葵花籽粗油體中內源性蛋白酶系的性質探究以及鑒定

單秀民，彭 姣，陳業(yè)明

(江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122)

近年來有學者在對植物油料種子水相加工過程中發(fā)現(xiàn)了內源性蛋白酶，且發(fā)現(xiàn)這些內源性蛋白酶可以在特定的條件下水解自身的蛋白質，還發(fā)現(xiàn)水解油質蛋白的程度越大，破乳率越高[1-2]。油質蛋白是穩(wěn)定油體結構(脂肪存貯的細胞器)的重要蛋白質[3]。組成油體結構的蛋白質包括油質蛋白、油體鈣蛋白和油體固醇蛋白[4]。趙路蘋[1]在大豆粗油體中發(fā)現(xiàn)一種內源性蛋白酶——半胱氨酸蛋白酶，可以水解油質蛋白。陳雅靜[2]在對花生進行濕法磨漿后離心分離，對獲得的上浮層(即粗油體，富含油脂和少量的蛋白質)進行研究，發(fā)現(xiàn)其中存在一種天冬氨酸蛋白酶，可以在一定條件下水解油體外源性蛋白(不組成油體結構的蛋白質)和油體內源性蛋白，在溫度和酶的共同作用下，使得粗油體破乳率高達94.73%。研究[1,5]報道，葵花籽粗油體在35℃、pH 6.5時14.1～19.2 kDa 油質蛋白會被水解，水浴9 h后17.3～19.2 kDa 油質蛋白水解了34.89%，14.1 kDa油質蛋白水解了29.07%；葵花籽粗油體在70℃和 pH 5下反應 2 h，破乳率可達到 90%以上。這些研究表明植物油料種子中的內源性蛋白酶具有一定的差異和較好的應用前景。

目前，對葵花籽粗油體中內源性蛋白酶的種類及其性質的探究未見報道。因此，本文對葵花籽粗油體中內源性蛋白酶系的性質進行探究及鑒定。通過濕法打漿，對葵花籽漿液進行離心分離，獲得上浮層(即粗油體)和其他部分，其他部分可以進一步加工處理制備蛋白粉。研究葵花籽粗油體中內源性蛋白酶的最適水解pH、水解溫度和蛋白酶的鑒定，為葵花籽粗油體利用內源性蛋白酶破乳提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

葵花籽，購于內蒙古巴彥淖爾；氫氧化鈉、鹽酸，分析純，購于國藥集團；10～250 kDa標準蛋白，購于美國Bio-Rad公司；其他試劑，購于美國Sigma公司。

上海瀘西90型磁力攪拌器，梅特勒臺式pH計，九陽JYL-Y5破壁料理機，日本Himac CR-21GⅡ冷凍離心機，Mini-PROTEAN型垂直電泳儀，ChemiDoc XRS+凝膠成像儀,Q Exactive質譜儀(Thermo Fisher)。

1.2 實驗方法

1.2.1 粗油體的制備

將葵花籽去殼后加5倍的去離子水浸泡，置于4℃放置18 h，然后加入其原始質量9倍的去離子水，使用九陽破壁料理機以18 000 r/min的速度打漿2 min，后用四層紗布過濾將濾渣除去，濾液為葵花籽漿。將葵花籽漿置于冷凍離心機，保持4℃，4 000 r/min離心15 min，收集上浮層。上浮層即為葵花籽粗油體。

1.2.2 粗油體中內源性蛋白酶系作用的最適pH和溫度的探究

將葵花籽粗油體用去離子水稀釋使其蛋白質質量濃度為4 mg/mL,分為9份，分別調節(jié)pH至3、4、5、6、7、8、9、10、11后，置于50℃水浴2 h，取樣進行Tricine-SDS-PAGE分析。

將葵花籽粗油體用去離子水稀釋使其蛋白質質量濃度為4 mg/mL,調節(jié)至作用的最適pH,分為6份，分別置于30、40、50、60、70、80℃水浴2 h，取樣進行Tricine-SDS-PAGE分析。

1.2.3 抑制劑對于粗油體中內源性蛋白酶系的影響

參考Wilson等[6]的方法并作一定修改。向稀釋至4 mg/mL的粗油體中分別添加0、0.5、1 mmol/L AEBSF(絲氨酸蛋白酶抑制劑)，0、2、4 μmol/L Pepstatin-A(天冬氨酸蛋白酶抑制劑)，0、0.25、0.5 mmol/L E-64(半胱氨酸蛋白酶抑制劑)，0、5、10 mmol/L EDTA-2Na(金屬蛋白酶抑制劑)后，調至pH 4，置于50℃進行水浴，在0、2、4 h取樣，進行Tricine-SDS-PAGE分析。

