)WWOX后細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，細(xì)胞G0/G1期比例降低，細(xì)胞凋亡減少，同時(shí)可逆轉(zhuǎn)下調(diào)miR-572對(duì)肺癌細(xì)胞增殖抑制、周期阻滯和凋亡誘導(dǎo)作用，進(jìn)一步證實(shí)miR-572可能通過(guò)靶向調(diào)控WWOX影響肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡。

綜上所述，miR-572在肺癌中高表達(dá)，下調(diào)其表達(dá)可降低肺癌細(xì)胞增殖能力，阻滯細(xì)胞周期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與靶向調(diào)控WWOX有關(guān)，miR-572可能是肺癌潛在的診斷標(biāo)志物及治療分子靶點(diǎn)。