1.2.4 Tricine-SDS-PAGE分析

用去離子水將粗油體稀釋至蛋白質質量濃度為4 mg/mL。取稀釋后的樣品0.5 mL 與0.5 mL Tricine-SDS-PAGE樣品緩沖液(0.25 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 6.8)，1% SDS，2%巰基乙醇和0.02%溴酚藍)混合[7]。置于沸水浴中煮3 min，冷卻后作為還原性Tricine-SDS-PAGE的上樣樣品。根據(jù)Schagger[8]的方法，使用16%的丙烯酰胺分離膠和4%的丙烯酰胺濃縮膠進行。加入10 μL樣品于電泳泳道中，并以30 V、45 mA進行電泳約1 h，直到藍色線(蛋白質被溴酚藍染成藍色)進入分離膠，然后再以100 V、45 mA進行電泳，直至電泳結束。后經過固定，考馬斯亮藍G-520染色，脫色干凈后使用Image Lab 3.0軟件分析條帶強度。

1.2.5 LC-MS/MS分析

將粗油體加入TCA使其質量分數(shù)為15%，靜置4 h后，于8 000 r/min離心20 min，取沉淀進行凍干，取適量的凍干粉加入40 μL 胰蛋白酶緩沖液，37℃ 孵育16～18 h。取水解液過0.22 μm水膜，然后經毛細管高效液相色譜分離后用Q Exactive質譜儀進行質譜分析，用MaxQuant1.5.5.1檢索。

2 結果與討論

2.1 pH對內源性蛋白酶活性的影響(見圖1)

葵花籽粗油體中含有多種油質蛋白，相對分子質量分別是14.1、17.3、18.1、19.2 kDa，油體鈣蛋白相對分子質量分別是25 kDa和28 kDa，油體固醇蛋白相對分子質量是37 kDa[9-10]。葵花籽粗油體中還含有大量外源性蛋白，分別是11S球蛋白和2S清蛋白。11S球蛋白的酸性肽鏈(11S-A)相對分子質量在26～36 kDa，堿性肽鏈(11S-B)相對分子質量在17～24 kDa[11]；2S清蛋白相對分子質量在4～20 kDa[12]。

通過對圖1(a)的電泳圖進行灰度分析得到圖1(b)，發(fā)現(xiàn)在pH 4、50℃下油質蛋白水解速度最快，水浴2 h后相對于空白被水解59%。油質蛋白在pH 3時水解速度較慢，2 h水解不到4%，在pH 5～pH 8，油質蛋白水解相對較快。這說明葵花籽粗油體中的內源性蛋白酶系偏向于中酸性環(huán)境下水解油質蛋白，且水解油質蛋白的最佳pH是4。因為11S球蛋白在所提取的葵花籽粗油體中的占比在80%以上，因此對占比較大的22 kDa(11S-B)球蛋白和35 kDa(11S-A)球蛋白進行分析。發(fā)現(xiàn)22 kDa球蛋白與油質蛋白有著類似的水解規(guī)律，也是在pH 4的水解速度最快，但pH 3時的水解速度較快，當pH大于5時，越往堿性方向偏移，水解速度越慢。而35 kDa球蛋白在pH 4～8水解速度較快，pH 3和pH 9～11均水解較慢。因此，pH 4是粗油體中絕大部分蛋白質的最佳水解pH。

2.2 溫度對內源性蛋白酶活性的影響

將稀釋后的粗油體調pH至4，置于30～80℃水解2 h，取樣進行Tricine-SDS-PAGE分析，結果見圖2。由圖2b可見，在pH 4時，油質蛋白在50℃時水解速度最快，2 h可以水解59%左右。22 kDa球蛋白也在50℃水解程度最大，2 h可以水解28%，35 kDa球蛋白也有著相同的水解規(guī)律。

2.3 抑制劑對于內源性蛋白酶活性的影響(見圖3)

從圖3和添加不同抑制劑后對應實驗的電泳圖以及22 kDa球蛋白與35 kDa球蛋白灰度分析結果(圖略)可知，Pepstatin-A的添加對于油質蛋白、22 kDa和35 kDa球蛋白的水解均有一定的抑制效果，AEBSF對葵花籽粗油體中的蛋白也有微弱的抑制效果，而E-64的添加對粗油體中的蛋白水解并無影響，EDTA-2Na的抑制效果最為明顯，當EDTA-2Na的濃度為5 mmol/L時，4 h后油質蛋白剩余73%左右，22 kDa和35 kDa幾乎不水解，不添加抑制劑水解4 h油質蛋白可以被完全水解，22 kDa被水解43%，35 kDa被水解69%左右，因此表明在pH 4時，金屬蛋白酶能水解葵花籽粗油體中的大部分蛋白質。添加EDTA-2Na抑制劑后，很多條帶濃度均變深，原因有待進一步研究。但抑制劑實驗結果顯示不添加抑制劑水解 4 h油質蛋白可以被完全水解，當Pepstatin -A濃度為4 μmol/L時，4 h 后油質蛋白還能被水解60%；當AEBSF濃度為1 mmol/L時，4 h后油質蛋白還能被水解90%，這表明還有其他酶類對油質蛋白進行水解。綜合4個電泳圖結果可知，在pH 4時，水解葵花籽粗油體中的蛋白質的是金屬蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和絲氨酸蛋白酶。

2.4 內源性蛋白酶系以及蛋白酶抑制劑的鑒定(見表1)

表1 蛋白酶與蛋白酶抑制劑LC/MS-MS鑒定結果

從表1可知，所提取得粗油體中1～9屬于金屬蛋白酶類，有CAAX prenyl protease 1 homolog isoform X 2(金屬肽酶M 48家族)、Amino peptidase M 1(氨肽酶M 1：金屬肽酶M 1家族)、Leucine amino peptidase1-like(亮氨酸氨肽酶：金屬肽酶)、Probable mitochondrial-processing peptidase subunitbeta, mitochondrial、Mitochondrial-processing peptidase subunitalpha-like、Signal peptidase complex catalytic subunit SEC 11 A-like、Mitochondrial-processing peptidase subunitalpha-like、Putative signal peptidase complex subunit 2、Probable mitochondrial-processing peptidase subunitbeta, mitochondrial。說明體系中金屬蛋白酶主要是肽酶，且總的豐度在0.000 098 36。10～13是天冬氨酸蛋白酶類，有Aspartic proteinase Asp 1-like、Aspartyl protease AED3-like、Aspartyl protease family protein 2-like、Protein ASPARTIC PROTEASEIN GUARDCELL 1-like，且總豐度為0.000 296 13。14～15是絲氨酸蛋白酶，有Tripeptidyl-peptidase 2(三肽基肽酶)、Serine carboxy peptidase-like(絲氨酸羧肽酶)，且總豐度為0.000 117 34。沒有檢測到半胱氨酸蛋白酶類，這與抑制劑實驗結果一致。在粗油體體系中天冬氨酸蛋白酶類的豐度大于絲氨酸蛋白酶類，絲氨酸蛋白酶類大于金屬蛋白酶類。但是抑制劑實驗結果顯示金屬蛋白酶類對粗油體中蛋白水解抑制程度最大，這可能是由于表1中序號為16～24等抑制劑存在的原因[13]。16～17是Kunitz抑制劑，其可以抑制絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶與天冬氨酸蛋白酶[14]。18～20是絲氨酸蛋白酶類抑制劑。21～24是半胱氨酸蛋白酶類抑制劑。在粗油體體系中并未鑒定出金屬蛋白酶類抑制劑。抑制絲氨酸蛋白酶類的抑制劑豐度可達到0.000 498 30，抑制天冬氨酸蛋白酶類的抑制劑豐度為0.000 441 23，這些抑制劑使得豐度較高的天冬氨酸蛋白酶和絲氨酸蛋白酶作用弱于金屬蛋白酶。

3 結 論

葵花籽粗油體中存在內源性蛋白酶系，此蛋白酶系在pH 4時油質蛋白和11S球蛋白水解速度最快。油質蛋白在pH 4～8水解速度相對較快，22 kDa球蛋白在pH 3～5水解速度相對較快，35 kDa球蛋白在pH 4～8水解速度相對較快。在pH 4條件下該蛋白酶系的最佳水解溫度是50℃。通過抑制劑添加實驗和LC-MS/MS鑒定發(fā)現(xiàn)粗油體中存在金屬蛋白酶類、天冬氨酸蛋白酶類和絲氨酸蛋白酶類，且天冬氨酸蛋白酶類的豐度大于絲氨酸蛋白酶類，絲氨酸蛋白酶類大于金屬蛋白酶類。